鸡骨草正品及其混伪品毛鸡骨草和相思子的PCR鉴别方法与流程

鸡骨草正品及其混伪品毛鸡骨草和相思子的pcr鉴别方法
技术领域
1.本发明属于中药材鉴定技术领域，具体涉及一种鸡骨草正品及其混伪品毛鸡骨草和相思子的pcr鉴别方法。


背景技术：

2.鸡骨草，性甘、微苦，凉，有利湿退黄，清热解毒，疏肝止痛之功效，常用于湿热黄疽，胁肋不舒，胃脘胀痛，乳痈肿痛，分布于广东、广西等地。鸡骨草为蝶形花科植物广州相思子（abrus cantoniensis hance）的干燥全草，毛鸡骨草为蝶形花科植物毛相思子（abrusmollis hance）的干燥全草，来源为同科同属不同种植物。《广西中药材标准》1990年版将两个种同时收载，称“鸡骨草”。后《中国药典》2010年版收载广州相思子的干燥全草为“鸡骨草”，《广西中药材标准》1990年版“鸡骨草”质量标准失效。2008年，《广西壮族自治区壮药质量标准》（第一卷）收载毛相思子的干燥全草为“毛鸡骨草”。而这两种植物也应与同属植物相思子（学名：abrus precatorius l.）相区别。
3.据调研，由于毛鸡骨草的栽培更为容易，产量更高，目前广西种植以毛鸡骨草为主，主要集中在玉林、钦州、贵港等地区，而鸡骨草的种植较少，仅有贵港、钦州少数种植。另一种近似品相思子（学名：abrus precatorius l.）种植较少，仅在桂平、贵港地区有种植，但在该地区民间也叫鸡骨草，而农户无法分清这三个种，全部都称鸡骨草（鸡骨香、鸡骨藤）。鸡骨草种植亩产量200～300kg，而毛鸡骨草的亩产达300～500kg，产量几乎比鸡骨草高50%以上，但鸡骨草当前的价格却比毛鸡骨草高一倍，价格差异较大导致存在以毛鸡骨草掺假现象。而且由于鸡骨草与毛鸡骨草是近似种，在种植过程中，都是相邻种植没有间隔开，容易出现鸡骨草与毛鸡骨草杂交的情况。因广西民间存在鸡骨草与毛鸡骨草混用情况，调研过程中也发现有两个种掺杂种植（种源混合），也造成了非主观掺假情况。
4.由于鸡骨草和毛鸡骨草外观高度近似，仅以叶片的大小和毛多毛少来鉴别，具有主观性，高度依赖检验人员的经验，对与结果判定不利，而且由于豆科植物叶片极易脱落，大部分药材晒干后仅剩枝干，更难以鉴别容易错判，故常有以毛鸡骨草、相思子掺假作为鸡骨草售卖。目前是鸡骨草、毛鸡骨草、相思子药材鉴定主要以理化鉴别为主，但三者化学成分大体相同，主要含生物碱、黄酮类，主要成分为相思子碱、夏佛塔苷等，在薄层和含量测定项目等理化鉴别很难对正伪品做出准确的判断。因此，为保证中药药材质量和用药安全，需要一种简单可靠，能够准确快速、稳定鉴别鸡骨草正品及其混伪品的方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的是针对现有技术存在的不足而提供的一种鸡骨草正品及其混伪品毛鸡骨草和相思子的pcr鉴别方法，该鉴别方法简单易行，采用该方法能够快速准确的对鸡骨草正品及其混伪品毛鸡骨草和相思子进行区分，有效的对三者进行真伪鉴定，确保用药安全。
6.为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
一种鸡骨草正品及其混伪品毛鸡骨草和相思子的pcr鉴别方法，包括以下步骤：（1）模板dna提取：取供试品用75%乙醇/无水乙醇冲洗2次或擦拭表面，滤纸吸取多余水分，晾干；用研磨仪磨成极细粉末备用，称取干燥供试品约20 mg置1.5 ml离心管中，使用新型植物组织基因组dna提取试剂盒提取样品的dna；（2）pcr扩增反应：鉴别引物，针对正品及两个伪品都有对应的特异性引物，鸡骨草上游引物：5
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（seq id no:1），鸡骨草下游引物：5
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（seq id no:2）；毛鸡骨草上游引物：5
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（seq id no:3），毛鸡骨草下游引物：5
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（seq id no:4）；相思子上游引物：5
