针对sars‑cov‑2的抗体及其用途
技术领域：
：1.本发明涉及免疫学领域和分子病毒学领域，特别是sars‑cov‑2的诊断、预防和治疗领域。具体而言，本发明涉及抗sars‑cov‑2的单克隆抗体，以及包含所述抗体的组合物(例如，诊断剂和治疗剂)。此外，本发明还涉及所述抗体的用途。本发明的抗体可用于诊断、预防和/或治疗sars‑cov‑2感染和/或由所述感染引起的疾病(例如，covid‑19)。
背景技术：
：：2.冠状病毒(coronavirus)感染可导致人类发生呼吸系统疾病，轻症冠状病毒感染可导致流感样症状，重症感染则可发展为严重病毒性肺炎，威胁人类生命健康。冠状病毒可同时感染人类与动物，一些动物源冠状病毒如果突破宿主屏障感染人类，可能在人群中快速扩散并导致严重疾病。3.目前，尚无批准用于预防或治疗sars‑cov‑2感染的特效药物。应对sars‑cov‑2感染引起的肺炎患者仅给予一般的支持性治疗，氧疗措施和抗病毒治疗，如α‑干扰素、洛匹那韦/利托那韦、磷酸氯喹等，这些措施带来的临床效果有限。研究发现，在新冠肺炎的恢复者体内通常伴随着较高水平的sars‑cov‑2中和抗体产生。在国家卫健委发布的新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)中，对病情进展较快、重型和危重型患者推荐进行康复者血浆治疗。有研究数据表明，对确证患有covid‑19并同时伴有严重呼吸窘迫综合征(ards)的危重症患者使用含有中和抗体的康复期血浆治疗后，病人体内的病毒载量迅速降低，患者的临床症状得到有效改善。这些研究表明了体液免疫在sars‑ꢀcov‑2中的重要性，且表明了除了疫苗研发外，应当研制一种能够高效和特异性中和sars‑cov‑2的单克隆抗体，用于covid‑19的短期预防和有效治疗，这对我国乃至全球防治covid‑19具有重要意义。4.sars‑cov‑2是一个含包膜的单链正义rna病毒，基因组与sars‑cov和一些蝙蝠冠状病毒高度同源。sars‑cov‑2至少含有三种膜蛋白，包括表面刺突蛋白(s)、整合膜蛋白(m)和膜蛋白(e)。sars‑cov‑2的受体与sars‑cov一样，均是通过s蛋白上的受体结合结构域(receptorbindingdomain,rbd)与宿主细胞上的血管紧张素转移酶2(ace2)特异性结合后接到了病毒的膜融合和入胞，在病毒感染细胞过程中起着至关重要的作用。因此，通过干扰s蛋白与ace2的结合就能中和病毒的感染。所以，s蛋白尤其是rbd区域是冠状病毒中和抗体的主要来源和识别区域，rbd蛋白是制备sars‑cov‑2中和抗体的理想抗原。5.目前，sars‑cov‑2正在席卷全球，极大的影响了人类社会经济发展，给人民生命安全造成巨大的威胁。因此，发展能够治疗或预防sars‑cov‑2感染的抗体等药物对防控相关疫情具有重要意义。技术实现要素：6.在本技术中，发明人开发了具有优良性质的人源抗体，其能够中和sars‑cov‑2，阻断或抑制sars‑cov‑2与受体ace2的结合，且不易引发人受试者的免疫原性反应。因此，本发明的抗体具有用于预防和/或治疗sars‑cov‑2感染或由sars‑cov‑2感染所导致的疾病的潜力，具有重大的临床价值。7.本发明的抗体8.在第一方面，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，其特异性结合sars‑cov‑2的s蛋白的受体结合区(rbd)，所述抗体或其抗原结合片段包含：9.(a)包含下述3个根据kabat编号系统定义的互补决定区(cdrs)的重链可变区(vh)：10.(i)vhcdr1，其由下述序列组成：seqidno:3，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，11.(ii)vhcdr2，其由下述序列组成：seqidno:4，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和12.(iii)vhcdr3，其由下述序列组成：seqidno:5，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；13.和/或，14.(b)包含下述3个根据kabat编号系统定义的互补决定区(cdrs)的轻链可变区(vl)：15.(iv)vlcdr1，其由下述序列组成：seqidno:6，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，16.(v)vlcdr2，其由下述序列组成：seqidno:7，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和17.(vi)vlcdr3，其由下述序列组成：seqidno:8，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列。18.在某些实施方案中，(i)‑(vi)任一项中所述的置换为保守置换。19.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：如下3个根据kabat编号系统定义的重链cdrs：序列为seqidno：3的vhcdr1，序列为seqidno：4的vhcdr2，序列为seqidno：5的vhcdr3；和/或，如下3个根据kabat编号系统定义的轻链cdrs：序列为seqidno：6的vlcdr1，序列为seqidno：7的vlcdr2，序列为seqidno：8的vlcdr3。20.在某些实施方案中，如上所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：21.(a)如下3个重链cdrs：序列为seqidno：3的vhcdr1，序列为seqidno：4的vhcdr2，序列为seqidno：5的vhcdr3；和/或，如下3个轻链cdrs：序列为seqidno：6的vlcdr1，序列为seqidno：7的vlcdr2，序列为seqidno：8的vlcdr3；22.或，23.(b)如seqidno:1所示的重链可变区(vh)中含有的3个cdr；和/或，如seqidno:2所示的轻链可变区(vl)中含有的3个cdr；优选地，所述vh中含有的3个cdr和/或所述vl中含有的3个cdr由kabat、imgt或chothia编号系统定义。24.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段进一步包含来源于人免疫球蛋白的框架区序列。在某些实施方案中，所述人免疫球蛋选自人重排抗体序列或人胚系抗体序列。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：来源于人重排抗体序列的重链框架区序列，以及来源于人重排抗体序列的轻链框架区序列。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：来源于人重链胚系序列的重链框架区序列，以及来源于人轻链胚系序列的轻链框架区序列。25.在某些实施方案中，如上所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：26.(a)重链可变区(vh)，其包含选自下列的氨基酸序列：27.(i)seqidno：1所示的序列；28.(ii)与seqidno：1所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或29.(iii)与seqidno：1所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；30.和31.(b)轻链可变区(vl)，其包含选自下列的氨基酸序列：32.(iv)seqidno：2所示的序列；33.(v)与seqidno：2所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或34.(vi)与seqidno：2所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。35.在某些实施方案中，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。36.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：包含如seqidno:1所示的序列的vh和包含如seqidno:2所示的序列的vl。37.在第二方面，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，其特异性结合sars‑cov‑2的s蛋白的受体结合区(rbd)，所述抗体或其抗原结合片段包含：38.(a)包含下述3个根据kabat编号系统定义的互补决定区(cdrs)的重链可变区(vh)：39.(i)vhcdr1，其由下述序列组成：seqidno:11，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，40.(ii)vhcdr2，其由下述序列组成：seqidno:12，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和41.(iii)vhcdr3，其由下述序列组成：seqidno:13，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；42.和/或，43.(b)包含下述3个根据kabat编号系统定义的互补决定区(cdrs)的轻链可变区(vl)：44.(iv)vlcdr1，其由下述序列组成：seqidno:14，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，45.(v)vlcdr2，其由下述序列组成：seqidno:15，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和46.(vi)vlcdr3，其由下述序列组成：seqidno:16，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列。47.在某些实施方案中，(i)‑(vi)任一项中所述的置换为保守置换。48.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：如下3个根据kabat编号系统定义的重链cdrs：序列为seqidno：11的vhcdr1，序列为seqidno：12的vhcdr2，序列为seqidno：13的vhcdr3；和/或，如下3个根据kabat编号系统定义的轻链cdrs：序列为seqidno：14的vlcdr1，序列为seqidno：15的vlcdr2，序列为seqidno：16的vlcdr3。49.在某些实施方案中，如上所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：50.(a)如下3个重链cdrs：序列为seqidno：11的vhcdr1，序列为seqidno：12的vhcdr2，序列为seqidno：13的vhcdr3；和/或，如下3个轻链cdrs：序列为seqidno：14的vlcdr1，序列为seqidno：15的vlcdr2，序列为seqidno：16的vlcdr3；51.或，52.(b)如seqidno:9所示的重链可变区(vh)中含有的3个cdr；和/或，如seqidno:10所示的轻链可变区(vl)中含有的3个cdr；优选地，所述vh中含有的3个cdr和/或所述vl中含有的3个cdr由kabat、imgt或chothia编号系统定义。53.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段进一步包含来源于人免疫球蛋白的框架区序列。在某些实施方案中，所述人免疫球蛋选自人重排抗体序列或人胚系抗体序列。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：来源于人重排抗体序列的重链框架区序列，以及来源于人重排抗体序列的轻链框架区序列。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：来源于人重链胚系序列的重链框架区序列，以及来源于人轻链胚系序列的轻链框架区序列。54.在某些实施方案中，如上所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：55.(a)重链可变区(vh)，其包含选自下列的氨基酸序列：56.(i)seqidno：9所示的序列；57.(ii)与seqidno：9所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或58.(iii)与seqidno：9所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；59.和60.(b)轻链可变区(vl)，其包含选自下列的氨基酸序列：61.(iv)seqidno：10所示的序列；62.(v)与seqidno：10所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或63.(vi)与seqidno：10所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。64.在某些实施方案中，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。65.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：包含如seqidno:9所示的序列的vh和包含如seqidno:10所示的序列的vl。66.在第三方面，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，其特异性结合sars‑cov‑2的s蛋白的受体结合区(rbd)，所述抗体或其抗原结合片段包含：67.(a)包含下述3个互补决定区(cdrs)的重链可变区(vh)：68.(i)vhcdr1，其由下述序列组成：seqidno:19，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，69.(ii)vhcdr2，其由下述序列组成：seqidno:20，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和70.(iii)vhcdr3，其由下述序列组成：seqidno:21，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；71.和/或，72.(b)包含下述3个互补决定区(cdrs)的轻链可变区(vl)：73.(iv)vlcdr1，其由下述序列组成：seqidno:22，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，74.(v)vlcdr2，其由下述序列组成：seqidno:23，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和75.(vi)vlcdr3，其由下述序列组成：seqidno:24，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列。76.在某些实施方案中，(i)‑(vi)任一项中所述的置换为保守置换。77.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：如下3个根据kabat编号系统定义的重链cdrs：序列为seqidno：19的vhcdr1，序列为seqidno：20的vhcdr2，序列为seqidno：21的vhcdr3；和/或，如下3个根据kabat编号系统定义的轻链cdrs：序列为seqidno：22的vlcdr1，序列为seqidno：23的vlcdr2，序列为seqidno：24的vlcdr3。78.在某些实施方案中，如上所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：79.(a)如下3个重链cdrs：序列为seqidno：19的vhcdr1，序列为seqidno：20的vhcdr2，序列为seqidno：21的vhcdr3；和/或，如下3个轻链cdrs：序列为seqidno：22的vlcdr1，序列为seqidno：23的vlcdr2，序列为seqidno：24的vlcdr3；80.或，81.(b)如seqidno:17所示的重链可变区(vh)中含有的3个cdr；和/或，如seqidno:18所示的轻链可变区(vl)中含有的3个cdr；优选地，所述vh中含有的3个cdr和/或所述vl中含有的3个cdr由kabat、imgt或chothia编号系统定义。82.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段进一步包含来源于人免疫球蛋白的框架区序列。在某些实施方案中，所述人免疫球蛋选自人重排抗体序列或人胚系抗体序列。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：来源于人重排抗体序列的重链框架区序列，以及来源于人重排抗体序列的轻链框架区序列。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：来源于人重链胚系序列的重链框架区序列，以及来源于人轻链胚系序列的轻链框架区序列。83.在某些实施方案中，如上所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：84.(a)重链可变区(vh)，其包含选自下列的氨基酸序列：85.(i)seqidno：17所示的序列；86.(ii)与seqidno：17所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或87.(iii)与seqidno：17所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；88.和89.(b)轻链可变区(vl)，其包含选自下列的氨基酸序列：90.(iv)seqidno：18所示的序列；91.(v)与seqidno：18所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或92.(vi)与seqidno：18所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。93.在某些实施方案中，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。94.