水稻耐盐胁迫基因OsAGL16及其编码蛋白的应用

水稻耐盐胁迫基因osagl16及其编码蛋白的应用
技术领域
1.本发明属于植物基因工程领域，特别涉及水稻中提高耐盐胁迫能力的基因及其编码蛋白在农业中的应用。本发明涉及的osagl16基因在水稻耐盐胁迫能力的增强以及产量的提高方面具有重要的应用价值。


背景技术：

2.盐胁迫妨碍作物的正常生长，限制作物产量潜力的正常发挥，是影响全球农作物生产的严重问题。据统计，在影响作物产量的各种环境因素中，干旱和盐碱所造成的减产程度高达40％以上。中国盐碱土壤面积高达2000万hm，并且随着干旱的频繁发生和灌溉方法的不当造成了次生盐碱化面积日益扩大，再加上近年淡水资源严重不足，中国干旱，半干旱及滨海地区的粮食生产受到严重威胁。因此，如何开发和利用盐碱化土壤，提高作物产量和品质已成为盐碱地农业中急待解决的重要问题。水稻是一种对盐碱中度敏感的作物，土壤盐碱化是盐碱稻作区水稻生产稳定发展的主要限制因素。深入开展水稻耐盐碱性研究，培育具有抗盐碱胁迫能力的水稻品种，对发挥水稻品种在盐碱稻作区的产量潜力，进一步扩大水稻的可种植面积，保证盐碱稻作区粮食的安全生产和提高人民的生活水平以及改善生态环境具有十分重要的意义。
3.盐胁迫对植物的有害影响主要是由于体内水分的缺失而引起的渗透胁迫，以及过量的离子对体内生化过程造成的损害。植物细胞能既能感知到盐胁迫导致的高渗性，也能感知离子特异性信号。细胞外na

可以被膜受体感知，而细胞内na

被感知可能是通过膜蛋白或胞质内的na
-sensitive酶。质膜上的sos1被认为是一种可能的na

传感器。盐胁迫会直接引发细胞质钙信号并激活sos信号通路。虽然在na

运输调控过程中离子特异性信号可能比高渗性更重要，但渗透胁迫也起作用非常重要的作用。渗透胁迫激活了aba的合成信号，上调编码液泡中na

/h

交换器nhx1的转录。同时，渗透胁迫也可以在一定程度上通过牵张激活离子通道或跨膜蛋白激酶如组氨酸激酶和细胞壁相关激酶等被感知。
4.高盐引起的植物细胞内离子稳态的不平衡与质膜上和液泡中离子运进和运出有直接的关系。为了对高浓度的盐具有耐受的能力，植物可以利用不同离子进行渗透调节，并在植物体内将这些离子分配，使钠离子远离新陈代谢的位置。之前的研究表明，耐盐植物中na

被隔离到液泡，通过对液泡中的na

/h

反向运输，提供一种有效的机制来避免na

对细胞质的影响以及将维持渗透平衡。某些植物在盐胁迫的条件下，可以通过调节h

泵的传输动力和na

/k

的表达，使细胞质维持一个低na

和高k

的保护环境。而对于有些淡土植物，当受到盐胁迫后，植物体内细胞不能有效的将有毒害的离子如na

隔离到液泡中或者其他不活跃的部位，导致地上活跃部位对高浓度的na

表现出更加敏感。因此，为了维持一个适合的离子浓度，植物不仅要从细胞水平，而且还要从整个植株水平上去调控地上地下不同部位的离子浓度。
5.mads-box家族基因广泛存在于植物、动物、真菌、酵母中。植物中mads-box基因几乎参与了植物整个生命周期的调控过程，之前的研究已经证明了该家族基因在调控胚的发
育、种子萌发、根系的发育、气孔的运动及分布、以及花器官的形成方面有重要的作用。本发明通过基因工程技术，克隆并优化了mads-box基因osagl16，利用该基因进行水稻遗传转化并鉴定了转基因植株耐盐胁迫的能力。