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（seq id no:6）；pcr反应体系：反应总体积为25 μl，反应体系包括艾德莱2x f8 longfast pcr mastermix 预混液 12.5 μl，上下游引物（10μmol/l）各0.75 μl，模板dna 1μl，无菌水10μl补足；另取等体积无菌水代替模板dna，作为空白对照；反应条件：将离心管置pcr仪，pcr反应参数：95℃预变性5分钟；循环反应35次（94℃变性15秒，x℃退火15秒，72℃延伸20秒）；72℃延伸5分钟；其中，针对鸡骨草引物，x为58；针对毛鸡骨草，x为54；相思子引物，x为62。
7.（3）琼脂糖电泳检测：照琼脂糖凝胶电泳法（通则0541），配置2%琼脂糖电泳，胶中加入核酸凝胶染色剂gelred,取产物3ul进行上样，dna分子量标记上样量为2.5μl，电泳结束后在在凝胶成像仪上进行检视；供试品凝胶电泳图中，在与对照药材凝胶电泳相应的位置上：鸡骨草和毛鸡骨草在100～200bp间有明显条带，相思子引物扩增的产物在200～300bp间有明显条带，空白对照无条带。
8.上述的鸡骨草正品及其混伪品毛鸡骨草和相思子的pcr鉴别方法，步骤（1）中使用新型植物组织基因组dna提取试剂盒提取样品的dna的具体提取步骤如下：
①
采用天根高效植物基因组dna提取试剂盒，dp350，在装有供试品的离心管中加入400 μl缓冲液fga，涡旋震荡混匀，室温放置10分钟；加入130 μl缓冲液lp2，充分混匀，涡旋振荡1分钟；12,000rpm离心5分钟，小心将上清转移至新的1.5ml离心管里；
②
加入1.5倍体积的缓冲液lp3，立即充分震荡混匀15秒；将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中（吸附柱放入收集管中），12,000 rpm离心30秒，倒掉废液，吸附柱cb3放入收集管中；向吸附柱cb3中加入600 μl漂洗液pw，12,000 rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中；
③
重复上一步漂洗过程；将吸附柱cb3放回收集管中，12,000 rpm离心2分钟，倒掉废液；将吸附柱cb3置于室温放置2分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；将吸附柱cb3转入一个干净的1.5ml离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50 μl洗脱缓冲液tb（tb已预先在金属浴中加热至65℃），室温放置5分钟，12,000 rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中；
④
小心把离心管中所得全部溶液重新悬空滴加至cb3的吸附膜的中间部位，室温
放置5分钟，12,000 rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中；阳性对照模板dna溶液，亦按照上述方法进行。
9.本发明的有益效果为：本发明通过找出特异性dna片段，设计出特异性引物，通过pcr技术扩增出特异性片段，以对鸡骨草正品及其混伪品毛鸡骨草和相思子进行区分，能够有效的对三者进行真伪鉴定。本发明克服了传统的形态学鉴定、理化鉴定等鸡骨草鉴别方法存在的不足，采用本发明方法无需依赖药材检验人员的经验，即可对市场中鸡骨草正品及其混伪品毛鸡骨草和相思子进行有效鉴别，对鸡骨草、毛鸡骨草易混伪品做出准确判定，有效的补充完善了鸡骨草、毛鸡骨草的药材标准，有助于实现鸡骨草药材市场的健康发展。
10.本发明提供的一种鸡骨草正品及其混伪品毛鸡骨草和相思子的pcr鉴别方法，该方法简单易行，稳定可靠、结果准确、成本低，而且对鉴别人员实验操作要求低，客观性强，采用该方法能够快速准确的对鸡骨草正品及其混伪品毛鸡骨草和相思子进行真伪鉴定，确保用药安全。
附图说明
11.图1 its2片段比对；图2 psba-trnh比对；图3退火温度考察54℃、56℃胶图；图4退火温度考察58℃、60℃胶图；图5退火温度考察62℃、64℃胶图；图6 毛鸡骨草引物、鸡骨草引物酶种类考察图；图7相思子引物酶种类考察图；图8 反应循环数考察；图9 鸡骨草引物适应性考察；图10 鸡骨草引物专属性考察；图11 毛鸡骨草引物适应性考察；图12毛鸡骨草引物专属性考察；图13 相思子引物适应性考察；图14 相思子引物专属性考察（鸡骨草样品）；图15 相思子引物专属性考察（毛鸡骨草样品）。
具体实施方式
