一种用于银龙鱼性别鉴定的SNP分子标记及其应用的制作方法

一种用于银龙鱼性别鉴定的snp分子标记及其应用
技术领域
1.本发明涉及鱼类性别鉴定技术领域，更具体地，涉及一种用于银龙鱼性别鉴定的snp分子标记及其应用。


背景技术：

2.银龙鱼又称双须骨舌鱼，是一种古老的“活化石”鱼类，作为名贵的观赏鱼具有十分重要的经济价值。目前，国内绝大多数的银龙鱼都是依赖进口，银龙鱼难以实现本土的大量养殖；因为目前银龙鱼繁殖技术受限，难以实现人工大量养殖。而限制繁殖技术的主要原因就体现于银龙鱼雌雄性别区分上的困难。
3.银龙鱼不具有两性特异性特征，在外部形态上不能区分，即使是在生殖季节，雌雄性鱼的特征也不明显。而且由于银龙鱼具有坚硬厚实的鳞片，通过b超，ct等手段也无法穿透鳞片而判定性别。目前，只能通过解剖观测性腺进行鉴定，无法实现简单、准确而又不需解剖即能鉴定的方法。正是由于没有准确判定性别的手段，才对该鱼的人工繁殖造成了很大的困扰；因为性别难以区分，大多数养殖场只能采用半自然的方法进行繁殖，而不能采用较高效可控的人工繁殖方式，例如雌雄鱼分塘暂养，注射催情剂和催产剂等，大大限制了繁殖效率和成功率。为了打破我国银龙鱼全部依赖进口的局面，银龙鱼的人工繁殖就成了急需解决的问题。
4.所以，亟需一种有效的银龙鱼性别鉴定方法或标记以区分银龙鱼雌雄性别，从而克服上述问题。