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：包含如seqidno:17所示的序列的vh和包含如seqidno:18所示的序列的vl。95.在第一至第三方面中任一方面的某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段进一步包含来源于人免疫球蛋白的恒定区。96.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的重链包含来源于人免疫球蛋白(例如igg1、igg2、igg3或igg4)的重链恒定区，所述抗体或其抗原结合片段的轻链包含来源于人免疫球蛋白(例如κ或λ)的轻链恒定区。97.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：98.(a)人免疫球蛋白的重链恒定区(ch)或其变体，所述变体与其所源自的野生型序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)；和/或99.(b)人免疫球蛋白的轻链恒定区(cl)或其变体，所述变体与其所源自的野生型序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)。100.在某些实施方案中，所述重链恒定区是igg重链恒定区，例如igg1、igg2、igg3或igg4重链恒定区。101.在某些实施方案中，所述轻链恒定区是κ轻链恒定区。102.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的重链包含：人igg重链恒定区(igg1、igg2、igg3或igg4重链恒定区)或其变体，所述变体与其所源自的野生型序列相比具有一个或多个氨基酸的置换(例如，例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换)，并且，所述变体与其所源自的野生型序列相比具有基本不变的效应子功能(例如，adcc和/或cdc活性)，或者具有改变的效应子功能(例如，增强、降低或消除的adcc活性，和/或，增强、降低或消除的cdc活性)。103.在某些示例性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含如seqidno:25所示的重链恒定区(ch)。104.在某些示例性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含如seqidno:26所示的轻链恒定区(cl)。105.在第一至第三方面中任一方面的某些实施方案中，所述抗原结合片段选自fab、fab’、(fab’)2、fv、二硫键连接的fv、scfv、双抗体(diabody)和单域抗体(sdab)。106.在第一至第三方面中任一方面的某些实施方案中，所述抗体为人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。107.在第一至第三方面中任一方面的某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段具备以下特征中的1项、2项、3项、4项、5项、6项或全部7项：108.(1)特异性结合sars‑cov‑2的s蛋白的rbd；109.(2)以小于约100nm，例如小于约50nm、40nm、30nm、20nm或更低的kd结合sars‑cov‑2的s蛋白的rbd；优选地，所述kd通过表面等离子共振技术(例如biacore)测定；110.(3)以小于约100ng/ml，例如小于约90ng/ml、80ng/ml或更小的ec50结合sars‑cov‑2的s蛋白的rbd；优选地，所述ec50可以通过elisa法测定；111.(4)阻断或抑制sars‑cov‑2对ace2受体的结合，和/或阻断或抑制sars‑cov‑2对细胞的感染；112.(5)不影响或基本上不影响sars‑cov‑1对ace2受体的结合；113.(6)在体外或受试者(例如人)体内中和sars‑cov‑2；114.(7)预防和/或治疗sars‑cov‑2感染或由sars‑cov‑2感染所导致的疾病(例如covid‑19)。115.在本文中，本发明任一方面所述的抗体或其抗原结合片段可以包括这样的变体，所述变体与其所源自的抗体或其抗原结合片段相比差异仅在于一个或多个(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的保守置换)氨基酸残基的保守置换，或者与其所源自的抗体或其抗原结合片段具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，且基本保留了其所源自的抗体或其抗原结合片段的上述生物学功能。116.衍生的抗体117.本发明任一方面所述的抗体或其抗原结合片段可进行衍生化，例如被连接至另一个分子(例如另一个多肽或蛋白)。通常，单克隆抗体或其抗原结合片段的衍生化(例如，标记)不会不利影响其对sars‑ꢀcov‑2的结合。因此，本发明的抗体或其抗原结合片段还意欲包括此类衍生化的形式。例如，可以将本发明的抗体或其抗原结合片段功能性连接(通过化学偶合、基因融合、非共价连接或其它方式)于一个或多个其它分子基团，例如另一个抗体(例如，形成双特异性抗体)，检测试剂，药用试剂，和/或能够介导抗体或抗原结合片段与另一个分子结合的蛋白或多肽(例如，抗生物素蛋白或多组氨酸标签)。此外，本发明的抗体或其抗原结合片段还可以用化学基团进行衍生，例如聚乙二醇(peg)，甲基或乙基，或者糖基。这些基团可用于改善抗体的生物学特性，例如增加血清半衰期。118.在某些实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记，dg44)。128.在另一个方面，提供了制备本发明的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养本发明的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。129.检测方法和试剂盒130.在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。131.在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记。在某些实施方案中，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，所述第二抗体还包括可检测的标记。132.在某些实施方案中，所述试剂盒可以进一步包含用于使相应可检测的标记被检测到的试剂。例如，当所述可检测的标记为酶时，所述试剂盒还可以包含相应酶的显色底物，例如用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺(opd)、四甲基联苯胺(tmb)、abts或鲁米诺类化合物，或用于碱性磷酸酶的对硝基苯磷酸酯(p‑npp)或amppd。例如当所述可检测的标记为化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)时，所述试剂盒还可以包含用于化学发光的预激发液和/或激发液。133.在另一个方面，本发明提供了检测sars‑cov‑2或其s蛋白或s蛋白的rbd在样品中的存在或其水平的方法，其包括使用本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。134.在某些实施方案中，所述检测是免疫学检测，例如酶免疫测定法(例如elisa)、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法或放射免疫测定法。135.在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包括可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)、荧光染料(例如异硫氰酸素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素。136.在某些实施方案中，所述方法还包括，使用携带可检测的标记(例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)、荧光染料(例如异硫氰酸素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素的第二抗体来检测所述单克隆抗体或其抗原结合片段。137.在某些实施方案中，所述方法包括：(1)将所述样品与本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段接触；(2)检测抗原‑抗体免疫复合物的形成或检测所述免疫复合物的量。所述免疫复合物的形成表明存在sars‑ꢀcov‑2或其s蛋白或s蛋白的rbd。138.在某些实施方案中，所述方法可以用于诊断目的，例如可以根据sars‑cov‑2或其s蛋白或s蛋白的rbd在样品中的存在或其水平来诊断受试者是否感染了sars‑cov‑2。在此类实施方案中，所述样品可以为来自受试者(例如哺乳动物，优选人)的血液样品(例如，全血、血浆或血清)、排泄物、口腔或鼻腔分泌物、或肺泡灌洗液。139.在某些实施方案中，所述方法可以用于非诊断目的，例如所述样品并非来自受试者的样品，例如疫苗样品。140.在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。141.在另一个方面，提供了本发明的抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测sars‑cov‑2或其s蛋白或s蛋白的rbd在样品中的存在或其水平，和/或用于诊断受试者是否感染了sars‑cov‑2。142.在某些实施方案中，所述检测是免疫学测定，例如酶免疫测定法(例如elisa)、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法或放射免疫测定法。143.在某些实施方案中，所述试剂盒通过如上所述的检测方法来检测sars‑cov‑2或其s蛋白或s蛋白的rbd在样品中的存在或其水平，以及任选地根据所述检测结果诊断受试者是否感染了sars‑cov‑2。144.在某些实施方案中，所述样品为来自受试者(例如哺乳动物，优选人)的血液样品(例如，全血、血浆或血清)、排泄物、口腔或鼻腔分泌物、或肺泡灌洗液。145.治疗方法和药物组合物146.在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其含有本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。147.在某些实施方案中，所述药物组合物还包含另外的药学活性剂，例如另外的抗病毒剂，如干扰素、洛匹那韦、利托那韦、磷酸氯喹、法匹拉韦、瑞德西韦等。148.在某些实施方案中，在所述药物组合物中，本发明的抗体或其抗原结合片段与所述另外的药学活性剂作为分离的组分或作为单一组合物的组分提供。因此，本发明的抗体或其抗原结合片段与所述另外的药学活性剂可以同时、分开或相继施用。149.在某些示例性实施方案中，所述药学上可接受的载体和/或赋形剂包含无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(wfi)、抑菌性注射用水(bwfi)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)nacl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、ph缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、ringer氏溶液及其任意组合。150.在另一个方面，本发明提供了用于中和sars‑cov‑2的方法，其包括使用本发明的抗体或其抗原结合片段或药物组合物。所述方法可用于在体外或受试者(例如人)体内中和sars‑cov‑2。151.在某些实施方案中，所述方法用于中和样品中sars‑cov‑2的毒力。在某些实施方案中，所述方法包括：将包含sars‑cov‑2的样品与本发明的抗体或其抗原结合片段或药物组合物接触。152.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段单独使用，或与另外的药学活性剂(例如另外的抗病毒剂，如干扰素、洛匹那韦、利托那韦、磷酸氯喹、法匹拉韦、瑞德西韦等)联合使用。153.在另一个方面，本发明提供了用于预防或治疗受试者的sars‑ꢀcov‑2感染或与sars‑cov‑2感染相关的疾病(例如covid‑19)的方法，其包括：给有此需要的受试者施用有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段或药物组合物。154.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段单独使用，或与另外的药学活性剂(例如另外的抗病毒剂，如干扰素、洛匹那韦、利托那韦、磷酸氯喹、法匹拉韦、瑞德西韦等)联合使用。155.在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。156.在另一个方面，本发明涉及本发明的抗体或其抗原结合片段在制备药物中的用途，所述药物用于：157.(1)在体外或受试者(例如人)体内中和sars‑cov‑2；和/或158.(2)用于预防或治疗受试者的sars‑cov‑2感染或与sars‑cov‑2感染相关的疾病(例如covid‑19)。159.在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段单独使用，或与另外的药学活性剂(例如另外的抗病毒剂，如干扰素、洛匹那韦、利托那韦、磷酸氯喹、法匹拉韦、瑞德西韦等)联合使用。160.在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。161.本发明的抗体或其抗原结合片段、或者本发明的药物组合物可以配制成医学领域已知的任何剂型，例如，片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、吸入剂、喷雾剂等。优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。本发明的药物组合物应当是无菌的并在生产和储存条件下稳定。一种优选的剂型是注射剂。此类注射剂可以是无菌注射溶液。例如，可通过下述方法来制备无菌注射溶液：在适当的溶剂中掺入必需剂量的本发明的重组蛋白，以及任选地，同时掺入其他期望的成分(包括但不限于，ph调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，等渗剂、防腐剂、稀释剂，或其任何组合)，随后过滤除菌。此外，可以将无菌注射溶液制备为无菌冻干粉剂(例如，通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。此类无菌冻干粉剂可在使用前分散于合适的载体中，例如注射用水(wfi)、抑菌性注射用水(bwfi)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)nacl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、ph缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、ringer氏溶液及其任意组合。162.本发明的抗体或其抗原结合片段、或药物组合物可以通过本领域已知的任何合适的方法来施用，包括但不限于，口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径。但是，对于许多治疗用途而言，优选的给药途径/方式是胃肠外给药(例如静脉注射或推注，皮下注射，腹膜内注射，肌内注射)。技术人员应理解，给药途径和/或方式将根据预期目的而发生变化。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段、或药物组合物通过静脉注射或推注给予。163.本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明的抗体或其抗原结合片段。“预防有效量”是指，足以预防，阻止，或延迟疾病的发生的量。“治疗有效量”是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。本发明的抗体或其抗原结合片段的治疗有效量可根据如下因素发生变化：待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。164.在本发明中，可调整给药方案以获得最佳目的反应(例如治疗或预防反应)。例如，可以单次给药，可以在一段时间内多次给药，或者可以随治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。165.在本发明中，所述受试者可以为哺乳动物，例如人。166.术语定义167.在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。168.如本文中所使用的，“严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severeacuterespiratorysyndromecoronavirus2，sars‑cov‑2)”，旧称为“新型冠状病毒”或“2019‑ncov”，属于其β冠状病毒属，为含包膜的单链正义rna病毒。sars‑cov‑2的基因组序列是本领域技术人员已知的，可参见例如genbank：mn908947。sars‑cov‑2至少含有三种膜蛋白，包括表面刺突蛋白(s)、整合膜蛋白(m)和膜蛋白(e)。sars‑cov‑2的受体与sars‑cov一样，均是通过s蛋白上的受体结合结构域(receptorbindingdomain,rbd)与宿主细胞上的血管紧张素转移酶2(ace2)特异性结合后接到了病毒的膜融合和入胞，在病毒感染细胞过程中起着至关重要的作用。169.如本文中所使用的，术语“新型冠状病毒肺炎”和“covid‑19”是指，因sars‑cov‑2感染而导致的肺炎，二者具有相同的含义，可互换使用。170.如本文中所使用的，术语“s蛋白”和“spike蛋白”是指，sars‑cov‑2的表面刺突蛋白，其上具有受体结合结构域(rbd)。“s蛋白”和“spike蛋白”二者具有相同的含义，可互换使用。171.如本文中所使用的，术语“抗体”是指，通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(l)链和一条“重”(h)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为igm、igd、igg、iga和ige。