12.实施例1由于ncbi上并无公开的鸡骨草、毛鸡骨草和相思子的基因组信息，只有零星的dna条形码序列，加之无法确定上传至ncbi的序列对应的基源是否正确，所以，我们采集到鸡骨草、毛鸡骨草和相思子样品，并通过基源鉴定确定了品种。对上述样本进行dna抽提和质检，用its2、rbcl和psba-trnh等常见dna条形码引物进行扩增并测序，去除低质量区域数据，合并测序结果并导入到mega中进行比对，查找有差异的片段区域，设计特异性引物进行扩增和琼脂糖电泳检测。
13.1材料1.1 三个品种样本收集自广西区内，主要来自企业种植基地、普通农户自家田地散种以及野外采集。样品由广西食品药品检验所黄清泉主管药师鉴定，凭证标本保存于广西食品药品检验所标本室，见表1～3。
50ng，无菌水补足25 μl。pcr反应程序为95℃预变性5分钟；94℃变性15秒，x℃退火30秒，72℃延伸30秒，此阶段运行35个循环；72℃延伸5分钟。 其中，its2引物，x为56；另两对引物，x为55。所得产物送至测序公司进行双向测序。
18.2.4差异序列获得去除测序低质量数据，并完成双向序列的拼接。把拼接后的序列带入到mega中进行比对，采用muscle算法，参数默认。j31～j34为相思子，j35、j36为毛鸡骨草，j37～j41为鸡骨草。
19.结果rbcl引物得到的产物无差异；its2相思子与其他的有一定差异，但鸡骨草和毛鸡骨草基本上是不连续的单碱基差异，见图1。psba-trnh相思子与其他的有一定差异，但鸡骨草和毛鸡骨草基本上是不连续的单碱基差异，但在鸡骨草产物的第226个碱基至第229个碱基为ttat，毛鸡骨草处缺失了这4个碱基。见图2。
20.2.5 特异性引物设计对于上述两个差异引物，设计出相思子的特异性引物比较容易，但是要设计出通过琼脂糖电泳检测来区分鸡骨草和毛鸡骨草的引物难度还是很高，我们选择psba-trnh的区域进行，因为鸡骨草和毛鸡骨草在此区域有ttat的差异。对鸡骨草我们调试了6对引物，见表5，最终第六对引物可以特异性的扩出鸡骨草而扩不出毛鸡骨草和相思子；对毛鸡骨草我们调试了5对引物，见表6，最终第五对引物可以特异性的扩出毛鸡骨草而扩不出鸡骨草和相思子；对相思子我们调试了2对引物，见表7，最终第二对引物可以特异性的扩出相思子而扩不出鸡骨草和毛鸡骨草。
21.3、方法学验证pcr体系为25 μl，预混液12.5 μl，上下游引物（10μmol/l）各0.75 μl，模板dna 10-50ng，无菌水补足25 μl。pcr反应程序为95℃预变性5分钟；94℃变性15秒，x℃退火15秒，72℃延伸20秒，此阶段运行35个循环；72℃延伸5分钟。 方法学验证试验样本分别为j8（鸡骨草j）、j26（毛鸡骨草m）、j30（相思子x）。
22.3.1 退火温度考察使用艾德莱2x f8 longfast pcr mastermix酶，按上述反应体系，退火温度分别考察了54℃、56℃、58℃、60℃、62℃、64℃，经试验，针对鸡骨草引物，x为58℃；针对毛鸡骨草引物，x为54℃；针对相思子，x为62℃较为适宜，对目标样品均有明显的单一扩增条带, 其余阴性样都没有扩增条带，见图3～5。说明在退火温度分别58℃、54℃、62℃时，其反应均有高度特异性，依据相应的鉴别引物扩增模板dna有无条带即可确定受试样品的种类。
23.3.2 酶的种类考察
由于鸡骨草和毛鸡骨草差异区域很少，pcr体系对于温度和试剂比较敏感。通过尝试包括2x f8 longfast pcr mastermix（艾德莱）、primestar max dna polymerase（takara）、kod onetm pcr master mix（toyobo）、platinu ii hot-start green pcr master mix (thermofisher) 等不同品牌的酶，最终确认除了艾德莱2x f8 longfast pcr mastermix，其余的酶在规定的退火温度下，三个品种无法有效鉴别，故最后须指定艾德莱2x f8 longfast pcr mastermix才能达到鉴别要求。见图6～7。
24.3.3 反应循环数考察三个品种分别在各自的反应体系下考察了30～35个循环，均能得到明显亮度的单一条带，说明30个循环已达到扩增浓度。见图83.4 仪器品牌考察 因实验室条件限制，只考察了2个品牌的pcr仪，分别为梯度pcr扩增仪（abi veriti）和梯度pcr扩增仪（ta96sg,德国耶拿），结果均能得到很好的扩增效果，说明该方法对仪器没有特殊要求。见图8～11。图8为梯度pcr扩增仪（abi veriti），图9～11为梯度pcr扩增仪（ta96sg，德国耶拿）3.5 适用性及专属性考察 针对摸索好的实验条件，对所有采集到的样本及混伪品进行验证，结果显示相应的引物扩增目标样本均出现条带，而其他混伪品均未见扩增带。表明适应性好，能达到对三个品种进行鉴别 。见图9～15。