技术实现要素：

6.本发明人在研究中发现osagl16基因能够增强植物耐盐胁迫和产量的能力。在此基础上，本发明人完成了本发明。
7.本发明的目的之一是鉴定一种能提高水稻耐盐胁迫能力和产量的基因及其编码蛋白。本发明的另一个目的是确定该鉴定的水稻基因在培育具有耐盐胁迫能力且产量增加的植物方面的应用，以及提供一种利用该鉴定的水稻耐盐胁迫基因培育具有提高耐盐胁迫能力且产量增加的植物的方法。
8.因此，在第一方面，本发明鉴定了一种耐盐胁迫的基因osagl16，其编码seq id no.2所示的氨基酸序列。
9.在一个优选的方面，所述耐盐胁迫的基因osagl16的核苷酸序列为seq id no.1所示的dna序列。
10.在第二方面，本发明提供耐盐胁迫基因oagl16编码的蛋白，所述osagl16蛋白是由seq id no.2所示的氨基酸序列组成的蛋白。
11.其中，seq id no.2由240个氨基酸残基组成。
12.在第三方面，本发明涉及包含耐盐胁迫基因osagl16的表达载体；包含耐盐胁迫基因osagl16的转基因细胞系；包含耐盐胁迫基因osagl16的宿主细胞。其中所述宿主细胞为微生物细胞，例如，可为真菌细胞或细菌细胞，例如，但不限于，农杆菌、酵母菌、大肠杆菌等。
13.通过常规的转化或转染技术，可以将osagl16基因或其活性片段或包含osagl16基因的重组表达载体导入植物细胞，得到转基因植物细胞，并进一步得到过量表达osagl16基因或其活性片段的转基因植株。
14.在第四方面，本发明涉及耐盐胁迫基因osagl16或其编码的蛋白用于提高植物耐盐胁迫能力和产量的应用。本发明人发现，在植株中过表达osagl16基因能够提高植物的耐盐胁迫的能力和产量。本领域技术人员应该理解，获得过表达osagl16基因的植株可以通过转基因技术实现，例如，通过农杆菌介导的转染、质粒转化、直接dna转化、微注射等技术实现。
15.在第五方面，本发明提供一种培育增强植物耐盐胁迫能力和产量的方法，所述方法包括将耐盐胁迫基因osagl16或其活性片段导入植物细胞，由此获得耐盐胁迫能力增强的转基因植物，或者利用杂交方法得到过表达耐盐胁迫基因osagl16或其活性片段的后代植株。在本发明的一个实施方案中，所述植物包括，但不限于，水稻、拟南芥、小麦、玉米、棉花、油菜或大豆，优选水稻。在本发明的一个实施方案中，在植物中过量表达耐盐胁迫基因osagl16并进一步获得具有耐盐胁迫能力且产量增加的植物。所述方法中具体转化和选择方法可根据本领域公知的多种方式进行。在本发明的一个实施方案中，所述方法可参照实施例中描述的过程进行并根据不同植物进行适当修改。
16.在本发明的优选实施方案中，提供一种培育具有耐盐胁迫能力和产量增加的植物
的方法，所述方法包括：将编码seq id no.2所示的氨基酸序列的分离的核苷酸序列或其活性片段导入植物细胞，得到转基因植物细胞，由所述转基因植物细胞产生表达所述分离的核苷酸序列或其活性片段的转基因植株，与未导入所述分离的核苷酸序列或其活性片段的对照植株相比，所述转基因植株具有增强的耐盐胁迫能力和产量。
17.在另一个实施方案中，通过杂交方法在后代植株中导入耐盐胁迫基因osagl16。例如，将包含编码seq id no.2所示的氨基酸序列的分离的核苷酸序列或其活性片段的植株与另一植株杂交获得后代植株，筛选出稳定纯合的含有所述核苷酸序列或其活性片段的杂交植株，与未杂交的植株相比，所得到的杂交后代植株具有增强的耐盐胁迫能力和产量。
18.本领域技术人员应该理解，上述方法还包括在导入植物细胞之前将编码seq id no.2所示的氨基酸序列的分离的核苷酸序列针对所述植物的密码子应用进行密码子优化的步骤。
19.本发明的培育方法可以用于水稻、玉米、小麦、棉花、油菜、大豆、牧草或拟南芥的育种，优选用于水稻育种。利用该方法，可以得到具有增强的耐盐胁迫能力和产量的植物品种。育种的原理即为在植株中过表达osagl16基因，具体而言，可以通过在植株中过表达编码seq id no.2所示的氨基酸序列的分离的核苷酸序列或其活性片段而实现。利用所述培育方法得到的转基因植株或杂交后代植株在盐胁迫生长条件下具有生长优势。在本发明中，“盐胁迫生长条件”通常是指水培条件下添加100-140毫摩尔氯化钠，以及土壤生长条件下添加75毫摩尔氯化钠。
20.当用于培育具有耐盐胁迫能力且产量增加的水稻时，所述培育方法包括：将编码seq id no.2所示的氨基酸序列的分离的核苷酸序列或其活性片段导入水稻细胞，得到转基因水稻细胞，由所述转基因水稻细胞产生表达所述分离的核苷酸序列或其活性片段的转基因水稻植株，与未导入所述分离的核苷酸序列或其活性片段的对照水稻相比，所述转基因水稻具有增强的耐盐胁迫能力和产量；或者所述方法包括：将包含编码seq id no.2所示的氨基酸序列的分离的核苷酸序列或其活性片段的水稻植株与另一水稻植株杂交获得后代水稻植株，筛选出稳定纯合的含有所述核苷酸序列或其活性片段的杂交植株，与未杂交的水稻植株相比，所得到的杂交后代植株具有增强的耐盐胁迫能力和产量。
