一种用于外泌体示踪的转基因小鼠模型的构建及应用

1.本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种用于外泌体示踪的转基因小鼠模型的构建方法及应用。


背景技术：

2.crispr-cas系统是原核生物的一种天然免疫系统，某些细菌或古细菌在遭到病毒入侵后，能够把病毒基因的一小段存储到自身的dna里一个称为crispr的存储空间；当再次遇到病毒入侵时，细菌能够根据存写的片段识别病毒，将病毒的dna切断而使之失效；crispr-cas9的机制就是驱动免疫作用，他的作用机理可以分为三个阶段来理解1.获得：通过摄取外源dna序列，并将其整合为新的crispr间隔区而产生免疫；2.表达：crispr序列在前导区的调控下转录产生pre-crrna(crrna的前体)，和与pre-crrna序列互补的tracrrna (反式激活crrna)；pre-crrna通过碱基互补配对与tracrrna形成双链rna并与cas9编码的蛋白组装成一个复合体；3.干扰：crrna-cas核糖核蛋白复合物将扫描整个外源dna序列，并识别出与crrna互补的原间隔序列；这时，复合物将定位到pam/原间隔序列的区域， dna双链将被解开，形成r-loop；crrna将与互补链杂交，而另一条链则保持游离状态；随后，cas9蛋白精确的平端切割位点位于pam上游3个核苷酸位置，形成平末端产物；cas9 蛋白的hnh结构域负责切割与crrna互补配对的那一条dna链，而ruvc结构域负责切割另外一条非互补dna链；最终在cas9的作用下dna双链断裂(dsb)。
3.在通常情况下，细胞会采用高效的非同源末端连接方式(nhej)对断裂的dna进行修复；但是，在修复过程中通常会发生碱基插入或缺失的错配现象，造成移码突变，(移码突变：是指dna分子由于某位点碱基的缺失或插入，引起阅读框架变化，造成下游的一系列密码子改变，使原来编码某种肽链的基因变成编码另一种完全不同的肽链序列；)使靶标基因失去功能，从而实现源dna的表达被沉默。
4.目前crispr/cas9系统以应用面广，操作简单，效率高等优势广泛应用于动物，植物，微生物以及人类细胞中；利用基因编辑技术在构建基因敲除小鼠、遗传性疾病研究、抗病毒研究、癌症研究、功能基因筛选、转录调控研究、单分子标记研究和基因治疗研究等领域中有着广泛应用。
5.外泌体是一种起源于胞内多囊体、由细胞主动分泌大小为30～150nm的脂质双分子层小囊泡；外泌体表面携带来源细胞膜上的相应抗原，内部包含来源母细胞胞内的多种小分子，包括蛋白质、dna及rna等；外泌体广泛的存在包括尿液、唾液、血液和积液，乳汁，羊水，腹水等多种体液中；在细胞之间进行信息交流并发挥调控功能
6.随着细胞生物学和医学的不断发展，外泌体的研究越加深入，已有不少文献报道了外泌体作为一种天然内源性药物载体的重要应用；和传统的病毒载体及非病毒载体相比，外泌体作为传递信号分子的载体具有免疫原性低，运载药物的效率高，渗透滞留效应(epr)强，具有一定的靶向性，可以更好的渗入到肿瘤或炎症部位，以及外表面有着区别于普通合成的脂质体的复杂而特殊的蛋白及磷脂双分子层结构，有利于保护所负载的药物避
免被网状内皮系统捕获，获得更长的体内循环时间，实现被动靶向等优点；但是，在利用外泌体作为基因药物的载体前，我们必须对于外泌体药物在体内的分布和降解过程进行研究，所以迫切需要一种动物模型用于外泌体的体内示踪。