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“j”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“d”区。各重链由重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)组成。重链恒定区由3个结构域(ch1、ch2和ch3)组成。各轻链由轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)组成。轻链恒定区由一个结构域cl组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(c1q)的结合。vh和vl区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(cdr))，其间散布有较保守的称为构架区(fr)的区域。各vh和vl由按下列顺序：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4从氨基末端至羧基末端排列的3个cdr和4个fr组成。各重链/轻链对的可变区(vh和vl)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循kabatsequencesofproteinsofimmunologicalinterest(nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1987and1991))，或chothia&lesk(1987)j.mol.biol.196:901‑917；chothia等人(1989)nature342:878‑883的定义。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，igg(例如，igg1，igg2，igg3或igg4亚型)，iga1，iga2，igd，ige或igm抗体。172.如本文中所使用的，术语“互补决定区”或“cdr”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。这些氨基酸残基的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义，例如可按照kabat编号系统(kabatetal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.,1991)、chothia编号系统(chothia&lesk(1987)j.mol.biol.196:901‑917；chothia等人(1989)nature342:878‑883)或imgt编号系统(lefrancetal.,dev.comparat.immunol.27:55‑77,2003)中的定义。对于给定的抗体，本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的cdr。并且，不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(例如，可参见lefrancetal.,dev.comparat.immunol.27:55‑77,2003)。173.在本发明中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的cdr可根据本领域已知的各种编号系统确定。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的cdr优选地通过kabat、chothia或imgt编号系统确定。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的cdr优选地通过kabat编号系统确定。174.在一些情况下，抗体的抗原结合片段是单链抗体(例如,scfv)，其中vl和vh结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子(参见，例如,bird等人,science242:423426(1988)和huston等人,proc.natl.acad.sci.usa85:58795883(1988))。此类scfv分子可具有一般结构：nh2‑vl‑接头‑vh‑cooh或nh2‑vh‑接头‑vl‑ꢀcooh。合适的现有技术接头由重复的ggggs氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(ggggs)4的接头，但也可使用其变体(holliger等人(1993)，proc.natl.acad.sci.usa90:6444‑ꢀ6448)。可用于本发明的其他接头由alfthan等人(1995)，proteineng.8:725‑731，choi等人(2001)，eur.j.immunol.31:94‑106，hu等人(1996)，cancerres.56:3055‑3061，kipriyanov等人(1999)，j.mol.biol.293:41‑56和roovers等人(2001)，cancerimmunol.描述。175.在一些情况下，抗体的抗原结合片段是双抗体，即，双价抗体，其中vh和vl结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如,holligerp.等人,proc.natl.acad.sci.usa90:64446448(1993)，和poljakr.j.等人,structure2:11211123(1994))。176.可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组dna技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体获得抗体的抗原结合片段(例如，上述抗体片段)，并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。177.在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。178.如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片段，也即，除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。179.如本文中所使用的，术语“嵌合抗体(chimericantibody)”是指，这样的抗体，其轻链或/和重链的一部分源自一个抗体(其可以源自某一特定物种或属于某一特定抗体类或亚类)，且轻链或/和重链的另一部分源自另一个抗体(其可以源自相同或不同的物种或属于相同或不同的抗体类或亚类)，但无论如何，其仍保留对目标抗原的结合活性(u.s.p4,816,567tocabillyetal.；morrisonetal.,proc.natl.acad.sci.usa,81:68516855(1984))。例如，术语“嵌合抗体”可包括这样的抗体，其中抗体的重链和轻链可变区来自第一抗体(例如个体人抗体序列)，而抗体的重链和轻链恒定区来自第二抗体(例如人共有胚系抗体序列)。180.为制备嵌合抗体，可使用本领域已知的方法将一个抗体的可变区连接至另一个抗体(例如人免疫球蛋白)的恒定区。例如，将编码vh的dna可操作的连接至编码重链恒定区的另一dna分子以获得全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如kabat,e.a.等人(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,fifthedition,u.s.departmentofhealthandhumanservices,nihpublicationno.91‑3242)，包含这些区的dna片段可以通过标准pcr扩增获得。重链恒定区可以是igg1、igg2、igg3、igg4、iga、ige、igm或igd恒定区，但是通常优选为igg1或igg4恒定区。例如，将编码vl的dna可操作的连接至编码轻链恒定区cl的另一dna分子以获得全长轻链基因(以及fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如kabat，e.a.等人(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，fifthedition，u.s.departmentofhealthandhumanservices，nihpublicationno.91‑3242)，包含这些区的dna片段可以通过标准pcr扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区，但通常优选为κ恒定区。181.如本文中所使用的，术语“人源化抗体”是指，经基因工程改造的非人源抗体，其氨基酸序列经修饰以提高与人源抗体的序列的同源性。通常而言，人源化抗体的全部或部分cdr区来自于非人源抗体(供体抗体)，全部或部分的非cdr区(例如，可变区fr和/或恒定区)来自于人源免疫球蛋白(受体抗体)。人源化抗体通常保留了供体抗体的预期性质，包括但不限于，抗原特异性、亲和性、反应性、提高免疫细胞活性的能力、增强免疫应答的能力等。供体抗体可以是有预期性质(例如，抗原特异性、亲和性、反应性、提高免疫细胞活性的能力和/或增强免疫应答的能力)的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物(例如，食蟹猴)抗体。182.如本文中所使用的，术语“胚系抗体基因(germlineantibodygene)”或“胚系抗体基因片段(germlineantibodygenesegment)”是指，存在于生物体的基因组中的编码免疫球蛋白的序列，其没有经历过能够导致表达特异性免疫球蛋白的遗传学重排及突变的成熟过程。相应地，术语“重排抗体序列”是指，已经历过能够导致表达特异性免疫球蛋白的遗传学重排及突变的成熟过程而产生的特异性抗体的序列。在本发明中，表述“重链胚系基因”是指，编码免疫球蛋白重链的胚系抗体基因或基因片段，其包括v基因(variable)、d基因(diversity)、j基因(joining)和c基因(constant)；类似地，表述“轻链胚系基因”是指，编码免疫球蛋白轻链的胚系抗体基因或基因片段，其包括v基因(variable)、j基因(joining)和c基因(constant)。在本发明中，由所述胚系抗体基因或胚系抗体基因片段所编码的氨基酸序列也称为“胚系序列(germlinesequence)”，由重链胚系基因所编码的氨基酸序列称为重链胚系序列，由轻链胚系基因所编码的氨基酸序列称为轻链胚系序列。胚系抗体基因或胚系抗体基因片段及其相应的胚系序列是本领域技术人员熟知的，并且可从专业数据库(例如，imgt、unswig、ncbi或vbase2)获得或查询。183.如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1来源的人工染色体(pac)；噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如sv40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。184.如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如s2果蝇细胞或sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，cho细胞，cos细胞，nso细胞，hela细胞，bhk细胞，hek293细胞或人细胞等的动物细胞。185.如本文中使用的，术语“特异结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10‑5m，例如小于大约10‑6m、10‑7m、10‑8m、10‑9m或10‑10m或更小的亲和力(kd)结合该抗原。186.如本文中所使用的，术语“kd”是指特定抗体‑抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体‑抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常，抗体以小于大约10‑5m的解离平衡常数(kd)结合抗原。例如，本发明的单克隆抗体3c11、5c6、6g9能够以大约10‑8m(nm水平)的解离平衡常数(kd)结合抗原(例如，新型冠状病毒的s蛋白)。187.如本文中所使用的，术语“中和活性”是指抗体或抗体片段具有与病毒上的抗原蛋白相结合，从而阻止病毒感染细胞和/或病毒子代的成熟和/或病毒子代的释放的功能活性，具有中和活性的抗体或抗体片段可以阻止病毒的扩增，从而抑制或消除病毒的感染。188.如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个dna分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，dna序列ctgact和caggtt共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如align程序(dnastar,inc.)方便地进行的needleman等人(1970)j.mol.biol.48：443‑453的方法来实现。还可使用已整合入align程序(版本2.0)的e.meyers和w.miller(comput.applbiosci.，4:11‑17(1988))的算法，使用pam120权重残基表(weightresiduetable)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入gcg软件包(可在www.gcg.com上获得)的gap程序中的needleman和wunsch(jmoibiol.48:444‑453(1970))算法，使用blossum62矩阵或pam250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gapweight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。189.如本文中所使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和pcr介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，brummell等人，biochem.32:1180‑1187(1993)；kobayashi等人proteineng.12(10):879‑884(1999)；和burks等人proc.natlacad.setusa94:412‑417(1997)，其通过引用并入本文)。190.本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如，immunology‑asynthesis(2ndedition,e.s.golubandd.r.gren,eds.,sinauerassociates,sunderland,mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。在本发明中，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用a或ala表示。191.如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如remington'spharmaceuticalsciences.editedbygennaroar,19thed.pennsylvania:mackpublishingcompany,1995)，并且包括但不限于：ph调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。例如，ph调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如tween‑80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、nacl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2‑苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义，其能够稳定药物中的活性成分的期望活性，包括但不限于谷氨酸钠，明胶，spga，糖类(如山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖)，氨基酸(如谷氨酸，甘氨酸)，蛋白质(如干燥乳清，白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水解物)等。在某些示例性实施方案中，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(wfi)、抑菌性注射用水(bwfi)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)nacl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、ph缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、ringer氏溶液及其任意组合。192.如本文中所使用的，术语“预防”是指，为了阻止或延迟疾病或病症或症状在受试者体内的发生而实施的方法。如本文中所使用的，术语“治疗”是指，为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。为了本发明的目的，有益或所需的临床结果包括但不限于，减轻症状、缩小疾病的范围、稳定(即，不再恶化)疾病的状态，延迟或减缓疾病的发展、改善或减轻疾病的状态、和缓解症状(无论部分或全部)，无论是可检测或是不可检测的。此外，“治疗”还可以指，与期望的存活期相比(如果未接受治疗)，延长存活期。193.如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。194.发明的有益效果195.本技术的单克隆抗体(例如3c11抗体、5c6抗体、6g9抗体)能够以高亲和力与新型冠状病毒s蛋白结合，并且对新型冠状病毒具有很强的中和活性。