21.利用植物表达载体，将本发明的耐盐胁迫基因导入植物细胞，可获得增强的耐盐胁迫能力和产量的转基因细胞系及转基因植株。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其他的可参与mrna加工或基因表达的dna片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mrna前体的3'端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(ti)质粒基因(如胭脂合成酶nos基因)、植物基因(如大豆储存蛋白基因)3'端转录的非翻译区均具有类似功能。
22.使用osagl16构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、根部特异表达启动子等，它们可单独使用或与其他的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必须与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
23.为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(gus基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如除草剂bar基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
24.携带有本发明osagl16的植物表达载体可通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是水稻、玉米、小麦等单子叶植物，也可以是拟南芥、大豆、油菜、棉花等双子叶植物。
25.通过对转化osagl16基因后所得到的转基因水稻在不同盐浓度营养液中生长实验以及田间实验，证明该基因在转入植物后可显著提高植株的耐盐胁迫能力，同时提高植物的产量。本发明为人为增强植物耐盐胁迫能力和产量提供了基础，将在培育强耐盐胁迫能力的植物(特别是水稻、玉米、小麦、油菜、大豆、棉花等农作物)中发挥重要的作用。
26.因此，本发明提供下述：
27.1.osagl16基因在提高植物耐盐胁迫能力中的用途，其中所述osagl16基因编码seq id no.2所示的氨基酸序列。
28.2.根据项目1所述的用途，其中，所述osagl16基因的核苷酸序列为如seq id no.1所示的序列。
29.3.根据项目1所述的用途，其中，所述植物为水稻、玉米、小麦、棉花、油菜、大豆等农作物，优选水稻。
30.4.一种提高植物耐盐胁迫能力的方法，所述方法包括提高植物中osagl16基因的表达或活性，其中所述osagl16基因编码seq id no.2所示的氨基酸序列。
31.5.一种培育植物的方法，所述方法包括将osagl16基因，或包含osagl16基因的重组载体或宿主细胞导入植物细胞或组织中并培育，或者将包含osagl16基因重组载体的植物与另一株未导入osagl16基因重组载体的植物进行杂交，获得耐盐胁迫能力增强的植物；
32.其中所述osagl16基因编码seq id no.2所示的氨基酸序列。
33.6.根据项目4或5所述的方法，其中，所述osagl16基因的核苷酸序列为如seq id no.1所示的序列。
34.7.根据项目5所述的方法，其中，所述宿主细胞为微生物细胞或植物细胞，优选为大肠杆菌(escherichia coli)或农杆菌(agrobacterium tumefaciens)细胞。
35.8.根据项目5所述的方法，其中，所述载体还包括增强子。
36.9.根据项目5所述的方法，其中，所述载体可通过ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、微注射、电导、农杆菌介导方法转化到植物细胞或组织中。
37.10.通过项目5所述的方法获得的植物细胞或组织。
附图说明
38.图1、过量表达载体pcb2006-osagl16的物理图谱；
39.图2、crispr实验的ph-ubi-cas9-7(a)和pos-sgrna(b)载体物理图谱；
