一种靶向表达CLDN18.2的细胞的嵌合抗原受体的制作方法

一种靶向表达cldn 18.2的细胞的嵌合抗原受体
技术领域
1.本发明涉及细胞免疫治疗领域，具体涉及一种靶向表达cldn 18.2的细胞的嵌合抗原受体。


背景技术：

2.细胞免疫治疗是一种正在兴起的肿瘤治疗方法，其通过分子生物学技术构建嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)的表达载体，并将该表达载体导入到从人体分离的免疫细胞中，使其细胞表面表达car后进行扩增培养，将其回输至人体。表达car的免疫细胞能够特异性识别并结合靶细胞，通过释放特异的免疫因子对其进行杀伤。第一代car-t虽然能够介导对肿瘤细胞的杀伤作用，但是不转导增殖信号和诱导细胞因子产生，并且体内持续作用时间不长，只能引起短暂的t细胞增殖，因此，抗肿瘤效果甚微；第二代car-t通过增加共刺激分子(例如4-1bb或cd28)的胞内结构域以延长其体内存活时间，促进其迅速扩增能力，通过构建scfv/4-1bb(或cd28)/cd3-z的car-t可以裂解靶细胞，传递活化信号，产生大量的ifn-γ、il-2等细胞因子；第二代car-t较第一代具有更好的增强t细胞活化、扩增、抗肿瘤以及促进转基因表达的能力。
3.car-t在杀伤肿瘤方面具有的主要优势是：第一，由于其抗原识别结合域能够识别肿瘤抗原，因此针对肿瘤的特异性很高；第二，由于其胞内信号传导域可以迅速同时开启car-t的杀伤和扩增的下游信号，因此肿瘤杀伤效率高，car-t细胞能够在体内持续扩增；第三，由于car-t不需要通过tcr和mhc分子相结合的方式开启肿瘤杀伤，因此具有非mhc限制性，可以直接识别肿瘤表面抗原，因此肿瘤的识别效率高特异性强，同时能够杀伤mhc下调的肿瘤细胞。基于car-t的这些优势，car-t在b细胞急性白血病和非霍奇金氏淋巴瘤等血液肿瘤的治疗上已取得了显著的疗效，已获得了fda的审批，并且在实体肿瘤的治疗中已经显示了初步的疗效。
4.胃肠道和胰腺肿瘤对于人类生命是很大的威胁，虽然手术治疗、放化疗、介入治疗等治疗手段对于该类肿瘤有一定疗效，但患者生存率仍无显著改善。目前，备受关注的car-t细胞治疗技术有望成为治疗的突破口。
5.由于cldn18.2在正常组织表达的高度特异性及在多种癌症中被激活表达，因此针对上皮性肿瘤，cldn18.2成为极具潜力的靶点，cldn 18.2是一种广谱性肿瘤标志物，可在多种肿瘤中表达。
6.因此，本领域亟待开发一种新的有效治疗多种表达cldn18.2的肿瘤的免疫治疗方法。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种靶向表达cldn 18.2的细胞的嵌合抗原受体。
8.本发明的第一方面，提供了一种靶向表达cldn 18.2的细胞的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体氨基酸序列如seq id no.:14所示，并且其包含：靶向cldn 18.2的单链抗体、
铰链区、跨膜结构域和细胞内信号结构域，其中所述的靶向cldn 18.2的单链抗体的氨基酸序列如seq id no.:1所示。
9.在另一优选例中，所述的car具有如式i所示的结构：
10.l-scfv-h-tm-c-cd3ζ
ꢀꢀ
(式i)
11.其中，
12.l为无或信号肽序列；
13.scfv为靶向cldn 18.2的单链抗体可变区序列；
14.h为无或铰链区；
15.tm为跨膜结构域；
16.c为共刺激信号分子；
17.cd3ζ为源于cd3ζ的胞浆信号传导序列；
18.各
“‑”
独立地表示连接上述各元件的连接肽或肽键。
19.在另一优选例中，所述单链抗体包含如seq id no.:17所示的抗体重链可变区和如seq id no.:18所示的抗体轻链可变区。
20.在另一优选例中，所述抗体重链可变区包括以下三个互补决定区cdr：
21.如seq id no.:19所示的cdr1；
22.如seq id no.:20所示的cdr2；和
23.如seq id no.:21所示的cdr3。
24.在另一优选例中，所述抗体轻链可变区包括以下三个互补决定区cdr：
25.如seq id no.:22所示的cdr1’；
26.如seq id no.:23所示的cdr2’；和
27.如seq id no.:24所示的cdr3’。
28.在另一优选例中，所述的h为选自下组蛋白的铰链区：cd8、cd28、cd137、或其组合。
29.在另一优选例中，所述铰链区为cd8 hinge，其氨基酸序列如seq id no:3所示。
30.在另一优选例中，所述的tm为选自下组的蛋白的跨膜区：cd28、cd3 epsilon、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、或其组合。
31.在另一优选例中，所述跨膜结构域为cd8 tm，其氨基酸序列如seq id no:5所示。
32.在另一优选例中，所述的c为选自下组的蛋白的共刺激信号分子：ox40、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd70、cd134、4-1bb(cd137)、pd1、dap10、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、nkg2d、gitr、tlr2、或其组合。
33.在另一优选例中，c包括4-1bb来源的共刺激信号分子，和/或cd28来源的共刺激信号分子。
34.在另一优选例中，所述的细胞内信号结构域由4-1bb和cd3ζ组成，其氨基酸序列如seq id no.:6所示。
35.在另一优选例中，所述的细胞内信号结构域由cd28和cd3ζ组成在另一优选例中，所述的细胞内信号结构域由4-1bb、cd28和cd3ζ组成。