25.4 结果与分析4.1由于鸡骨草和毛鸡骨草外观高度近似，仅以叶片的大小和毛多毛少来鉴别，具有主观性，高度依赖检验人员的经验，对与结果判定不利，由于豆科植物叶片极易脱落，大部分药材晒干后仅剩枝干，更难以鉴别容易错判，故常有以毛鸡骨草、相思子掺假作为鸡骨草售卖。目前是鸡骨草、毛鸡骨草药材鉴定主要以理化鉴别为主，但三者化学成分大体相同，主要含生物碱、黄酮类，主要成分为相思子碱、夏佛塔苷等，在薄层和含量测定项目等理化鉴别很难对正伪品做出准确的判断。本实验通过找出特异性dna片段，设计出特异性引物，通过pcr技术扩增出特异性片段，以对三个混伪品进行区分，能够有效的对三者进行真伪鉴定。
26.4.2 由于鸡骨草与毛鸡骨草均作为药材使用，进行大面积种植，经调研，大部分经营户都同时种植两个品种，且在相邻的两块地，在种植过程中均无法做到生殖隔离，同域分布、生态特征相似的近缘植物类群间容易出现杂交的情况。在采集样本中也发现，在混种基地采集的样本偶有同时具有鸡骨草和毛鸡骨草的性状特征，即叶片很小但毛量较多，这给基原鉴定带来较大困难，如j12、j14外观更近似鸡骨草，但叶片毛较稀疏但比鸡骨草更多又没有毛鸡骨草那么密集，经dna测序结果为毛鸡骨草，用毛鸡骨草引物能扩出条带，而鸡骨草引物未能扩出条带。该方法无需依赖药材检验人员的经验，有效补充完善鸡骨草、毛鸡骨草的药材标准，能对鸡骨草、毛鸡骨草易混伪品做出准确判定，有助于实现鸡骨草药材市场的健康发展。
27.实施例2一种鸡骨草正品及其混伪品毛鸡骨草和相思子的pcr鉴别方法，包括以下步骤：（1）模板dna提取：取供试品用无水乙醇冲洗2次，滤纸吸取多余水分，晾干；用研磨仪磨成极细粉末备用，称取干燥供试品约20 mg置1.5 ml离心管中，使用新型植物组织基因组dna提取试剂盒提取样品的dna，具体提取步骤同实施例1中2.1 部分采用新型植物组织基因组dna提取
试剂盒（dp350）提取样品的dna的具体提取步骤。
28.（2）pcr扩增反应：鉴别引物，针对正品及两个伪品都有对应的特异性引物，鸡骨草上游引物：5
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（seq id no:1），鸡骨草下游引物：5
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（seq id no:2）；毛鸡骨草上游引物：5
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（seq id no:3），毛鸡骨草下游引物：5
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（seq id no:4）；相思子上游引物：5
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gtttttgaaagtaaaggagcaatatcaacag-3’（seq id no:5），相思子下游引物：5
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（seq id no:6）；pcr反应体系：反应总体积为25 μl，反应体系包括艾德莱2x f8 longfast pcr mastermix 预混液 12.5 μl，上下游引物（10μmol/l）各0.75 μl，模板dna 1μl，无菌水10μl补足；另取等体积无菌水代替模板dna，作为空白对照；反应条件：将离心管置pcr仪，pcr反应参数：95℃预变性5分钟；循环反应35次（94℃变性15秒，x℃退火15秒，72℃延伸20秒）；72℃延伸5分钟；其中，针对鸡骨草引物，x为58；针对毛鸡骨草，x为54；相思子引物，x为62。
29.（3）琼脂糖电泳检测：照琼脂糖凝胶电泳法（通则0541），配置2%琼脂糖电泳，胶中加入核酸凝胶染色剂gelred,取产物3ul进行上样，dna分子量标记上样量为2.5μl，电泳结束后在在凝胶成像仪上进行检视；供试品凝胶电泳图中，在与对照药材凝胶电泳相应的位置上：鸡骨草和毛鸡骨草在100～200bp间有明显条带，相思子引物扩增的产物在200～300bp间有明显条带，空白对照无条带。