技术实现要素：

7.本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种用于外泌体示踪的转基因小鼠模型的构建；众所周知，crispr/cas9系统由cas9蛋白/crrna/tracr rna，三者共同构成，在我们的前期研究中，我们发现采用张峰等人的发明，tracrrna和crrna在被融合为单链向导rna (sgrna)指导cas9的靶向我们的目的序列；我们前期的实验发现了，sgrna或crrna可以被包裹在外泌体中运送至靶细胞；基于这个发现，我们设计了如下外泌体示踪系统：该系统包括外泌体供体和外泌体受体两部分组成；在供体中，我们稳定表达crrna或sgrna；在受体中，我们稳定表达tracrrna、cas9蛋白和stop-egfp元件；该stop元件可以特异性的被在供体中表达的sgrna或crrna识别并切割；由于stop元件的存在，egfp发生移码突变不能翻译成有功能的蛋白质，此时受体表现为不发出绿色荧光，当接收到包含着sgrna/crrna 的外泌体时，sgrna和cas9蛋白组合成核蛋白复合体，在stop两侧发生切割，egfp正常表达，受体发出绿色荧光；crrna则可以和tracrrna先进行结合形成sgrna，再和cas9蛋白结合；在此基础上，我们构建了具有外泌体示踪功能的转基因小鼠模型，在小鼠中稳定表达 stop-egfp-cas9-tracrrna元件，制成具有外泌体示踪功能的工具；
8.本发明的有益效果是：1.利用该发明可以直观的观察到外泌体在体内的分布状况，为外泌体的研究以及疾病状态下外泌体分布的研究提供了良好的工具；2.利用该发明可以检验被作为药物载体的外泌体被输入动物体后的组织分布；3.已确定外泌体药物载体的安全性；
附图说明
9.图1小鼠模型构建示意图
10.图2供体元件表达质粒图谱
11.图3受体元件表达质粒图谱
12.图4外泌体中crrna和sgrna的q-pcr表达
13.图5 f0代小鼠pcr鉴定电泳条带图，其中wt为野生型小鼠基因型，marker为20bp的 dna marker
14.图6.来源编号为f0-17的f2代小鼠pcr鉴定电泳条带图
15.图7.来源编号为f0-20的f2代小鼠pcr鉴定电泳条带图
16.图8.来源编号为f0-35的f2代小鼠pcr鉴定电泳条带图
17.图9示踪外泌体转基因小鼠模型验证双光子显微镜图
具体实施方式
18.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件；下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制；
19.实施例1 构建表达stop-egfp-cas9-tracrrna元件的质粒(外泌体受体质粒)
20.构建表达stop-egfp-cas9-tracrrna元件的质粒，该质粒包含stop-egfp-cas9-tracrrna 等元件，用于构建外泌体受体；其中质粒载体包含cas9蛋白序列，我们需要在质粒载体中插入stop-egfp序列和tracrrna序列即可，具体操作方法如下
21.将质粒载体双酶切，跑1％琼脂糖凝胶并胶回收较大的基因片段；全基因合成stop-egfpdna序列和tracrrna dna序列；双酶切双链stop-egfp序列，过柱回收酶切产物，然后将经过双酶切的载体和片段连接起来，转化到dh5α中经挑菌、测序后，筛选出构建成功的克隆；将上一步获得的测序正确的克隆用单酶切开，把tracrrna dna序列通过同源重组连进载体，再次转化到dh5α中经挑菌、测序后，筛选出构建成功的克隆。
22.实施例2 构建表达crrna或sgrna的质粒(外泌体供体质粒)
23.构建表达crrna或sgrna的质粒，该质粒包含crrna-1/crrna-2或sgrna-1/sgrna-2；用于构建外泌体供体；在质粒载体的u6启动子后面插入crrna/sgrna序列即可，具体操作如下：
24.双酶切质粒载体，跑1％琼脂糖凝胶并胶回收较大的基因片段，设计靶向stop序列的 crrna-1和crrna-2序列并通过体外退火成oligo双链，将crrna-1和crrna-2基因片段与双酶切质粒载体酶连，经转化、测序后，筛选出构建成功的克隆。
25.实施例3 供体细胞的构建和外泌体的验证
26.供体细胞的构建分为两个部分，第一部分用工具细胞hek 293t细胞来制备表达供体元件的慢病毒，获取病毒悬液，第二部分将获取的病毒悬液侵染人非小细胞肺癌a549细胞，经过药筛后挑取稳转单克隆细胞株，扩培收集外泌体并检测；具体操作如下
27.1.将opti-mem，lipo2000/pei，目的质粒，辅助质粒按照一定的比例混匀静置20分钟之后缓慢滴加到生长密度为70％～80％的hek 293t细胞培养皿中，6h后换成10％fbs的新鲜完全培养基；48h后于生物安全柜收集细胞培养基(其中含有慢病毒)，并用0.45μm 的滤器过滤，得到病毒上清液，用于侵染目的细胞。
28.2.用第一步获得的慢病毒悬液侵染a549细胞，侵染36-48h后加入适宜浓度的抗生素进行药筛；药筛维持两周后，挑取单克隆细胞，扩培，收集上清液，采用密度梯度离心法得到外泌体，外泌体用pbs溶液溶解后，再用trizol reagent溶液提取外泌体中的rna，将提取的rna，用茎环法逆转成cdna，再用荧光定量pcr法检测外泌体中crrna/sgrna的含量；结果表明，外泌体内也包含crrna/sgrna。
29.实施例4 转基因小鼠构建，繁育及鉴定
30.将实施例1中构建成功的受体质粒，交给赛业(苏州)生物科技有限公司，通过受精卵显微注射法构建转基因小鼠；待f0代小鼠长到8周时，取小鼠鼠尾提取基因组，根据我们构建的g2的质粒中各种元件的序列，设计引物把目的序列进行扩增，并把扩增出来的pcr产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果我们可以得出f0代中编号为17，20，35的小鼠为阳性杂合子转基因小鼠。
31.转基因小鼠的繁育具体操作是将f0代小鼠达到性成熟后(8周)与野生型小鼠进行交配，获得f1代小鼠；将来自同一只f0的阳性f1代小鼠同胞交配，可获得f2代小鼠，对获得的f2代小鼠进行pcr和琼脂糖凝胶鉴定，基因型鉴定为纯合子的f2代小鼠就是我们所需构建的全身性表达stop-egfp-cas9-tracrrna的示踪模型小鼠，上诉f0，f1，f2代小鼠的pcr鉴
定的引物全部一样；结果表明来源f0-17小鼠的f2代中编号为1，2，3的小鼠为阳性鼠，来源f0-20小鼠的f2代中编号为2，6，7，8，10的小鼠为阳性鼠；来源f0-35 小鼠的f2代中编号为1，2，4，5的小鼠为阳性鼠。
32.实施例5 示踪外泌体转基因小鼠模型验证
33.将实施例三中验证成功的供体细胞大量扩培，提取外泌体，给实施例五种转基因小鼠的尾静脉注射外泌体，取小鼠的肝脏部分器官进行切片后使用双光子激光共聚焦显微镜观察；观察结果表明肝脏中有绿色荧光，表明该动物模型构建成功。
34.上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围；凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围。