36.在另一优选例中，cd28的氨基酸序列如seq id no.:8所示。
37.在另一优选例中，4-1bb的氨基酸序列如seq id no.:10所示。
38.在另一优选例中，cd3ζ的氨基酸序列如seq id no.:12所示。
39.本发明的第二方面，提供了一种编码如本发明第一方面所述的靶向表达cldn 18.2的细胞的嵌合抗原受体的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子的核苷酸序列如seq id no.:13所示。
40.在另一优选例中，所述核酸分子含有编码如式i所示的car构建物的核苷酸序列；
41.l-scfv-h-tm-c-cd3ζ
ꢀꢀ
(式i)
42.其中，
43.l为无或信号肽序列；
44.scfv为靶向cldn 18.2的人源化单链抗体可变区序列；
45.h为无或铰链区；
46.tm为跨膜结构域；
47.c为共刺激信号分子；
48.cd3ζ为源于cd3ζ的胞浆信号传导序列；
49.各
“‑”
独立地表示连接上述各元件的连接肽或肽键。
50.在另一优选例中，所述多核苷酸分子编码如seq id no.:14所示的嵌合抗原受体的氨基酸序列。
51.在另一优选例中，所述多核苷酸分子的核苷酸序列包含编码cd8 hinge铰链区的核苷酸序列、编码跨膜结构域cd8 tm的核苷酸序列、编码细胞内信号结构域4-1bb、cd28和cd3ζ的核苷酸序列。
52.在另一优选例中，所述编码cd8 hinge铰链区的核苷酸序列如seq id no.:2所示。
53.在另一优选例中，所述编码跨膜结构域cd8 tm的核苷酸序列如seq id no.:4所示。
54.在另一优选例中，所述编码cd28的核苷酸序列如seq id no.:7所示。
55.在另一优选例中，所述编码4-1bb的核苷酸序列如seq id no.:9所示。
56.在另一优选例中，所述编码cd3ζ的核苷酸序列如seq id no.:11所示。
57.本发明的第三方面，提供了一种表达本发明第一方面所述的靶向表达cldn 18.2的细胞的嵌合抗原受体的重组表达载体，所述的重组表达载体的启动子后连接有前导肽和编码所述的嵌合抗原受体的核酸片段。
58.在另一优选例中，所述的启动子为ef1alpha启动子。
59.在另一优选例中，编码所述前导肽的核酸序列如seq id no.:15所示。
60.在另一优选例中，所述前导肽的氨基酸序列如seq id no.:16所示。
61.本发明的第四方面，提供了一种工程化的免疫细胞，所述免疫细胞含有本发明第三方面所述的重组表达载体、或染色体中整合有本发明第二方面所述的多核苷酸分子、或表达本发明第一方面所述的嵌合抗原受体。
62.在另一优选例中，所述免疫细胞为t细胞、nk细胞或其组合。
63.在另一优选例中，所述免疫细胞为t细胞。
64.在另一优选例中，所述免疫细胞为嵌合抗原受体t细胞(car-t细胞)。
65.本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的多核苷酸分子、本发明第三方面所述的重
组表达载体或本发明第四方面所述的工程化的免疫细胞，以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
66.在另一优选例中，所述药物组合物是液态的药物组合物。
67.在另一优选例中，所述药物组合物是注射剂。
68.在另一优选例中，所述免疫细胞为嵌合抗原受体t细胞(car-t细胞)
69.本发明的第六方面，提供了一种本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的多核苷酸分子、本发明第三方面所述的重组表达载体或本发明第四方面所述的工程化的免疫细胞或本发明第五方面所述的药物组合物在预防和/或治疗含有表达cldn 18.2的肿瘤细胞的癌症中的用途。
70.在另一优选例中，所述癌症选自下组：肺癌、结直肠癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、宫颈癌、子宫内膜癌、前列腺癌、小肠腺癌、口腔癌或鼻咽癌。
71.本发明的第七方面，提供了一种制备本发明第四方面所述的工程化的免疫细胞的方法，包括以下步骤：将本发明第二方面所述的多核苷酸分子或本发明第二方面所述的载体转导入免疫细胞内，从而获得所述工程化的免疫细胞。
72.在另一优选例中，所述免疫细胞为t细胞、nk细胞或其组合。
73.在另一优选例中，所述免疫细胞为t细胞。
74.在另一优选例中，所述免疫细胞为嵌合抗原受体t细胞(car-t细胞)。
75.本发明的第八方面，提供了一种预防和/或治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用治疗有效量的本发明第一方面所述的靶向表达cldn 18.2的细胞的嵌合抗原受体、本发明第四方面所述的工程化的免疫细胞、或本发明第五方面所述的药物组合物。
76.在另一优选例中，所述疾病为癌症或肿瘤。
77.在另一优选例中，所述癌症选自下组：肺癌、结直肠癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、宫颈癌、子宫内膜癌、前列腺癌、小肠腺癌、口腔癌或鼻咽癌。
78.在另一优选例中，所述需要的对象为人或非人哺乳动物。
79.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
80.图1为本发明的嵌合抗原受体的3种结构的示例图。
81.图2为本发明的实施例采用的插入有编码靶向cldn 18.2的嵌合抗原受体的核酸片段的慢病毒表达载体的结构示意图。
82.图3为插入有编码靶向cldn 18.2的嵌合抗原受体的核酸片段的慢病毒表达载体的限制性内切酶xbai酶切电泳鉴定图。