因此，本技术的单克隆抗体(例如3c11抗体、5c6抗体、6g9抗体)具有诊断、预防和治疗新型冠状病毒感染的临床应用价值。196.下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得可实施。附图说明197.图1显示了单克隆抗体3c11与s2p蛋白的elisa检测结果。198.图2显示了单克隆抗体5c6与s2p蛋白的elisa检测结果。199.图3显示了单克隆抗体6g9与s2p蛋白的elisa检测结果。200.图4显示了上清(3c11‑sup)与rbd蛋白的动力学分析结果。201.图5显示了上清(5c6‑sup)与rbd蛋白的动力学分析结果。202.图6显示了上清(6g9‑sup)与rbd蛋白的动力学分析结果。203.图7显示了单克隆抗体(3c11)与rbd蛋白的动力学分析结果。204.图8显示了单克隆抗体(5c6)与rbd蛋白的动力学分析结果。205.图9显示了单克隆抗体(6g9)与rbd蛋白的动力学分析结果。206.图10显示了单克隆抗体3c11与sars‑cov2vsvpp假病毒的中和活性；其中，ncov‑3c11为单抗，mock为对照。207.图11显示了不同浓度的单克隆抗体3c11与sars‑cov2vsvpp假病毒的中和活性。208.图12显示了不同浓度的单克隆抗体5c6与sars‑cov2vsvpp假病毒的中和活性。209.图13显示了不同浓度的单克隆抗体6g9与sars‑cov2vsvpp假病毒的中和活性。210.图14显示了单克隆抗体3c11对于rbd蛋白和ace2结合的阻断结果。211.序列信息212.本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。213.表1：序列的描述214.215.216.具体实施方式217.现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。218.除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照j.sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及f.m.ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，johnwiley&sons,inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。219.实施例1：单克隆抗体序列的获得220.采集新冠患者的咽拭子进行荧光定量pcr检测，间隔一周再次检测，若两次均为阴性则判定为新冠恢复者。采集新冠恢复者的静脉血10ml，使用含edta的抗凝管保存。221.1.外周血单个核细胞(pbmc)的制备:222.采用密度梯度离心法，在采集的静脉血中按1：1的比例加入1640细胞培养基。吹吸混匀后以与静脉血相同体积的ficoll溶液作为底层溶液，缓慢加入静脉血与培养基的混合溶液置于上层。400g，4℃下分别进行2次40min离心，离心完成后收集ficoll和培养基交界处的悬浮细胞，即为pbmc。800g，4℃下进行10min离心，以与静脉血相同体积的10％dmso冻存液重悬细胞，将细胞1ml每管分装于细胞冻存管中，保存于液氮罐。223.2.抗rbd蛋白的特异性b细胞筛选：224.rbd‑小鼠fc蛋白分别标记fitc荧光和biotin，使用elisa检测标记效果。取冻存于液氮罐的细胞，1500rpm，4℃离心3min吸去上清，保留细胞。使用pbs重悬细胞以洗涤冻存液，以1ml的量分装到ep管中，重复上述离心操作，吸去上清后每管加入100ul如表2所示的染料体系吹吸混匀，置于4℃避光冰浴30min。225.表2.染料体系no:28)上。将抗体重链可变区序列插入ptt5‑h的agei和sali酶切位点之间，抗体轻链可变区序列插入ptt5‑k的agei和bsiwi酶切位点之间。237.表达载体构建完成后，脂质体法瞬时转染hek293t细胞，进行单克隆抗体的表达。转染前12小时，将104细胞接种到96孔细胞培养板中。a管：10μlopti‑mem中加入0.2μgigh质粒和0.2μgigk质粒，b管：10μlopti‑mem中加入0.4μltransfectionreagent(诺唯赞公司2000)。将a、b管分别轻柔混匀，室温静置5min，再将稀释好的质粒(a管)滴加至稀释的转染试剂(b管)中，轻柔混匀，室温孵育10min。将质粒‑转染试剂复合物滴加至细胞中，置于细胞培养箱中培养。48h后，收集细胞上清，3000rpm，4℃下离心5min。取上清，弃去细胞碎片沉淀。抗sars‑cov‑2受体结合区蛋白rbd阳性单克隆抗体通过间接法elisa进行筛选，筛选与rbd具有特异反应性的单克隆抗体。238.4.单抗序列的获得239.经过上述实验，获得了三株特异性反应单克隆抗体，将其命名为3c11、5c6及6g9。经测序，人源单克隆抗体3c11重链可变区氨基酸序列如seqidno:1所示，3c11轻链可变区氨基酸序列如seqidno:2所示；人源单克隆抗体5c6重链可变区氨基酸序列如seqidno:9所示，5c6轻链可变区氨基酸序列如seqidno:10所示；人源单克隆抗体6g9重链可变区氨基酸序列如seqidno:17所示，6g9轻链可变区氨基酸序列如seqidno:18所示。240.进一步，还使用kabat等人描述的方法(kabat等，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第五版，publichealthservice，美国国立卫生研究院，贝塞斯达、马里兰州(1991)，第647‑669页)，确定了3c11、5c6及6g9的cdr序列。其中，3c11的重链cdr1‑3如seqidno:3‑5所示，3c11的轻链cdr1‑3如seqidno:6‑8所示；5c6的重链cdr1‑3如seqidno:11‑13所示，5c6的轻链cdr1‑3如seqidno:14‑16所示；6g9的重链cdr1‑3如seqidno:19‑21所示，6g9的轻链cdr1‑3如seqidno:22‑24所示。241.实施例2：单克隆抗体的制备与纯化242.准备处于对数生长期的悬浮细胞expichotm，将其置于125rpm，37℃，8％co2的细胞摇床进行培养，至密度为6×106/ml，活细胞率>98％。取25ml细胞置于新的细胞培养瓶中，作为一个转染体系。a管：1mlexpichotmexpresssionmedium中包含12.5ugigh质粒和12.5ugigκ质粒，b管：1mlexpichotmexpresssionmedium中包含80ulexpifectaminetmchotransfectionkit中的转染试剂。将a管与b管混合，室温静置2min，2min后将混合液倒入25ml准备好的转染细胞体系中。置于125rpm，37℃，8％co2细胞摇床进行培养18‑22h。每瓶加入expifectaminetmchotransfectionkit中的150ul增强剂以及4ml辅料，置于125rpm，32℃，5％co2的细胞摇床培养8‑15d。培养完成后，4℃，4000rpm离心10min，收集细胞上清。243.用0.22um滤器过滤上述上清。打开akta仪器，先分别用a液(200mm十二水合磷酸氢二钠)和b液(100mm一水柠檬酸)冲洗a管道和b管道，装上proteina柱子。用a液以8ml/min的流速平衡proteina柱子15min以上，待仪器检测的uv值、ph值和电导率稳定后进行下一步。以6‑10ml/min流速上样，随后uv值会上升，该峰为穿透峰，并继续用a液洗柱，同时收集穿透峰样品待检测。待ph值不再变化后用b液以6‑10ml/min流速进液，随后ph值下降，uv值上升，该峰为洗脱峰，抗体主要存在于洗脱峰中。收取洗脱峰样品待检测。用a液平衡柱子，再用20％乙醇充满管道和proteina柱子，取下柱子，4℃保存。将穿透峰和洗脱峰的样品进行纯化，并进行sds–page鉴定(对样品进行沸水煮5min，可以使抗体重链和轻链间的二硫键打开，见《分子克隆实验指南》第二版)。纯化的单克隆抗体用20mmpbs缓冲液透析过夜，并采用紫外分光或者bca测取浓度，分装至1.5ml管中，存放于‑20℃备用。244.实施例3：单抗与s2p蛋白的特异反应性245.参考sars‑cov‑2基因序列(genbank:nc_045512.2)，选取s蛋白的胞外段编码第15‑1213位氨基酸的核苷酸序列，在其c端添加凝血酶折叠序列，t4三聚化原件和his纯化标签。并将编码s蛋白的第682到685位氨基酸的核苷酸序列用“agag”替代，编码第986‑ꢀ987位用氨基酸的核苷酸序列用“pp”替代，将该克隆命名为s‑2p。将其克隆至杆状病毒昆虫表达载体pacgp67b上进行重组杆状病毒制备，利用载体上的信号肽在昆虫细胞中进行分泌表达，利用亲和层析纯化获得s2p蛋白。246.将s2p蛋白用ph9.6的50mmcb缓冲液(nahco3/na2co3缓冲液，终浓度为50mm，ph值为9.6)稀释，终浓度为0.5μg/ml。在96孔酶标板的每孔中加入100μl的包被液，2～8℃包被16～24小时后，再37℃包被2小时。用pbst洗涤液(20mmpb7.4，150mmnacl，0.1％tween20)洗涤1次。然后每孔加入200μl的封闭液(含有20％小牛血清及1％酪蛋白的ph值为7.4的20mmna2hpo4/nah2po4缓冲液溶液)，放入37℃封闭2小时，弃去封闭液。干燥后装入铝箔袋2‑8℃保存备用。247.取实施例1中获得的单克隆抗体3c11、5c6及6g9，以sd‑1溶液从100ug/ml为起始浓度开始5倍梯度稀释，共稀释8个梯度。取已包被s2p的酶标板，每孔加入100μl已稀释的抗体样品，置于37℃温箱反应60分钟。将酶标板用pbst洗液(20mmpb7.4，150mmnacl，0.1％tween20)洗涤5遍，每孔加入100μl辣根过氧化物酶(hrp)标记的羊抗人igg反应液，置于37℃温箱反应30分钟。完成酶标记物反应步骤后，将酶标板用pbst洗液(20mmpb7.4，150mmnacl，0.1％tween20)洗涤5遍，每孔加入50μltmb显色剂(购自北京万泰生物药业股份有限公司)，置于37℃温箱反应15分钟。完成显色反应步骤后，在反应完的酶标板中每孔加入50μl终止液(购自北京万泰生物药业股份有限公司)，并于酶标仪上检测各孔的od450/630值。人源单克隆抗体3c11、5c6及6g9与s2p的反应性判定：根据反应后的读值进行判定。若检测值/本底值大于5，则判定为阳性。248.结果分析：elisa实验结果如图1、2、3所示。检测结果显示，3c11、5c6及6g9与s2p重组蛋白的ec50数值分别为0.07402ug/ml、0.001414ug/ml和0.01124ug/ml，具有良好的结合活性。249.实施例4：单克隆抗体与rbd蛋白的特异结合能力250.使用biacore8k系统对单克隆抗体和抗原进行结合的动力学分析(参照操作手册进行)，所有步骤都在pbs缓冲液下进行。采用该公司配套的proteina芯片捕获1：50稀释的小量表达上清和稀释为25nm的单克隆抗体。检测小量表达上清时将rbd抗原分别稀释为200nm、100nm、50nm、25nm和12.5nm五个梯度，按照下述程序进行：捕获(captue)60s，分析(analyte)60s，解离(dissociation)60s，再生(regeneration)30s。检测单克隆抗体时抗原分别稀释为200nm、175nm、150nm、125nm、100nm五个梯度，按照下述程序进行：捕获(captue)60s，分析(analyte)120s，解离(dissociation)200s，再生(regeneration)60s。采用仪器配套数据采集和分析软件进行亲和力平衡解离常数的计算。251.上清(3c11‑sup、5c6‑sup、6g9‑sup)与rbd蛋白结合的动力学分析如图4、5、6所示，单抗(3c11、5c6、6g9)与rbd蛋白结合的动力学分析如图7、8、9所示。具体计算结果如下所示，小量表达上清(3c11‑sup、5c6‑sup、6g9‑sup)与rbd蛋白的kd值分别为5.42x10‑9、2.82x10‑9和1.12x10‑8，单抗3c11、5c6及6g9与rbd蛋白的kd值分别为1.98x10‑8、1.22x10‑10和4.38x10‑9。252.实施例5：单克隆抗体与sars‑cov‑2vsvpp假病毒的中和活性253.为构建携带sars‑cov‑2spike蛋白(s蛋白)的vsv假病毒，根据人密码子偏好性，对sars‑cov‑2毒株的spike基因(序列来源genbank：mn908947)的序列进行密码子优化，以在人细胞中表达。将sars‑cov‑2的s蛋白的c末端截短18个氨基酸，将此蛋白命名为sars‑cov‑2sde18，并将此蛋白的核苷酸序列克隆到真核表达载体pcag中，将此载体命名为pcag‑ncovsde18。将载体pcag‑ꢀncovsde18转染到vero‑e6细胞中，以表达sars‑cov‑2sde18蛋白。转染48小时后，将vsvdg‑egfp‑g(获自addgene，31842)病毒接种到上述细胞中，孵育1小时。然后去除上清液中的vsvdg‑ꢀegfp‑g病毒，并加入抗vsv‑g大鼠血清以阻断残留的vsvdg‑ꢀegfp‑g的感染。获得的子代病毒为携带sars‑cov‑2sde18蛋白的vsv假病毒，将假病毒命名为sars‑cov‑2vsvpp。vsvdg‑egfp‑ꢀg感染24小时后，收集细胞上清，然后离心并过滤(孔径为0.45‑μm，millipore，slhp033rb)以去除细胞碎片，‑80℃下保存备用。254.通过piggybac转座子系统在bhk21细胞中整合hace2的基因。将含有hace2基因的转座子载体(sbisystembiosciences，pb514b‑ꢀ2)和转座酶质粒共转染到bhk21细胞中，通过嘌呤霉素抗性和红色荧光进行筛选，获得稳定表达hace2的细胞bhk21‑hace2。将抗体3c11、5c6及6g9稀释到2ug/ml作为梯度1，3倍向下梯度稀释，共6个梯度，将梯度稀释的抗体与稀释的sars‑cov‑2vsvpp假病毒(moi＝0.05)混合，并在37℃孵育1h(所有样品和病毒均用10％fbs‑dmem稀释)。将上述80μl混合物加入预先铺板的bhk21‑ꢀhace2细胞中。孵育12小时后，采用基于转盘共聚焦的高内涵成像系统(operaphenix或operettacls，购自perkinelmer公司)对感染后的细胞进行荧光成像。完成后采用columbus图像管理分析软件对所获荧光图像进行定量分析检测绿色荧光阳性细胞数量。计算出与未处理的对照孔相比，抗体处理组的gfp阳性细胞数量减少的百分比，计算抑制率。255.结果如图10‑13所示，与对照相比，单抗3c11、5c6及6g9具有显著的中和活性，尤其在浓度为0.22μg/ml的条件下仍能阻断80％的假病毒感染。其半抑制浓度(ic50)分别为62.87ng/ml、4.064ng/ml和0.5602ng/ml。256.实施例6：单克隆抗体交叉阻断能力分析257.参考sars‑cov2‑2全基因序列(mn908947.3)，将编码rbd蛋白核苷酸序列按人类偏好的密码子进行优化，获得其优化的核苷酸序列。在密码子优化的rbd核苷酸序列的n端连接上编码信号肽的核苷酸序列，c端连接上编码绿色荧光蛋白mgamillus(简称mgam)的核苷酸序列，将此核苷酸序列的c端连接上便于亲和层析纯化的多聚组氨酸多肽(6×his或8×his)，最终获得融合荧光蛋白探针的rbd，简称为sars‑cov2‑rbg。将编码sars‑cov2‑rbg的核苷酸序列连接到真核表达载体中，把构建好的重组载体转染至expicho细胞(购自thermofisher公司)中进行表达纯化。258.参考genebank上已经公布的病毒基因组序列sars‑cov‑1(aap13567.1)，将其rbd序列参考上述sars‑cov2‑rbg的方法构建rbd与mgamillus的融合荧光蛋白探针，简称为sars‑cov1‑ꢀrbg。将sars‑cov1‑rbg的编码序列连接到真核表达载体中，把构建好的重组质粒转染至expicho细胞(购自thermofisher公司)中进行表达纯化。259.在ace2基因(nm_021804.1)的c端融合编码表达红色荧光蛋白mruby3(中间以柔性氨基酸linker连接)的核苷酸序列，获得的序列简称为hace2mrb3，将该序列克隆至本室构建的piggybac(pb)转座子载体mihip‑cmvmie载体，获得mihip‑cmvmie‑ꢀhace2mrb3载体，该载体可在细胞内表达hace2mrb3蛋白。使用lipofectamine3000转染试剂(购自thermofisher公司)将mihip‑ꢀcmvmie‑hace2mrb3载体与superpiggybactransposase表达质粒(购自systembiosciences公司)共同转染至293t细胞中(按照质量比4：1)，转染4小时后换液，继续培养24小时后将细胞传代至10cm细胞培养皿，并更换为含有2μg/ml嘌呤霉素(购自invivogen公司)加压筛选，每24小时更换含杀伤抗性培养液。含嘌呤霉素培养液6‑7天后，存活的细胞经过显微镜观察确认为mruby3红色荧光蛋白阳性，表明成功整合。将稳转的细胞株命名为293t‑ace2irb3。260.将293t‑ace2irb3细胞按照15000细胞/孔的密度铺板至黑色玻璃底，培养12‑24小时，待其贴壁备用。将sars‑cov2‑rbg探针稀释至合适浓度(20‑30nm)，与不同稀释倍数的抗体稀释液混合，使抗体终浓度以50nm为梯度1，2倍梯度稀释，共10个梯度。移去原细胞培养板中的50μl培养基，将制备好的混合液，50μl加入细胞培养板中，37℃孵育60分钟。不经洗涤直接使用operaphenix共聚焦型高内涵系统进行成像分析，成像荧光通道包括ex488/em510(绿色荧光蛋白检测通道，探针信号)、ex561/em592(红色荧光蛋白检测通道，ace2)、ex641/em670(近红外荧光蛋irfp670成像通道，细胞核)，使用20倍或者40倍水浸镜头至少拍摄25个视野(共聚焦模式)。完成后将数据上传至columbus图像管理分析软件，并使用该软件进行定量图像分析。分析参数包括：细胞核irfp670阳性细胞数(n，要求>1000个)、细胞膜红色荧光(ace2‑mruby3，用于质细胞孔间差异)信号强度(均值)、细胞质绿色荧光信号强度(均值、sd，反映被细胞结合并摄入的蛋白探针的量)。261.实验结果如图14所示，单克隆抗体3c11可阻断sars‑cov‑2受体结合区rbd蛋白对ace2受体的结合，未能阻断sars‑cov‑1受体结合区rbd蛋白对ace2受体的结合。262.尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。当前第1页12当前第1页12
技术领域：