40.图3、过表达osagl16基因的水稻株系中osagl16基因表达情况的qrt-pcr检测(图
3a)以及crispr基因突变位点情况(图3b)；其中，wt表示野生型水稻(作为对照)，oe7表示osagl16基因过量表达的转基因水稻株系，oe8表示另一个osagl16基因过量表达的转基因水稻株系。osagl16-1和osagl16-2表示osagl16基因不同突变位点的crispr-cas9基因突变株系，其中osagl16-1株系的osagl16基因在靶点位置有1个碱基的插入，而osagl16-2株系的osagl16基因在靶点位置有1个碱基的缺失；
41.图4、转基因水稻在不同盐浓度水培条件下的生长状况。图4a显示在正常生长条件下生长12天的转基因水稻在不同盐浓度水平条件下生长5天，没有盐胁迫时(0mm nacl)各转基因水稻与野生型相比无明显差异，而在有盐胁迫(100mm，140mm nacl)条件下，osagl16过表达株系(oe7和oe8)与野生型(wt)相比，长势更好，生物量更高，而osagl16基因突变株系(osagl16-1和osagl16-2)与野生型相比，生物量显著降低；图4b显示生长5天后osagl16各遗传材料存活率的统计情况，盐胁迫条件下过表达株系相比对照存活率显著增加，而突变株系存活率明显降低；
42.图5、土壤培养条件下osagl16各遗传材料的生长状况。图5a显示分别在不含盐和含有75mm nacl的土壤中生长4个月，osagl16过表达株系都表现出明显的生长优势，且穗部更发达。而敲除突变体生长态势较弱，穗部较小，这种差异在盐胁迫条件下更明显；图5b显示osagl16各遗传材料产量构成要素的统计情况，过表达株系相比对照分蘖数、穗粒数和千粒重都显著增加，而突变株系与之相反。
具体实施方式
43.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
44.下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用的试剂如无特别说明均为可商购的试剂。
45.实施例1、耐盐胁迫基因osagl16及其转基因植物的获得
46.1、osagl16 cdna序列的获得
47.提取7天大的中花11幼苗的总rna，反转录得到cdna，然后以cdna作为模板rt-pcr扩增出osagl16 cdna序列。具体过程如下：采用trizol试剂(invitrogen,carlsbad,ca)抽提水稻总rna，取1μg总rna采用大连宝生物工程公司生产的反转录试剂盒，按照产品使用指南反转录得到cdna。
48.rt-pcr引物如下：
49.上游引物：5
’‑
ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggct
50.atggggagggggaagattgtg-3’，(seq id no.3)
51.下游引物：5
’‑
ggggaccactttgtacaagaaagctgggt
52.tcatggattcaactgtaacccta-3’(seq id no.4)
53.其中引物中大写字母序列为attb2全接头，小写字母为按照osagl16基因序列设计的序列(上游引物中的小写字母表示的序列为seq id no.1的5’端序列，下游引物中的小写字母表示的序列为seq id no.1的3’端序列的反向互补序列)。
54.50μl pcr扩增体系为：0.8μl fastpfu聚合酶(北京全式金生物技术公司)，0.5μl cdna，5
×
pcr缓冲液10μl，dntps 100μm，上下游引物各25μm，再用双蒸水将反应体系补充至
50μl。
55.pcr程序为：先95℃，1min，再58℃，30s，最后72℃，1min，共40个循环。反应结束后，对pcr产物进行回收测序，测序表明该pcr扩增产物的核苷酸序列如seq id no.1所示，编码seq id no.2所示的蛋白序列。
56.2、osagl16过量表达载体的构建
57.pcb2006是含有水稻actin1启动子的植物过量表达双元载体，其构建方法可参见现有技术，例如high-throughput binary vectors for plant gene function analysis.journal of integrative plant biol.49(4):556-567。
58.采用高通量构建载体的方法(gateway technology)(汪宗桂，郑文岭，马文丽；通路克隆系统：dna重组技术的新进展.中国生物工程杂志(2003)，第23卷第7期)，将步骤1中pcr扩增得到的osagl16基因的cdna，利用gateway