83.图4为cldn 18.2-cart细胞和对照t细胞对cldn 18.2阳性的k562肿瘤细胞的杀伤情况。
84.图5为cldn 18.2-cart细胞和对照t细胞对cldn 18.2阴性的k562肿瘤细胞的杀伤情况。
85.图6为表达靶向cldn 18.2嵌合抗原受体的t细胞分泌il-2的结果图。
86.图7为表达靶向cldn 18.2嵌合抗原受体的t细胞分泌ifn-的结果图。
87.图8为慢病毒转染第九天的car-t细胞的car病毒检测结果图。
88.图9为慢病毒转染第十六天的car-t细胞的car病毒检测结果图。
具体实施方式
89.本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地研发了一种靶向表达claudin 18.2(cldn 18.2)的细胞的嵌合抗原受体。通过体外实验证明，所述靶向cldn 18.2的嵌合抗原受体，能够有效并且特异性地靶向表达cldn 18.2表面抗原的恶性细胞(例如肿瘤细胞)，并可表达于免疫细胞例如t细胞表面，对表达cldn 18.2表面抗原的恶性细胞进行特异性杀伤，取得了比阳性对照car-t细胞更强的细胞杀伤和细胞因子释放效果。在此基础上，完成了本发明。
90.术语
91.cldn 18.2
92.cldn 18.2在正常组织表达的高度特异性及在多种癌症中被激活表达，因此针对上皮性肿瘤，cldn 18.2成为极具潜力的靶点，cldn 18.2是一种广谱性肿瘤标志物，可在多种肿瘤中表达。
93.如本文所用，“cldn 18.2阳性”指细胞表面高表达cldn 18.2，“cldn 18.2阴性”是指细胞表面低表达或不表达cldn 18.2。
94.本发明的嵌合抗原受体或car-t细胞可特异性靶向肿瘤细胞表面表达的cldn 18.2，从而杀伤肿瘤细胞。
95.抗体
96.如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(l)和两个相同的重链(h)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(vh)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(vl)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
97.如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(cdr)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(fr)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个fr区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个cdr(cdr1、cdr2和cdr3)相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的cdr通过fr区紧密地靠在一起并与另一链的cdr一起形成了抗体的抗原结合部位(参见kabat等,nih publ.no.91-3242,卷i，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
98.脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不
chain variable fragment)。scfv的大小一般是一个完整抗体的1/6。单链抗体优选是由一条核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。作为本发明的优选方式，所述抗原结合结构域包含特异性识别cldn 18.2的抗体，较佳地为单链抗体。
112.对于绞链区和跨膜区(跨膜结构域)，car可被设计以包括融合至car的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与car中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。
113.本发明的car中的胞内结构域包括4-1bb的信号传导结构域和cd3ζ的信号传导结构域。
114.多核苷酸分子和载体
115.本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白以及上述嵌合抗原受体的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。dna可以是单链的或是双链的。dna可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与seq id no.：13、2、4、7、9和11所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有与本发明的多肽相同的氨基酸序列，但与seq id no.：13、2、4、7、9和11所示的编码区序列有差别的核酸序列。
116.编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
117.术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
118.本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2
×
ssc,0.1％sds,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与seq id no..14、3、5、6、8、10和12所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