技术实现要素：

5.本发明旨在克服上述现有技术的至少一种不足，提供一种用于银龙鱼性别鉴定的snp分子标记及其应用，通过本发明的snp位点能够在不剖解银龙鱼的前提下实现准确、快速的性别鉴定，从而不影响银龙鱼的正常生长、繁殖，当该snp位点应用于银龙鱼的养殖时，便于提供性别鉴定而促进养殖技术的成熟和发展，提高繁殖率和成功率。
6.本发明提供了一种用于银龙鱼性别鉴定的snp分子标记，碱基序列为：seq id no.1，长度为373bp；所述snp分子标记为seq id no.1中第271位。
7.进一步地，当第271位碱基为a/g杂合时，样品为雄性，为a/a纯合时，样品为雌性。 seq id no.1仅为展示上述变化之一的代表性序列，对应其他包含上述变化的序列也应被保护。
8.本发明还提供一种用于鉴定或辅助鉴定银龙鱼性别的引物对，包括上游引物f和下游引物 r，所述上游引物f的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述下游引物r的核苷酸序列如seqid no.3所示。
9.本发明还提供一种用于鉴定或辅助鉴定银龙鱼性别的试剂盒，含有上述的引物对、dntp 以及dna聚合酶。
10.本发明还提供一种银龙鱼性别鉴定方法，包括以下步骤：
文库。然后采用illumina novaseq测序平台对基因组进行高通量测序，每样品测序量为30gb，测序策略为pair-end 150bp。
24.采用高通量测序序列比对策略，检测测序的雌性样品的单核苷酸多态性位点(snp)和雄性样品的单核苷酸多态性位点(snp)，并筛选雌性样品之间完全相同，雄性样品之间完全相同，且雌雄样品不同的snp位点作为性别鉴定分子标记。
25.根据高通量测序对雌性样品和雄性样品进行特异dna分子标记筛选，发现其基因序列含有区分性别的snp分子标记。在此基础上，依据高通量测序数据结合引物进行扩增，以获得包含snp位点且能用于pcr、sanger测序而鉴定银龙鱼雌雄性别的序列，具体的，引物包括序列如seq id no.2所示的上游引物f和序列如seq id no.3所示的下游引物r，获得的包含snp位点的序列如seq id no.1所示。且所述snp分子标记为seq id no.1中第271 位。
26.具体的，表现于序列中如下所示：
27.agtaccgtcctggacatcagctgagataaatggacagttttcccagaagaagatcccgatctaacctaaaacaaaccc atttgaacactgaaaaattcacctatattttgaaagttacacaactcatcactttaaagcaataggcgtggacaatatacctgtgggcggagcttcg gggctctatcacagccatcaaaagtgaatgtatcaatcgagtgcagtacagcataaaatgggattcaaacctgtgtccttcaaacacaaagtgcc [a/g]ggtctaaccacgaatgccacctactgacgggctctgcgttatagatctgtccaccattcccgtgccagtgtggaaagggaacacta gacacgattcacccag。为方便表示，以大写字母突出特殊位点，上述序列中，大写字母为引物序列或snp位点。
[0028]
引物信息如下表所示：
[0029][0030]
且在上述包含snp位点的序列中，snp位点与雌雄的对应关系如下表所示：
[0031]
序号标记类型位置雄性基因型雌性基因型1snp标记271agaa
[0032]
由此，所述snp分子标记能用于区分银龙鱼的雌雄性别。实施例2
[0033]
为了验证snp位点鉴别银龙鱼性别的准确性，本实施例则进行了实施例1中snp分子标记的验证，通过pcr及sanger测序的方法验证银龙鱼检测的分子标记是否准确。具体的，从非高通量测序样本中，提取基因组dna，通过pcr和sanger测序的方式验证引物的特异性，并与银龙鱼样本的生理学性别相互对照，确认实施例1中的snp分子标记、引物是否能够用于银龙鱼性别鉴定。
[0034]
1、样本准备
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选择银龙鱼样本60份，含30份雌性样品和30份雄性样品，进行验证，下表为样品信息：
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实验验证样品
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2、基因组dna提取
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采用通用型柱式基因组dna提取试剂盒进行提取，所述dna提取试剂盒购自北京康为世纪科技有限公司，货号：cw2298m，提取过程参照试剂盒说明书进行。
[0040]
3、pcr扩增
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1)试剂耗材
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dna聚合酶：2*taq mastermix(dye)(购自北京康为世纪科技有限公司,货号:cw0682l)；步骤2中提取的待测样本基因组dna；primer：包括primerf和primerr，primerf、primerr 核苷酸序列分别如seq id no.2、seq id no.3所示，由华大基因合成；ddh2o。
[0043]
2)pcr反应体系(如下表所示)
[0044][0045]
3)pcr反应条件(如下表所示)
[0046][0047]
4、琼脂糖凝胶图
[0048]
检测pcr扩增是否成功，进行琼脂糖凝胶电泳。具体的，条件包括：胶浓度1％、电压 180v、时间20min；marker：m为dm2000，购自北京康为世纪科技有限公司，货号：cw0632m； m1为super dna marker，购自北京康为世纪科技有限公司，货号：cw2583m。pcr产物的电泳结果如图1所示。
[0049]
5、sanger测序鉴定结果
[0050]
在pcr扩增后，进行sanger测序分析。结果如下表所示，依据snp位点反应的雌雄性别信息与生理学解剖而确认的性别信息一致。即能通过上述引物f、r以及包含snp位点的序列能实现准确的银龙鱼雌雄性别鉴定，且相较于传统的雌雄鉴别，不需要进行生物剖解。
[0051]
样品测序基因型性别判定与解剖基因型性别判定结果对照
实施例3
[0052]
本实施例提供了一种银龙鱼性别鉴定方法，包括以下步骤：
[0053]
(1)提取待测银龙鱼的基因组dna；
[0054]
(2)以待测银龙鱼的基因组dna为模板，利用序列分别如seq id no.2、seq id no.3 所示的上游引物f和下游引物r，进行pcr扩增反应；
[0055]
(3)反应完成后结合sanger测序进行分析，确定样品基因型，依据序列seq id no.1 中第271位鉴定性别。
[0056]
具体的，步骤(2)pcr扩增反应时采用的反应体系、扩增程序与实施例2中相同。实施例4
[0057]
本实施例中，提供序列如seq id no.1所示snp分子标记、序列分别如seq id no.2、 seq id no.3所示的上游引物f和下游引物r、包含引物f、r的试剂盒和/或实施例3的鉴定方法在银龙鱼性别鉴定和/或银龙鱼养殖中的应用。
[0058]
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。