：1.本发明涉及免疫学领域和分子病毒学领域，特别是sars‑cov‑2的诊断、预防和治疗领域。具体而言，本发明涉及抗sars‑cov‑2的单克隆抗体，以及包含所述抗体的组合物(例如，诊断剂和治疗剂)。此外，本发明还涉及所述抗体的用途。本发明的抗体可用于诊断、预防和/或治疗sars‑cov‑2感染和/或由所述感染引起的疾病(例如，covid‑19)。
背景技术：
：：2.冠状病毒(coronavirus)感染可导致人类发生呼吸系统疾病，轻症冠状病毒感染可导致流感样症状，重症感染则可发展为严重病毒性肺炎，威胁人类生命健康。冠状病毒可同时感染人类与动物，一些动物源冠状病毒如果突破宿主屏障感染人类，可能在人群中快速扩散并导致严重疾病。3.目前，尚无批准用于预防或治疗sars‑cov‑2感染的特效药物。应对sars‑cov‑2感染引起的肺炎患者仅给予一般的支持性治疗，氧疗措施和抗病毒治疗，如α‑干扰素、洛匹那韦/利托那韦、磷酸氯喹等，这些措施带来的临床效果有限。研究发现，在新冠肺炎的恢复者体内通常伴随着较高水平的sars‑cov‑2中和抗体产生。在国家卫健委发布的新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)中，对病情进展较快、重型和危重型患者推荐进行康复者血浆治疗。有研究数据表明，对确证患有covid‑19并同时伴有严重呼吸窘迫综合征(ards)的危重症患者使用含有中和抗体的康复期血浆治疗后，病人体内的病毒载量迅速降低，患者的临床症状得到有效改善。这些研究表明了体液免疫在sars‑ꢀcov‑2中的重要性，且表明了除了疫苗研发外，应当研制一种能够高效和特异性中和sars‑cov‑2的单克隆抗体，用于covid‑19的短期预防和有效治疗，这对我国乃至全球防治covid‑19具有重要意义。4.sars‑cov‑2是一个含包膜的单链正义rna病毒，基因组与sars‑cov和一些蝙蝠冠状病毒高度同源。sars‑cov‑2至少含有三种膜蛋白，包括表面刺突蛋白(s)、整合膜蛋白(m)和膜蛋白(e)。sars‑cov‑2的受体与sars‑cov一样，均是通过s蛋白上的受体结合结构域(receptorbindingdomain,rbd)与宿主细胞上的血管紧张素转移酶2(ace2)特异性结合后接到了病毒的膜融合和入胞，在病毒感染细胞过程中起着至关重要的作用。因此，通过干扰s蛋白与ace2的结合就能中和病毒的感染。所以，s蛋白尤其是rbd区域是冠状病毒中和抗体的主要来源和识别区域，rbd蛋白是制备sars‑cov‑2中和抗体的理想抗原。5.目前，sars‑cov‑2正在席卷全球，极大的影响了人类社会经济发展，给人民生命安全造成巨大的威胁。因此，发展能够治疗或预防sars‑cov‑2感染的抗体等药物对防控相关疫情具有重要意义。技术实现要素：6.在本技术中，发明人开发了具有优良性质的人源抗体，其能够中和sars‑cov‑2，阻断或抑制sars‑cov‑2与受体ace2的结合，且不易引发人受试者的免疫原性反应。因此，本发明的抗体具有用于预防和/或治疗sars‑cov‑2感染或由sars‑cov‑2感染所导致的疾病的潜力，具有重大的临床价值。7.本发明的抗体8.在第一方面，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，其特异性结合sars‑cov‑2的s蛋白的受体结合区(rbd)，所述抗体或其抗原结合片段包含：9.(a)包含下述3个根据kabat编号系统定义的互补决定区(cdrs)的重链可变区(vh)：10.(i)vhcdr1，其由下述序列组成：seqidno:3，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，11.(ii)vhcdr2，其由下述序列组成：seqidno:4，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和12.(iii)vhcdr3，其由下述序列组成：seqidno:5，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；13.和/或，14.(b)包含下述3个根据kabat编号系统定义的互补决定区(cdrs)的轻链可变区(vl)：15.(iv)vlcdr1，其由下述序列组成：seqidno:6，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，16.(v)vlcdr2，其由下述序列组成：seqidno:7，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和17.(vi)vlcdr3，其由下述序列组成：seqidno:8，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列。18.在某些实施方案中，(i)‑(vi)任一项中所述的置换为保守置换。19.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：如下3个根据kabat编号系统定义的重链cdrs：序列为seqidno：3的vhcdr1，序列为seqidno：4的vhcdr2，序列为seqidno：5的vhcdr3；和/或，如下3个根据kabat编号系统定义的轻链cdrs：序列为seqidno：6的vlcdr1，序列为seqidno：7的vlcdr2，序列为seqidno：8的vlcdr3。20.在某些实施方案中，如上所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：21.(a)如下3个重链cdrs：序列为seqidno：3的vhcdr1，序列为seqidno：4的vhcdr2，序列为seqidno：5的vhcdr3；和/或，如下3个轻链cdrs：序列为seqidno：6的vlcdr1，序列为seqidno：7的vlcdr2，序列为seqidno：8的vlcdr3；22.或，23.(b)如seqidno:1所示的重链可变区(vh)中含有的3个cdr；和/或，如seqidno:2所示的轻链可变区(vl)中含有的3个cdr；优选地，所述vh中含有的3个cdr和/或所述vl中含有的3个cdr由kabat、imgt或chothia编号系统定义。24.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段进一步包含来源于人免疫球蛋白的框架区序列。在某些实施方案中，所述人免疫球蛋选自人重排抗体序列或人胚系抗体序列。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：来源于人重排抗体序列的重链框架区序列，以及来源于人重排抗体序列的轻链框架区序列。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：来源于人重链胚系序列的重链框架区序列，以及来源于人轻链胚系序列的轻链框架区序列。25.在某些实施方案中，如上所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：26.(a)重链可变区(vh)，其包含选自下列的氨基酸序列：27.(i)seqidno：1所示的序列；28.(ii)与seqidno：1所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或29.(iii)与seqidno：1所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；30.和31.(b)轻链可变区(vl)，其包含选自下列的氨基酸序列：32.(iv)seqidno：2所示的序列；33.(v)与seqidno：2所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或34.(vi)与seqidno：2所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。35.在某些实施方案中，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。36.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：包含如seqidno:1所示的序列的vh和包含如seqidno:2所示的序列的vl。37.在第二方面，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，其特异性结合sars‑cov‑2的s蛋白的受体结合区(rbd)，所述抗体或其抗原结合片段包含：38.(a)包含下述3个根据kabat编号系统定义的互补决定区(cdrs)的重链可变区(vh)：39.(i)vhcdr1，其由下述序列组成：seqidno:11，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，40.(ii)vhcdr2，其由下述序列组成：seqidno:12，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和41.(iii)vhcdr3，其由下述序列组成：seqidno:13，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；42.和/或，43.(b)包含下述3个根据kabat编号系统定义的互补决定区(cdrs)的轻链可变区(vl)：44.(iv)vlcdr1，其由下述序列组成：seqidno:14，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，45.(v)vlcdr2，其由下述序列组成：seqidno:15，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和46.(vi)vlcdr3，其由下述序列组成：seqidno:16，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列。47.在某些实施方案中，(i)‑(vi)任一项中所述的置换为保守置换。48.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：如下3个根据kabat编号系统定义的重链cdrs：序列为seqidno：11的vhcdr1，序列为seqidno：12的vhcdr2，序列为seqidno：13的vhcdr3；和/或，如下3个根据kabat编号系统定义的轻链cdrs：序列为seqidno：14的vlcdr1，序列为seqidno：15的vlcdr2，序列为seqidno：16的vlcdr3。49.在某些实施方案中，如上所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：50.(a)如下3个重链cdrs：序列为seqidno：11的vhcdr1，序列为seqidno：12的vhcdr2，序列为seqidno：13的vhcdr3；和/或，如下3个轻链cdrs：序列为seqidno：14的vlcdr1，序列为seqidno：15的vlcdr2，序列为seqidno：16的vlcdr3；51.或，52.(b)如seqidno:9所示的重链可变区(vh)中含有的3个cdr；和/或，如seqidno:10所示的轻链可变区(vl)中含有的3个cdr；优选地，所述vh中含有的3个cdr和/或所述vl中含有的3个cdr由kabat、imgt或chothia编号系统定义。53.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段进一步包含来源于人免疫球蛋白的框架区序列。在某些实施方案中，所述人免疫球蛋选自人重排抗体序列或人胚系抗体序列。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：来源于人重排抗体序列的重链框架区序列，以及来源于人重排抗体序列的轻链框架区序列。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：来源于人重链胚系序列的重链框架区序列，以及来源于人轻链胚系序列的轻链框架区序列。54.在某些实施方案中，如上所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：55.(a)重链可变区(vh)，其包含选自下列的氨基酸序列：56.(i)seqidno：9所示的序列；57.(ii)与seqidno：9所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或58.(iii)与seqidno：9所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；59.和60.(b)轻链可变区(vl)，其包含选自下列的氨基酸序列：61.(iv)seqidno：10所示的序列；62.(v)与seqidno：10所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或63.(vi)与seqidno：10所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。64.在某些实施方案中，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。65.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：包含如seqidno:9所示的序列的vh和包含如seqidno:10所示的序列的vl。66.在第三方面，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，其特异性结合sars‑cov‑2的s蛋白的受体结合区(rbd)，所述抗体或其抗原结合片段包含：67.(a)包含下述3个互补决定区(cdrs)的重链可变区(vh)：68.(i)vhcdr1，其由下述序列组成：seqidno:19，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，69.(ii)vhcdr2，其由下述序列组成：seqidno:20，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和70.(iii)vhcdr3，其由下述序列组成：seqidno:21，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；71.和/或，72.(b)包含下述3个互补决定区(cdrs)的轻链可变区(vl)：73.(iv)vlcdr1，其由下述序列组成：seqidno:22，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，74.(v)vlcdr2，其由下述序列组成：seqidno:23，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和75.(vi)vlcdr3，其由下述序列组成：seqidno:24，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列。76.在某些实施方案中，(i)‑(vi)任一项中所述的置换为保守置换。77.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：如下3个根据kabat编号系统定义的重链cdrs：序列为seqidno：19的vhcdr1，序列为seqidno：20的vhcdr2，序列为seqidno：21的vhcdr3；和/或，如下3个根据kabat编号系统定义的轻链cdrs：序列为seqidno：22的vlcdr1，序列为seqidno：23的vlcdr2，序列为seqidno：24的vlcdr3。78.在某些实施方案中，如上所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：79.(a)如下3个重链cdrs：序列为seqidno：19的vhcdr1，序列为seqidno：20的vhcdr2，序列为seqidno：21的vhcdr3；和/或，如下3个轻链cdrs：序列为seqidno：22的vlcdr1，序列为seqidno：23的vlcdr2，序列为seqidno：24的vlcdr3；80.或，81.(b)如seqidno:17所示的重链可变区(vh)中含有的3个cdr；和/或，如seqidno:18所示的轻链可变区(vl)中含有的3个cdr；优选地，所述vh中含有的3个cdr和/或所述vl中含有的3个cdr由kabat、imgt或chothia编号系统定义。82.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段进一步包含来源于人免疫球蛋白的框架区序列。在某些实施方案中，所述人免疫球蛋选自人重排抗体序列或人胚系抗体序列。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：来源于人重排抗体序列的重链框架区序列，以及来源于人重排抗体序列的轻链框架区序列。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：来源于人重链胚系序列的重链框架区序列，以及来源于人轻链胚系序列的轻链框架区序列。83.在某些实施方案中，如上所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：84.(a)重链可变区(vh)，其包含选自下列的氨基酸序列：85.(i)seqidno：17所示的序列；86.(ii)与seqidno：17所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或87.(iii)与seqidno：17所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；88.和89.(b)轻链可变区(vl)，其包含选自下列的氨基酸序列：90.(iv)seqidno：18所示的序列；91.(v)与seqidno：18所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或92.(vi)与seqidno：18所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。93.在某些实施方案中，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。94.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：包含如seqidno:17所示的序列的vh和包含如seqidno:18所示的序列的vl。