119.本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6his)融合在一起，形成融合蛋白。
120.一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的dna序列。然后可将该dna序列引入本领域中已知的各种现有的dna分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
121.本发明还涉及包含上述的适当dna序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
122.宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇s2或sf9的昆虫细胞；cho、cos7、293细胞、t细胞、nk细胞的动物细胞等。
123.嵌合抗原受体t细胞(car-t细胞)
124.如本文所用，术语“car-t细胞”、“car-t”、“本发明的car-t细胞”包括本发明第四方面中包含的car-t细胞。
125.car-t细胞较其它基于t细胞的治疗方式存在以下优势：(1)car-t细胞的作用过程不受mhc的限制；(2)鉴于很多肿瘤细胞表达相同的肿瘤抗原，针对某一种肿瘤抗原的car基因构建一旦完成，便可以被广泛利用；(3)car既可以利用肿瘤蛋白质抗原，又可利用糖脂类非蛋白质抗原，扩大了肿瘤抗原的靶点范围；(4)使用患者自体细胞降低了排异反应的风险；(5)car-t细胞具有免疫记忆功能，可以长期在体内存活。
126.如本文所用，术语“cldn 18.2-cart细胞”表示靶向cldn 18.2的car-t细胞，即在细胞表面表达结合cldn 18.2的单链抗体的t细胞。
127.本发明提供了包含靶向cldn 18.2的car的car-t细胞，如本发明第四方面所述。
128.在本发明的一个优选实施方式中，本发明利用人源化cldn 18.2scfv构建的car-t细胞，可以进一步提高其杀伤效果和肿瘤清除能力。
129.药物组合物
130.本发明还提供了一种药物组合物，包含本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的多核苷酸分子、本发明第三方面所述的重组表达载体或本发明第四方面所述的工程化的免疫细胞，以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中ph通常约为5-8，较佳地ph约为6-8，尽管ph值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：口服、呼吸道、瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。
131.本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的抗体(或其偶联物)、嵌合抗原受体、或嵌合抗原受体t细胞以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的药物组合物还可与其他治疗剂一起使用。
132.使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
133.治疗性应用
134.本发明还提供了一种如本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、如本发明第二方面所述的多核苷酸分子、如本发明第三方面所述的重组表达载体、如本发明第四方面所述的工程化的免疫细胞或如本发明第五方面所述的药物组合物在预防和/或治疗含有表达cldn 18.2的肿瘤细胞的癌症中的用途。
135.所述癌症为实体瘤，所述癌症选自下组：肺癌、结直肠癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、宫颈癌、子宫内膜癌、前列腺癌、小肠腺癌、口腔癌或鼻咽癌。
136.对于离体免疫细胞制备，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生：i)扩增细胞，ii)将编码car的核酸引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。
137.离体细胞处理程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用表达本文公开的car的载体对上述细胞进行基因修饰(即体外转导或转染)。car-修饰的细胞可被施用于哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，car-修饰的细胞相对于接受者可为自体，也可为同种异基因的、同基因的(syngeneic)。
138.本发明提供了治疗肿瘤的方法，其包括施用给需要的对象以有效量的本发明的通用型car-t细胞。
139.本发明的通用型car-t细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如il-2、il-15、il-17或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞，与一种或多种药学或临床上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如edta或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。
140.本发明的药物组合物可以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症的特征、疾病的类型和严重度,尽管适当的剂量可由临床试验确定。
141.当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的t细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重的剂量，优选105至107个细胞/kg体重的剂量(包括那些范围内的所有整数值)施用。t细胞组合物也可以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如rosenberg等，new eng.j.of med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象，治疗方案由医学领域技术人员确定。
142.对象组合物的施用可以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内、胸膜内施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的t细胞组合物优选通过i.v.静脉内注射施用。t细胞的组合物可被直接注入肿瘤，淋巴结或感染位置。(cart细胞产品以静脉输注为主，可采用直接注入肿瘤，淋巴结或感染位置)
143.在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将t细胞扩增至治疗性水平的方法活化和扩增细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦、白细胞介素-2、ifn-γ、阿糖胞苷(也已知为ara-c)等其它细胞毒化疗药物、检验点抑制剂，如pd-1抗体、抗ctla-4抗体和抑制细胞因子风暴的药物，如抗il-6受体的托珠抗体等其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的t细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(xrt)、环磷酰胺结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩增的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩增的细胞在外科手术前或外科手术后施用。
144.施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1
×
106个至1
×
10
10
个本发明的通用型car-dnt细胞，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。
145.本发明的主要优点包括
146.(1)本发明根据胃肠道肿瘤特异性高表达cldn 18.2肿瘤抗原的特点，设计靶向识别cldn 18.2的特异性抗体，采用第二代或第三代car骨架作为载体，设计靶向cldn 18.2的car-t细胞，可有效杀伤cldn 18.2阳性的肿瘤细胞，能够用于肿瘤的靶向治疗。
147.(2)本发明的claudin18.2 car-t细胞拥有比阳性对照car-t细胞更强的杀伤和细胞因子释放功能，预示着car-t细胞在体内更有效的效果。
148.(3)本发明的claudin 18.2car-t细胞在整个体外培养过程中，持续保持着很高比例的car阳性表达，表明car-t细胞在体外培养中能够保持着高比例增长，同样预示着car-t细胞能够在体内有很好的疗效。
149.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅以阐释为目的而非限制本发明的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。
150.以下实施例中未注明具体条件的实验方法可采用本领域中的常规方法，例如参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，new york：cold spring harbor laboratory press，1989)或按照供应商所建议的条件。实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。dna、蛋白的测序方法为本领域常规的方法，也可由商业公司提供测试。
151.实施例1
152.含有靶向cldn 18.2的scfv的嵌合抗原受体表达质粒的构建
153.通过人工合成seq id no.:13所示的长度为1461bp的dna片段，其中，第1-63位的核苷酸编码leader，第64-789位的核苷酸编码cldn 18.2scfv(靶向癌胚抗原的scfv)，第790-924位的核苷酸编码cd8铰链区，第925-996位的核苷酸编码cd8跨膜区，第997-1122位的核苷酸编码4-1bb，第1123-1458位的核苷酸编码cd3ζ。以上元件在核苷酸序列上的位置如图1所示。
154.将上述dna片段插入慢病毒表达载体的ef1alpha启动子下游，得到靶向cldn 18.2的嵌合抗原受体表达质粒(plv-cldn 18.2-scfv-bbz)，如图2所示。图3为插入靶向cldn 18.2的嵌合抗原受体的慢病毒表达载体的限制性内切酶xba i酶切电泳鉴定图。
155.实施例2
156.靶向cldn 18.2的嵌合抗原受体表达质粒转染t细胞
157.(1)慢病毒的包装制备
158.将嵌合抗原受体表达质粒和结构质粒、包膜质粒以3:2:1的比例用磷酸钙转法转染293t/17细胞。转染12小时后，更换含10％fbs的新鲜dmem培养基，同时加入终浓度为5mm的丁酸钠。转染48小时后，将含有病毒的细胞培养上清吸入离心管中，4℃1500rpm离心10min，转移上清至新的离心管中，0.45μm滤器过滤后-80℃保存.