95.在第一至第三方面中任一方面的某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段进一步包含来源于人免疫球蛋白的恒定区。96.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的重链包含来源于人免疫球蛋白(例如igg1、igg2、igg3或igg4)的重链恒定区，所述抗体或其抗原结合片段的轻链包含来源于人免疫球蛋白(例如κ或λ)的轻链恒定区。97.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：98.(a)人免疫球蛋白的重链恒定区(ch)或其变体，所述变体与其所源自的野生型序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)；和/或99.(b)人免疫球蛋白的轻链恒定区(cl)或其变体，所述变体与其所源自的野生型序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)。100.在某些实施方案中，所述重链恒定区是igg重链恒定区，例如igg1、igg2、igg3或igg4重链恒定区。101.在某些实施方案中，所述轻链恒定区是κ轻链恒定区。102.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的重链包含：人igg重链恒定区(igg1、igg2、igg3或igg4重链恒定区)或其变体，所述变体与其所源自的野生型序列相比具有一个或多个氨基酸的置换(例如，例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换)，并且，所述变体与其所源自的野生型序列相比具有基本不变的效应子功能(例如，adcc和/或cdc活性)，或者具有改变的效应子功能(例如，增强、降低或消除的adcc活性，和/或，增强、降低或消除的cdc活性)。103.在某些示例性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含如seqidno:25所示的重链恒定区(ch)。104.在某些示例性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含如seqidno:26所示的轻链恒定区(cl)。105.在第一至第三方面中任一方面的某些实施方案中，所述抗原结合片段选自fab、fab’、(fab’)2、fv、二硫键连接的fv、scfv、双抗体(diabody)和单域抗体(sdab)。106.在第一至第三方面中任一方面的某些实施方案中，所述抗体为人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。107.在第一至第三方面中任一方面的某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段具备以下特征中的1项、2项、3项、4项、5项、6项或全部7项：108.(1)特异性结合sars‑cov‑2的s蛋白的rbd；109.(2)以小于约100nm，例如小于约50nm、40nm、30nm、20nm或更低的kd结合sars‑cov‑2的s蛋白的rbd；优选地，所述kd通过表面等离子共振技术(例如biacore)测定；110.(3)以小于约100ng/ml，例如小于约90ng/ml、80ng/ml或更小的ec50结合sars‑cov‑2的s蛋白的rbd；优选地，所述ec50可以通过elisa法测定；111.(4)阻断或抑制sars‑cov‑2对ace2受体的结合，和/或阻断或抑制sars‑cov‑2对细胞的感染；112.(5)不影响或基本上不影响sars‑cov‑1对ace2受体的结合；113.(6)在体外或受试者(例如人)体内中和sars‑cov‑2；114.(7)预防和/或治疗sars‑cov‑2感染或由sars‑cov‑2感染所导致的疾病(例如covid‑19)。115.在本文中，本发明任一方面所述的抗体或其抗原结合片段可以包括这样的变体，所述变体与其所源自的抗体或其抗原结合片段相比差异仅在于一个或多个(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的保守置换)氨基酸残基的保守置换，或者与其所源自的抗体或其抗原结合片段具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，且基本保留了其所源自的抗体或其抗原结合片段的上述生物学功能。116.衍生的抗体117.本发明任一方面所述的抗体或其抗原结合片段可进行衍生化，例如被连接至另一个分子(例如另一个多肽或蛋白)。通常，单克隆抗体或其抗原结合片段的衍生化(例如，标记)不会不利影响其对sars‑ꢀcov‑2的结合。因此，本发明的抗体或其抗原结合片段还意欲包括此类衍生化的形式。例如，可以将本发明的抗体或其抗原结合片段功能性连接(通过化学偶合、基因融合、非共价连接或其它方式)于一个或多个其它分子基团，例如另一个抗体(例如，形成双特异性抗体)，检测试剂，药用试剂，和/或能够介导抗体或抗原结合片段与另一个分子结合的蛋白或多肽(例如，抗生物素蛋白或多组氨酸标签)。此外，本发明的抗体或其抗原结合片段还可以用化学基团进行衍生，例如聚乙二醇(peg)，甲基或乙基，或者糖基。这些基团可用于改善抗体的生物学特性，例如增加血清半衰期。118.在某些实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记，dg44)。128.在另一个方面，提供了制备本发明的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养本发明的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。129.检测方法和试剂盒130.在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。131.在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记。在某些实施方案中，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，所述第二抗体还包括可检测的标记。132.在某些实施方案中，所述试剂盒可以进一步包含用于使相应可检测的标记被检测到的试剂。例如，当所述可检测的标记为酶时，所述试剂盒还可以包含相应酶的显色底物，例如用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺(opd)、四甲基联苯胺(tmb)、abts或鲁米诺类化合物，或用于碱性磷酸酶的对硝基苯磷酸酯(p‑npp)或amppd。例如当所述可检测的标记为化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)时，所述试剂盒还可以包含用于化学发光的预激发液和/或激发液。133.在另一个方面，本发明提供了检测sars‑cov‑2或其s蛋白或s蛋白的rbd在样品中的存在或其水平的方法，其包括使用本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。134.在某些实施方案中，所述检测是免疫学检测，例如酶免疫测定法(例如elisa)、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法或放射免疫测定法。135.在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包括可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)、荧光染料(例如异硫氰酸素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素。136.在某些实施方案中，所述方法还包括，使用携带可检测的标记(例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)、荧光染料(例如异硫氰酸素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素的第二抗体来检测所述单克隆抗体或其抗原结合片段。137.在某些实施方案中，所述方法包括：(1)将所述样品与本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段接触；(2)检测抗原‑抗体免疫复合物的形成或检测所述免疫复合物的量。所述免疫复合物的形成表明存在sars‑ꢀcov‑2或其s蛋白或s蛋白的rbd。138.在某些实施方案中，所述方法可以用于诊断目的，例如可以根据sars‑cov‑2或其s蛋白或s蛋白的rbd在样品中的存在或其水平来诊断受试者是否感染了sars‑cov‑2。在此类实施方案中，所述样品可以为来自受试者(例如哺乳动物，优选人)的血液样品(例如，全血、血浆或血清)、排泄物、口腔或鼻腔分泌物、或肺泡灌洗液。139.在某些实施方案中，所述方法可以用于非诊断目的，例如所述样品并非来自受试者的样品，例如疫苗样品。140.在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。141.在另一个方面，提供了本发明的抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测sars‑cov‑2或其s蛋白或s蛋白的rbd在样品中的存在或其水平，和/或用于诊断受试者是否感染了sars‑cov‑2。142.在某些实施方案中，所述检测是免疫学测定，例如酶免疫测定法(例如elisa)、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法或放射免疫测定法。143.在某些实施方案中，所述试剂盒通过如上所述的检测方法来检测sars‑cov‑2或其s蛋白或s蛋白的rbd在样品中的存在或其水平，以及任选地根据所述检测结果诊断受试者是否感染了sars‑cov‑2。144.在某些实施方案中，所述样品为来自受试者(例如哺乳动物，优选人)的血液样品(例如，全血、血浆或血清)、排泄物、口腔或鼻腔分泌物、或肺泡灌洗液。145.治疗方法和药物组合物146.在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其含有本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。147.在某些实施方案中，所述药物组合物还包含另外的药学活性剂，例如另外的抗病毒剂，如干扰素、洛匹那韦、利托那韦、磷酸氯喹、法匹拉韦、瑞德西韦等。148.在某些实施方案中，在所述药物组合物中，本发明的抗体或其抗原结合片段与所述另外的药学活性剂作为分离的组分或作为单一组合物的组分提供。因此，本发明的抗体或其抗原结合片段与所述另外的药学活性剂可以同时、分开或相继施用。149.在某些示例性实施方案中，所述药学上可接受的载体和/或赋形剂包含无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(wfi)、抑菌性注射用水(bwfi)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)nacl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、ph缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、ringer氏溶液及其任意组合。150.在另一个方面，本发明提供了用于中和sars‑cov‑2的方法，其包括使用本发明的抗体或其抗原结合片段或药物组合物。所述方法可用于在体外或受试者(例如人)体内中和sars‑cov‑2。151.在某些实施方案中，所述方法用于中和样品中sars‑cov‑2的毒力。在某些实施方案中，所述方法包括：将包含sars‑cov‑2的样品与本发明的抗体或其抗原结合片段或药物组合物接触。152.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段单独使用，或与另外的药学活性剂(例如另外的抗病毒剂，如干扰素、洛匹那韦、利托那韦、磷酸氯喹、法匹拉韦、瑞德西韦等)联合使用。153.在另一个方面，本发明提供了用于预防或治疗受试者的sars‑ꢀcov‑2感染或与sars‑cov‑2感染相关的疾病(例如covid‑19)的方法，其包括：给有此需要的受试者施用有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段或药物组合物。154.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段单独使用，或与另外的药学活性剂(例如另外的抗病毒剂，如干扰素、洛匹那韦、利托那韦、磷酸氯喹、法匹拉韦、瑞德西韦等)联合使用。155.在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。156.在另一个方面，本发明涉及本发明的抗体或其抗原结合片段在制备药物中的用途，所述药物用于：157.(1)在体外或受试者(例如人)体内中和sars‑cov‑2；和/或158.(2)用于预防或治疗受试者的sars‑cov‑2感染或与sars‑cov‑2感染相关的疾病(例如covid‑19)。159.在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段单独使用，或与另外的药学活性剂(例如另外的抗病毒剂，如干扰素、洛匹那韦、利托那韦、磷酸氯喹、法匹拉韦、瑞德西韦等)联合使用。160.在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。161.本发明的抗体或其抗原结合片段、或者本发明的药物组合物可以配制成医学领域已知的任何剂型，例如，片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、吸入剂、喷雾剂等。优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。本发明的药物组合物应当是无菌的并在生产和储存条件下稳定。一种优选的剂型是注射剂。此类注射剂可以是无菌注射溶液。例如，可通过下述方法来制备无菌注射溶液：在适当的溶剂中掺入必需剂量的本发明的重组蛋白，以及任选地，同时掺入其他期望的成分(包括但不限于，ph调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，等渗剂、防腐剂、稀释剂，或其任何组合)，随后过滤除菌。此外，可以将无菌注射溶液制备为无菌冻干粉剂(例如，通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。此类无菌冻干粉剂可在使用前分散于合适的载体中，例如注射用水(wfi)、抑菌性注射用水(bwfi)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)nacl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、ph缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、ringer氏溶液及其任意组合。162.本发明的抗体或其抗原结合片段、或药物组合物可以通过本领域已知的任何合适的方法来施用，包括但不限于，口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径。但是，对于许多治疗用途而言，优选的给药途径/方式是胃肠外给药(例如静脉注射或推注，皮下注射，腹膜内注射，肌内注射)。技术人员应理解，给药途径和/或方式将根据预期目的而发生变化。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段、或药物组合物通过静脉注射或推注给予。163.本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明的抗体或其抗原结合片段。“预防有效量”是指，足以预防，阻止，或延迟疾病的发生的量。“治疗有效量”是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。本发明的抗体或其抗原结合片段的治疗有效量可根据如下因素发生变化：待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。164.在本发明中，可调整给药方案以获得最佳目的反应(例如治疗或预防反应)。例如，可以单次给药，可以在一段时间内多次给药，或者可以随治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。165.在本发明中，所述受试者可以为哺乳动物，例如人。166.术语定义167.在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。168.如本文中所使用的，“严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severeacuterespiratorysyndromecoronavirus2，sars‑cov‑2)”，旧称为“新型冠状病毒”或“2019‑ncov”，属于其β冠状病毒属，为含包膜的单链正义rna病毒。sars‑cov‑2的基因组序列是本领域技术人员已知的，可参见例如genbank：mn908947。sars‑cov‑2至少含有三种膜蛋白，包括表面刺突蛋白(s)、整合膜蛋白(m)和膜蛋白(e)。sars‑cov‑2的受体与sars‑cov一样，均是通过s蛋白上的受体结合结构域(receptorbindingdomain,rbd)与宿主细胞上的血管紧张素转移酶2(ace2)特异性结合后接到了病毒的膜融合和入胞，在病毒感染细胞过程中起着至关重要的作用。169.如本文中所使用的，术语“新型冠状病毒肺炎”和“covid‑19”是指，因sars‑cov‑2感染而导致的肺炎，二者具有相同的含义，可互换使用。170.如本文中所使用的，术语“s蛋白”和“spike蛋白”是指，sars‑cov‑2的表面刺突蛋白，其上具有受体结合结构域(rbd)。“s蛋白”和“spike蛋白”二者具有相同的含义，可互换使用。171.如本文中所使用的，术语“抗体”是指，通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(l)链和一条“重”(h)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为igm、igd、igg、iga和ige。