159.(2)t细胞的制备
160.取10ml健康人的新鲜血液，用淋巴细胞分离液(韵飞生物)分离外周血单核细胞，具体方法见说明书。用含4％自体血清的t551培养基调整细胞密度至2x106/ml并加入终浓度为300u/ml的il-2、100ng/ml的cd3单抗诱导培养24h，得到t细胞。
161.(3)慢病毒感染t细胞及感染后t细胞的扩增培养
162.用该慢病毒液以moi 10加入含有2
×
106个上述诱导培养的t细胞的6孔板的1个孔中，在37℃，5％co2培养箱内共培养。三天之后，离心洗涤细胞，加入新鲜的含有300iu/ml的il-2、100ng/ml的cd3单抗和4％人自体血清的t551培养基，并调整细胞密度至2x106/ml继续培养。每2-3天检测一次细胞密度，离心并用新鲜培养基调整细胞密度，持续扩大培养。如此反复，直至细胞扩增至足够的用量。
163.检验嵌合抗原受体在t细胞中有效表达后，即获得针对cldn18.2的car-t细胞。
164.实施例3
165.car-t细胞对cldn18.2阳性的恶性细胞的特异性杀伤活性检测
166.取5
×
104个高表达cldn18.2的k562细胞(cldn18.2阳性，以cldn18.2-k562表示)和对照高表达cldn18.1的k562细胞(cldn18.2阴性，以cldn18.1-k562表示)接种于96孔板，分别向两种细胞培养孔中按效应细胞(effector)：靶细胞(target)＝10:1、3:1、1:1三个比例加入car-t细胞(cldn18.2-cart)、car-t阳性对照细胞(cldn18.2-cart阳性对照)和未加修饰的t细胞(t)。孵育18h后，按照ldh细胞毒性分析试剂盒(碧云天)说明书进行操作，检测car-t细胞对高表达cldn18.2的k562细胞的特异杀伤活性。结果显示car-t细胞组(组1)与car-t阳性对照细胞组(组2)和未加修饰的t细胞组(组3)相比，对高表达cldn18.2的k562细胞具有更强的杀伤作用，且这种差异具有显著性(p《0.05)(图4)；对表达cldn18.1的k562细胞的杀伤作用无显著性差异(p》0.05)(图5)。
167.实施例4
168.elisa检测ifn-γ，il-2的表达
169.取5
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104个高表达cldn18.2的k562靶细胞(cldn18.2阳性)和对照cldn18.1-k562靶细胞(cldn18.2阴性)接种于96孔板，分别向两种细胞培养孔中按效应细胞(effector)：靶细胞(target)＝3:1的比例加入car-t细胞(cldn18.2-cart)、cldn18.2-cart阳性对照细胞(cldn18.2-cart阳性对照)和未加修饰的t细胞(t)等效应细胞。孵育18h后，按照human il-2elisa kit(达科为)说明书进行操作，取上清检测il-2和ifn-γ含量。如图6和图7所
示，结果显示car-t细胞组与car-t阳性对照细胞组和t细胞组相比，在效靶比为3:1的情况下，对高表达cldn18.2的k562细胞产生大量的il-2和ifn-γ，且这种差异具有显著性(p《0.05)；高表达cldn18.1的k562的细胞对细胞因子没有诱导作用，而且无显著性差异(p》0.05)。因此car-t细胞对高表达cldn18.2的肿瘤细胞具有特异细胞因子诱导的作用。
170.实施例5
171.流式细胞术检测car-t细胞表面的car的表达
172.在慢病毒感染t细胞的第九天和第十六天，分别取3
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105claudin18.2 car-t细胞和阳性对照细胞，使用fitc-labeled goat anti-mouse-f(ab)2antibody在流式细胞仪上检测car-t细胞表面的car的表达。
173.图8显示了病毒转染第九天的car-t细胞的流式细胞仪检测图(上方是cldn18.2 car-t细胞的阳性比例66.58％；下方是阳性对照的阳性比例35.92％)。图9显示了病毒转染第十六天的car-t细胞的流式细胞仪检测图(上方是cldn18.2 car-t细胞的阳性比例78.94％；下方是阳性对照的阳性比例44.66％)。
174.结果显示car-t细胞始终维着恒定的高表达，表明car-t细胞始终维持着恒定的高比例。
175.综上所述，本发明的靶向cldn18.2的嵌合抗原受体，能够有效并且特异性地靶向表达cldn 18.2表面抗原的恶性细胞，从而为治疗一些表达cldn 18.2表面抗原的肿瘤提供更高效并且副作用和不良反应更少的方法。
176.本发明涉及的序列信息如下表所示：
177.序列信息
178.179.[0180][0181]
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
[0182]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。