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“j”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“d”区。各重链由重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)组成。重链恒定区由3个结构域(ch1、ch2和ch3)组成。各轻链由轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)组成。轻链恒定区由一个结构域cl组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(c1q)的结合。vh和vl区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(cdr))，其间散布有较保守的称为构架区(fr)的区域。各vh和vl由按下列顺序：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4从氨基末端至羧基末端排列的3个cdr和4个fr组成。各重链/轻链对的可变区(vh和vl)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循kabatsequencesofproteinsofimmunologicalinterest(nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1987and1991))，或chothia&lesk(1987)j.mol.biol.196:901‑917；chothia等人(1989)nature342:878‑883的定义。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，igg(例如，igg1，igg2，igg3或igg4亚型)，iga1，iga2，igd，ige或igm抗体。172.如本文中所使用的，术语“互补决定区”或“cdr”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。这些氨基酸残基的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义，例如可按照kabat编号系统(kabatetal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.,1991)、chothia编号系统(chothia&lesk(1987)j.mol.biol.196:901‑917；chothia等人(1989)nature342:878‑883)或imgt编号系统(lefrancetal.,dev.comparat.immunol.27:55‑77,2003)中的定义。对于给定的抗体，本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的cdr。并且，不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(例如，可参见lefrancetal.,dev.comparat.immunol.27:55‑77,2003)。173.在本发明中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的cdr可根据本领域已知的各种编号系统确定。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的cdr优选地通过kabat、chothia或imgt编号系统确定。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的cdr优选地通过kabat编号系统确定。174.在一些情况下，抗体的抗原结合片段是单链抗体(例如,scfv)，其中vl和vh结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子(参见，例如,bird等人,science242:423426(1988)和huston等人,proc.natl.acad.sci.usa85:58795883(1988))。此类scfv分子可具有一般结构：nh2‑vl‑接头‑vh‑cooh或nh2‑vh‑接头‑vl‑ꢀcooh。合适的现有技术接头由重复的ggggs氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(ggggs)4的接头，但也可使用其变体(holliger等人(1993)，proc.natl.acad.sci.usa90:6444‑ꢀ6448)。可用于本发明的其他接头由alfthan等人(1995)，proteineng.8:725‑731，choi等人(2001)，eur.j.immunol.31:94‑106，hu等人(1996)，cancerres.56:3055‑3061，kipriyanov等人(1999)，j.mol.biol.293:41‑56和roovers等人(2001)，cancerimmunol.描述。175.在一些情况下，抗体的抗原结合片段是双抗体，即，双价抗体，其中vh和vl结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如,holligerp.等人,proc.natl.acad.sci.usa90:64446448(1993)，和poljakr.j.等人,structure2:11211123(1994))。176.可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组dna技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体获得抗体的抗原结合片段(例如，上述抗体片段)，并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。177.在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。178.如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片段，也即，除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。179.如本文中所使用的，术语“嵌合抗体(chimericantibody)”是指，这样的抗体，其轻链或/和重链的一部分源自一个抗体(其可以源自某一特定物种或属于某一特定抗体类或亚类)，且轻链或/和重链的另一部分源自另一个抗体(其可以源自相同或不同的物种或属于相同或不同的抗体类或亚类)，但无论如何，其仍保留对目标抗原的结合活性(u.s.p4,816,567tocabillyetal.；morrisonetal.,proc.natl.acad.sci.usa,81:68516855(1984))。例如，术语“嵌合抗体”可包括这样的抗体，其中抗体的重链和轻链可变区来自第一抗体(例如个体人抗体序列)，而抗体的重链和轻链恒定区来自第二抗体(例如人共有胚系抗体序列)。180.为制备嵌合抗体，可使用本领域已知的方法将一个抗体的可变区连接至另一个抗体(例如人免疫球蛋白)的恒定区。例如，将编码vh的dna可操作的连接至编码重链恒定区的另一dna分子以获得全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如kabat,e.a.等人(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,fifthedition,u.s.departmentofhealthandhumanservices,nihpublicationno.91‑3242)，包含这些区的dna片段可以通过标准pcr扩增获得。重链恒定区可以是igg1、igg2、igg3、igg4、iga、ige、igm或igd恒定区，但是通常优选为igg1或igg4恒定区。例如，将编码vl的dna可操作的连接至编码轻链恒定区cl的另一dna分子以获得全长轻链基因(以及fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如kabat，e.a.等人(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，fifthedition，u.s.departmentofhealthandhumanservices，nihpublicationno.91‑3242)，包含这些区的dna片段可以通过标准pcr扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区，但通常优选为κ恒定区。181.如本文中所使用的，术语“人源化抗体”是指，经基因工程改造的非人源抗体，其氨基酸序列经修饰以提高与人源抗体的序列的同源性。通常而言，人源化抗体的全部或部分cdr区来自于非人源抗体(供体抗体)，全部或部分的非cdr区(例如，可变区fr和/或恒定区)来自于人源免疫球蛋白(受体抗体)。人源化抗体通常保留了供体抗体的预期性质，包括但不限于，抗原特异性、亲和性、反应性、提高免疫细胞活性的能力、增强免疫应答的能力等。供体抗体可以是有预期性质(例如，抗原特异性、亲和性、反应性、提高免疫细胞活性的能力和/或增强免疫应答的能力)的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物(例如，食蟹猴)抗体。182.如本文中所使用的，术语“胚系抗体基因(germlineantibodygene)”或“胚系抗体基因片段(germlineantibodygenesegment)”是指，存在于生物体的基因组中的编码免疫球蛋白的序列，其没有经历过能够导致表达特异性免疫球蛋白的遗传学重排及突变的成熟过程。相应地，术语“重排抗体序列”是指，已经历过能够导致表达特异性免疫球蛋白的遗传学重排及突变的成熟过程而产生的特异性抗体的序列。在本发明中，表述“重链胚系基因”是指，编码免疫球蛋白重链的胚系抗体基因或基因片段，其包括v基因(variable)、d基因(diversity)、j基因(joining)和c基因(constant)；类似地，表述“轻链胚系基因”是指，编码免疫球蛋白轻链的胚系抗体基因或基因片段，其包括v基因(variable)、j基因(joining)和c基因(constant)。在本发明中，由所述胚系抗体基因或胚系抗体基因片段所编码的氨基酸序列也称为“胚系序列(germlinesequence)”，由重链胚系基因所编码的氨基酸序列称为重链胚系序列，由轻链胚系基因所编码的氨基酸序列称为轻链胚系序列。胚系抗体基因或胚系抗体基因片段及其相应的胚系序列是本领域技术人员熟知的，并且可从专业数据库(例如，imgt、unswig、ncbi或vbase2)获得或查询。183.如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1来源的人工染色体(pac)；噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如sv40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。184.如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如s2果蝇细胞或sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，cho细胞，cos细胞，nso细胞，hela细胞，bhk细胞，hek293细胞或人细胞等的动物细胞。185.如本文中使用的，术语“特异结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10‑5m，例如小于大约10‑6m、10‑7m、10‑8m、10‑9m或10‑10m或更小的亲和力(kd)结合该抗原。186.如本文中所使用的，术语“kd”是指特定抗体‑抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体‑抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常，抗体以小于大约10‑5m的解离平衡常数(kd)结合抗原。例如，本发明的单克隆抗体3c11、5c6、6g9能够以大约10‑8m(nm水平)的解离平衡常数(kd)结合抗原(例如，新型冠状病毒的s蛋白)。187.如本文中所使用的，术语“中和活性”是指抗体或抗体片段具有与病毒上的抗原蛋白相结合，从而阻止病毒感染细胞和/或病毒子代的成熟和/或病毒子代的释放的功能活性，具有中和活性的抗体或抗体片段可以阻止病毒的扩增，从而抑制或消除病毒的感染。188.如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个dna分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，dna序列ctgact和caggtt共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如align程序(dnastar,inc.)方便地进行的needleman等人(1970)j.mol.biol.48：443‑453的方法来实现。还可使用已整合入align程序(版本2.0)的e.meyers和w.miller(comput.applbiosci.，4:11‑17(1988))的算法，使用pam120权重残基表(weightresiduetable)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入gcg软件包(可在www.gcg.com上获得)的gap程序中的needleman和wunsch(jmoibiol.48:444‑453(1970))算法，使用blossum62矩阵或pam250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gapweight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。189.如本文中所使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和pcr介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，brummell等人，biochem.32:1180‑1187(1993)；kobayashi等人proteineng.12(10):879‑884(1999)；和burks等人proc.natlacad.setusa94:412‑417(1997)，其通过引用并入本文)。190.本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如，immunology‑asynthesis(2ndedition,e.s.golubandd.r.gren,eds.,sinauerassociates,sunderland,mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。在本发明中，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用a或ala表示。191.如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如remington'spharmaceuticalsciences.editedbygennaroar,19thed.pennsylvania:mackpublishingcompany,1995)，并且包括但不限于：ph调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。例如，ph调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如tween‑80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、nacl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2‑苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义，其能够稳定药物中的活性成分的期望活性，包括但不限于谷氨酸钠，明胶，spga，糖类(如山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖)，氨基酸(如谷氨酸，甘氨酸)，蛋白质(如干燥乳清，白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水解物)等。在某些示例性实施方案中，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(wfi)、抑菌性注射用水(bwfi)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)nacl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、ph缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、ringer氏溶液及其任意组合。192.如本文中所使用的，术语“预防”是指，为了阻止或延迟疾病或病症或症状在受试者体内的发生而实施的方法。如本文中所使用的，术语“治疗”是指，为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。为了本发明的目的，有益或所需的临床结果包括但不限于，减轻症状、缩小疾病的范围、稳定(即，不再恶化)疾病的状态，延迟或减缓疾病的发展、改善或减轻疾病的状态、和缓解症状(无论部分或全部)，无论是可检测或是不可检测的。此外，“治疗”还可以指，与期望的存活期相比(如果未接受治疗)，延长存活期。193.如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。194.发明的有益效果195.本技术的单克隆抗体(例如3c11抗体、5c6抗体、6g9抗体)能够以高亲和力与新型冠状病毒s蛋白结合，并且对新型冠状病毒具有很强的中和活性。因此，本技术的单克隆抗体(例如3c11抗体、5c6抗体、6g9抗体)具有诊断、预防和治疗新型冠状病毒感染的临床应用价值。196.下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得可实施。附图说明197.图1显示了单克隆抗体3c11与s2p蛋白的elisa检测结果。198.图2显示了单克隆抗体5c6与s2p蛋白的elisa检测结果。199.图3显示了单克隆抗体6g9与s2p蛋白的elisa检测结果。200.图4显示了上清(3c11‑sup)与rbd蛋白的动力学分析结果。201.图5显示了上清(5c6‑sup)与rbd蛋白的动力学分析结果。202.图6显示了上清(6g9‑sup)与rbd蛋白的动力学分析结果。203.图7显示了单克隆抗体(3c11)与rbd蛋白的动力学分析结果。204.图8显示了单克隆抗体(5c6)与rbd蛋白的动力学分析结果。205.图9显示了单克隆抗体(6g9)与rbd蛋白的动力学分析结果。206.图10显示了单克隆抗体3c11与sars‑cov2vsvpp假病毒的中和活性；其中，ncov‑3c11为单抗，mock为对照。207.图11显示了不同浓度的单克隆抗体3c11与sars‑cov2vsvpp假病毒的中和活性。208.图12显示了不同浓度的单克隆抗体5c6与sars‑cov2vsvpp假病毒的中和活性。209.图13显示了不同浓度的单克隆抗体6g9与sars‑cov2vsvpp假病毒的中和活性。210.图14显示了单克隆抗体3c11对于rbd蛋白和ace2结合的阻断结果。211.序列信息212.本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。213.表1：序列的描述214.215.216.具体实施方式217.现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。218.除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照j.sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及f.m.ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，johnwiley&sons,inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。219.实施例1：单克隆抗体序列的获得220.采集新冠患者的咽拭子进行荧光定量pcr检测，间隔一周再次检测，若两次均为阴性则判定为新冠恢复者。采集新冠恢复者的静脉血10ml，使用含edta的抗凝管保存。221.1.外周血单个核细胞(pbmc)的制备:222.采用密度梯度离心法，在采集的静脉血中按1：1的比例加入1640细胞培养基。吹吸混匀后以与静脉血相同体积的ficoll溶液作为底层溶液，缓慢加入静脉血与培养基的混合溶液置于上层。400g，4℃下分别进行2次40min离心，离心完成后收集ficoll和培养基交界处的悬浮细胞，即为pbmc。800g，4℃下进行10min离心，以与静脉血相同体积的10％dmso冻存液重悬细胞，将细胞1ml每管分装于细胞冻存管中，保存于液氮罐。223.2.抗rbd蛋白的特异性b细胞筛选：224.rbd‑小鼠fc蛋白分别标记fitc荧光和biotin，使用elisa检测标记效果。取冻存于液氮罐的细胞，1500rpm，4℃离心3min吸去上清，保留细胞。使用pbs重悬细胞以洗涤冻存液，以1ml的量分装到ep管中，重复上述离心操作，吸去上清后每管加入100ul如表2所示的染料体系吹吸混匀，置于4℃避光冰浴30min。225.表2.染料体系no:28)上。将抗体重链可变区序列插入ptt5‑h的agei和sali酶切位点之间，抗体轻链可变区序列插入ptt5‑k的agei和bsiwi酶切位点之间。237.表达载体构建完成后，脂质体法瞬时转染hek293t细胞，进行单克隆抗体的表达。转染前12小时，将104细胞接种到96孔细胞培养板中。a管：10μlopti‑mem中加入0.2μgigh质粒和0.2μgigk质粒，b管：10μlopti‑mem中加入0.4μltransfectionreagent(诺唯赞公司2000)。将a、b管分别轻柔混匀，室温静置5min，再将稀释好的质粒(a管)滴加至稀释的转染试剂(b管)中，轻柔混匀，室温孵育10min。将质粒‑转染试剂复合物滴加至细胞中，置于细胞培养箱中培养。48h后，收集细胞上清，3000rpm，4℃下离心5min。取上清，弃去细胞碎片沉淀。抗sars‑cov‑2受体结合区蛋白rbd阳性单克隆抗体通过间接法elisa进行筛选，筛选与rbd具有特异反应性的单克隆抗体。238.4.单抗序列的获得239.经过上述实验，获得了三株特异性反应单克隆抗体，将其命名为3c11、5c6及6g9。经测序，人源单克隆抗体3c11重链可变区氨基酸序列如seqidno:1所示，3c11轻链可变区氨基酸序列如seqidno:2所示；人源单克隆抗体5c6重链可变区氨基酸序列如seqidno:9所示，5c6轻链可变区氨基酸序列如seqidno:10所示；人源单克隆抗体6g9重链可变区氨基酸序列如seqidno:17所示，6g9轻链可变区氨基酸序列如seqidno:18所示。240.进一步，还使用kabat等人描述的方法(kabat等，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第五版，publichealthservice，美国国立卫生研究院，贝塞斯达、马里兰州(1991)，第647‑669页)，确定了3c11、5c6及6g9的cdr序列。其中，3c11的重链cdr1‑3如seqidno:3‑5所示，3c11的轻链cdr1‑3如seqidno:6‑8所示；5c6的重链cdr1‑3如seqidno:11‑13所示，5c6的轻链cdr1‑3如seqidno:14‑16所示；6g9的重链cdr1‑3如seqidno:19‑21所示，6g9的轻链cdr1‑3如seqidno:22‑24所示。241.实施例2：单克隆抗体的制备与纯化242.准备处于对数生长期的悬浮细胞expichotm，将其置于125rpm，37℃，8％co2的细胞摇床进行培养，至密度为6×106/ml，活细胞率>98％。取25ml细胞置于新的细胞培养瓶中，作为一个转染体系。a管：1mlexpichotmexpresssionmedium中包含12.5ugigh质粒和12.5ugigκ质粒，b管：1mlexpichotmexpresssionmedium中包含80ulexpifectaminetmchotransfectionkit中的转染试剂。将a管与b管混合，室温静置2min，2min后将混合液倒入25ml准备好的转染细胞体系中。置于125rpm，37℃，8％co2细胞摇床进行培养18‑22h。每瓶加入expifectaminetmchotransfectionkit中的150ul增强剂以及4ml辅料，置于125rpm，32℃，5％co2的细胞摇床培养8‑15d。培养完成后，4℃，4000rpm离心10min，收集细胞上清。243.用0.22um滤器过滤上述上清。打开akta仪器，先分别用a液(200mm十二水合磷酸氢二钠)和b液(100mm一水柠檬酸)冲洗a管道和b管道，装上proteina柱子。用a液以8ml/min的流速平衡proteina柱子15min以上，待仪器检测的uv值、ph值和电导率稳定后进行下一步。以6‑10ml/min流速上样，随后uv值会上升，该峰为穿透峰，并继续用a液洗柱，同时收集穿透峰样品待检测。待ph值不再变化后用b液以6‑10ml/min流速进液，随后ph值下降，uv值上升，该峰为洗脱峰，抗体主要存在于洗脱峰中。收取洗脱峰样品待检测。用a液平衡柱子，再用20％乙醇充满管道和proteina柱子，取下柱子，4℃保存。将穿透峰和洗脱峰的样品进行纯化，并进行sds–page鉴定(对样品进行沸水煮5min，可以使抗体重链和轻链间的二硫键打开，见《分子克隆实验指南》第二版)。纯化的单克隆抗体用20mmpbs缓冲液透析过夜，并采用紫外分光或者bca测取浓度，分装至1.5ml管中，存放于‑20℃备用。244.实施例3：单抗与s2p蛋白的特异反应性245.参考sars‑cov‑2基因序列(genbank:nc_045512.2)，选取s蛋白的胞外段编码第15‑1213位氨基酸的核苷酸序列，在其c端添加凝血酶折叠序列，t4三聚化原件和his纯化标签。并将编码s蛋白的第682到685位氨基酸的核苷酸序列用“agag”替代，编码第986‑ꢀ987位用氨基酸的核苷酸序列用“pp”替代，将该克隆命名为s‑2p。将其克隆至杆状病毒昆虫表达载体pacgp67b上进行重组杆状病毒制备，利用载体上的信号肽在昆虫细胞中进行分泌表达，利用亲和层析纯化获得s2p蛋白。246.将s2p蛋白用ph9.6的50mmcb缓冲液(nahco3/na2co3缓冲液，终浓度为50mm，ph值为9.6)稀释，终浓度为0.5μg/ml。在96孔酶标板的每孔中加入100μl的包被液，2～8℃包被16～24小时后，再37℃包被2小时。用pbst洗涤液(20mmpb7.4，150mmnacl，0.1％tween20)洗涤1次。然后每孔加入200μl的封闭液(含有20％小牛血清及1％酪蛋白的ph值为7.4的20mmna2hpo4/nah2po4缓冲液溶液)，放入37℃封闭2小时，弃去封闭液。干燥后装入铝箔袋2‑8℃保存备用。247.取实施例1中获得的单克隆抗体3c11、5c6及6g9，以sd‑1溶液从100ug/ml为起始浓度开始5倍梯度稀释，共稀释8个梯度。取已包被s2p的酶标板，每孔加入100μl已稀释的抗体样品，置于37℃温箱反应60分钟。将酶标板用pbst洗液(20mmpb7.4，150mmnacl，0.1％tween20)洗涤5遍，每孔加入100μl辣根过氧化物酶(hrp)标记的羊抗人igg反应液，置于37℃温箱反应30分钟。完成酶标记物反应步骤后，将酶标板用pbst洗液(20mmpb7.4，150mmnacl，0.1％tween20)洗涤5遍，每孔加入50μltmb显色剂(购自北京万泰生物药业股份有限公司)，置于37℃温箱反应15分钟。完成显色反应步骤后，在反应完的酶标板中每孔加入50μl终止液(购自北京万泰生物药业股份有限公司)，并于酶标仪上检测各孔的od450/630值。人源单克隆抗体3c11、5c6及6g9与s2p的反应性判定：根据反应后的读值进行判定。若检测值/本底值大于5，则判定为阳性。248.结果分析：elisa实验结果如图1、2、3所示。检测结果显示，3c11、5c6及6g9与s2p重组蛋白的ec50数值分别为0.07402ug/ml、0.001414ug/ml和0.01124ug/ml，具有良好的结合活性。249.实施例4：单克隆抗体与rbd蛋白的特异结合能力250.使用biacore8k系统对单克隆抗体和抗原进行结合的动力学分析(参照操作手册进行)，所有步骤都在pbs缓冲液下进行。采用该公司配套的proteina芯片捕获1：50稀释的小量表达上清和稀释为25nm的单克隆抗体。检测小量表达上清时将rbd抗原分别稀释为200nm、100nm、50nm、25nm和12.5nm五个梯度，按照下述程序进行：捕获(captue)60s，分析(analyte)60s，解离(dissociation)60s，再生(regeneration)30s。检测单克隆抗体时抗原分别稀释为200nm、175nm、150nm、125nm、100nm五个梯度，按照下述程序进行：捕获(captue)60s，分析(analyte)120s，解离(dissociation)200s，再生(regeneration)60s。采用仪器配套数据采集和分析软件进行亲和力平衡解离常数的计算。251.上清(3c11‑sup、5c6‑sup、6g9‑sup)与rbd蛋白结合的动力学分析如图4、5、6所示，单抗(3c11、5c6、6g9)与rbd蛋白结合的动力学分析如图7、8、9所示。具体计算结果如下所示，小量表达上清(3c11‑sup、5c6‑sup、6g9‑sup)与rbd蛋白的kd值分别为5.42x10‑9、2.82x10‑9和1.12x10‑8，单抗3c11、5c6及6g9与rbd蛋白的kd值分别为1.98x10‑8、1.22x10‑10和4.38x10‑9。252.实施例5：单克隆抗体与sars‑cov‑2vsvpp假病毒的中和活性253.为构建携带sars‑cov‑2spike蛋白(s蛋白)的vsv假病毒，根据人密码子偏好性，对sars‑cov‑2毒株的spike基因(序列来源genbank：mn908947)的序列进行密码子优化，以在人细胞中表达。将sars‑cov‑2的s蛋白的c末端截短18个氨基酸，将此蛋白命名为sars‑cov‑2sde18，并将此蛋白的核苷酸序列克隆到真核表达载体pcag中，将此载体命名为pcag‑ncovsde18。将载体pcag‑ꢀncovsde18转染到vero‑e6细胞中，以表达sars‑cov‑2sde18蛋白。转染48小时后，将vsvdg‑egfp‑g(获自addgene，31842)病毒接种到上述细胞中，孵育1小时。然后去除上清液中的vsvdg‑ꢀegfp‑g病毒，并加入抗vsv‑g大鼠血清以阻断残留的vsvdg‑ꢀegfp‑g的感染。获得的子代病毒为携带sars‑cov‑2sde18蛋白的vsv假病毒，将假病毒命名为sars‑cov‑2vsvpp。vsvdg‑egfp‑ꢀg感染24小时后，收集细胞上清，然后离心并过滤(孔径为0.45‑μm，millipore，slhp033rb)以去除细胞碎片，‑80℃下保存备用。254.通过piggybac转座子系统在bhk21细胞中整合hace2的基因。将含有hace2基因的转座子载体(sbisystembiosciences，pb514b‑ꢀ2)和转座酶质粒共转染到bhk21细胞中，通过嘌呤霉素抗性和红色荧光进行筛选，获得稳定表达hace2的细胞bhk21‑hace2。将抗体3c11、5c6及6g9稀释到2ug/ml作为梯度1，3倍向下梯度稀释，共6个梯度，将梯度稀释的抗体与稀释的sars‑cov‑2vsvpp假病毒(moi＝0.05)混合，并在37℃孵育1h(所有样品和病毒均用10％fbs‑dmem稀释)。将上述80μl混合物加入预先铺板的bhk21‑ꢀhace2细胞中。孵育12小时后，采用基于转盘共聚焦的高内涵成像系统(operaphenix或operettacls，购自perkinelmer公司)对感染后的细胞进行荧光成像。完成后采用columbus图像管理分析软件对所获荧光图像进行定量分析检测绿色荧光阳性细胞数量。计算出与未处理的对照孔相比，抗体处理组的gfp阳性细胞数量减少的百分比，计算抑制率。255.结果如图10‑13所示，与对照相比，单抗3c11、5c6及6g9具有显著的中和活性，尤其在浓度为0.22μg/ml的条件下仍能阻断80％的假病毒感染。其半抑制浓度(ic50)分别为62.87ng/ml、4.064ng/ml和0.5602ng/ml。256.实施例6：单克隆抗体交叉阻断能力分析257.参考sars‑cov2‑2全基因序列(mn908947.3)，将编码rbd蛋白核苷酸序列按人类偏好的密码子进行优化，获得其优化的核苷酸序列。在密码子优化的rbd核苷酸序列的n端连接上编码信号肽的核苷酸序列，c端连接上编码绿色荧光蛋白mgamillus(简称mgam)的核苷酸序列，将此核苷酸序列的c端连接上便于亲和层析纯化的多聚组氨酸多肽(6×his或8×his)，最终获得融合荧光蛋白探针的rbd，简称为sars‑cov2‑rbg。将编码sars‑cov2‑rbg的核苷酸序列连接到真核表达载体中，把构建好的重组载体转染至expicho细胞(购自thermofisher公司)中进行表达纯化。258.参考genebank上已经公布的病毒基因组序列sars‑cov‑1(aap13567.1)，将其rbd序列参考上述sars‑cov2‑rbg的方法构建rbd与mgamillus的融合荧光蛋白探针，简称为sars‑cov1‑ꢀrbg。将sars‑cov1‑rbg的编码序列连接到真核表达载体中，把构建好的重组质粒转染至expicho细胞(购自thermofisher公司)中进行表达纯化。259.在ace2基因(nm_021804.1)的c端融合编码表达红色荧光蛋白mruby3(中间以柔性氨基酸linker连接)的核苷酸序列，获得的序列简称为hace2mrb3，将该序列克隆至本室构建的piggybac(pb)转座子载体mihip‑cmvmie载体，获得mihip‑cmvmie‑ꢀhace2mrb3载体，该载体可在细胞内表达hace2mrb3蛋白。使用lipofectamine3000转染试剂(购自thermofisher公司)将mihip‑ꢀcmvmie‑hace2mrb3载体与superpiggybactransposase表达质粒(购自systembiosciences公司)共同转染至293t细胞中(按照质量比4：1)，转染4小时后换液，继续培养24小时后将细胞传代至10cm细胞培养皿，并更换为含有2μg/ml嘌呤霉素(购自invivogen公司)加压筛选，每24小时更换含杀伤抗性培养液。含嘌呤霉素培养液6‑7天后，存活的细胞经过显微镜观察确认为mruby3红色荧光蛋白阳性，表明成功整合。将稳转的细胞株命名为293t‑ace2irb3。260.将293t‑ace2irb3细胞按照15000细胞/孔的密度铺板至黑色玻璃底，培养12‑24小时，待其贴壁备用。将sars‑cov2‑rbg探针稀释至合适浓度(20‑30nm)，与不同稀释倍数的抗体稀释液混合，使抗体终浓度以50nm为梯度1，2倍梯度稀释，共10个梯度。移去原细胞培养板中的50μl培养基，将制备好的混合液，50μl加入细胞培养板中，37℃孵育60分钟。不经洗涤直接使用operaphenix共聚焦型高内涵系统进行成像分析，成像荧光通道包括ex488/em510(绿色荧光蛋白检测通道，探针信号)、ex561/em592(红色荧光蛋白检测通道，ace2)、ex641/em670(近红外荧光蛋irfp670成像通道，细胞核)，使用20倍或者40倍水浸镜头至少拍摄25个视野(共聚焦模式)。完成后将数据上传至columbus图像管理分析软件，并使用该软件进行定量图像分析。分析参数包括：细胞核irfp670阳性细胞数(n，要求>1000个)、细胞膜红色荧光(ace2‑mruby3，用于质细胞孔间差异)信号强度(均值)、细胞质绿色荧光信号强度(均值、sd，反映被细胞结合并摄入的蛋白探针的量)。261.实验结果如图14所示，单克隆抗体3c11可阻断sars‑cov‑2受体结合区rbd蛋白对ace2受体的结合，未能阻断sars‑cov‑1受体结合区rbd蛋白对ace2受体的结合。262.尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。当前第1页12当前第1页12
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