r bp clonase
tm ii enzyme mix试剂盒(invitrogen，cat.no.11789-020)通过gateway
tm
克隆技术重组克隆到pcb2006的attr1和attr2之间，将经测序鉴定表明含有osagl16 cdna的pcb2006重组载体命名为pcb2006-osagl16(如图1所示)。
59.3、osagl16过表达转基因植物的获得和鉴定
60.将上述构建的重组表达载体pcb2006-osagl16采用农杆菌eha105介导的遗传转化方法(efficient transformation of rice(oryza sativa l.)mediated by agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the t-dna,1994,plant journal 6：271-282)导入正常中花11水稻品种中。待转基因植株长大后，剪取叶子提dna，并设计引物对其进行pcr，筛选出转入osagl16基因的阳性植物，单株收种，直至t2代检测出纯合植株。取在ms培养基(配方见表1)上萌发的纯合株系通过qrt-pcr鉴定各株系中osagl16基因的表达量。具体操作如下：取osagl16转基因株系和野生型7天大的小苗，参照步骤1中的方法抽取总rna，反转录得到cdna，以该cdna为模版，以actin1基因作为内参，采用大连宝生物工程公司生产的q-pcr试剂盒(takarapremix extaq
tm ii)进行qrt-pcr。从构建的过表达osagl16基因的水稻株系中选择两个株系，命名为oe7和oe8，用于后续实验。
61.osagl16过表达阳性植物筛选pcr引物序列为：
62.上游引物lp 5
’‑
atggggagggggaagattgtg-3’，(seq id no.5)下游引物rp 5
’‑
tcatggattcaactgtaacccta-3’(seq id no.6)
63.osagl16 qrt-pcr引物序列为：
64.上游引物lp 5
’‑
agtcaatcgggattcaccaa-3’，(seq id no.7)
65.下游引物rp 5
’‑
agttgattgttcggcgtcac-3’(seq id no.8)
66.actin1基因qrt-pcr引物序列为：
67.上游引物lp 5
’‑
tggcatctctcagcacattcc-3’，(seq id no.9)
68.下游引物rp 5
’‑
tgcacaatggatgggtcaga-3’(seq id no.10)
69.qrt-pcr体系：10μm lp 0.25μl，10μm rp 0.25μl，cdna 0.3μl，双蒸水4.2μl，sybr green试剂5μl。qrt-pcr程序：95℃，1min；95℃，5s；60℃，30s，40个循环。
70.表1.ms培养基的配制
71.ms培养基配方如下(1l)：
agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the t-dna,1994,plant journal 6：271-282)导入正常中花11水稻品种中。待转基因植株长大后，剪取叶子提dna，并设计引物对crispr-cas9所针对的靶点进行测序，以便鉴定该靶点附近发生了基因突变的情况。筛选出osagl16基因发生有效突变的阳性植物，单株收种，直至t2代检测出纯合植株。crispr-cas9所针对的靶点序列如图3所示。从所得到的多个osagl16基因突变株系中选择两个用于后续实验，将所选的两个osagl16基因突变株系分别命名为osagl16-1和osagl16-2。
83.osagl16 crispr-cas9转基因植物筛选pcr引物序列为：
84.上游引物lp 5
’‑
tgaagtgtatagtgtgtgtctc-3’(seq id no.11)
85.下游引物rp 5
’‑
ggtgttctactgtgtctatatg-3’(seq id no.12)
86.实验结果表明得到的所有转基因株系都是osagl16过表达株系，crispr株系在靶点附近产生了阻碍基因正常行使功能的突变，其中osagl16-1株系的osagl16基因在靶点位置有1个碱基的插入，而osagl16-2株系的osagl16基因在靶点位置有1个碱基的缺失。
87.实施例2、转基因株系对耐盐胁迫能力评价
88.1、转基因水稻在不同盐浓度水培条件下的生长状况
89.将osagl16过表达株系oe7和oe8(实施例1构建)，crispr基因突变株系osagl16-1、osagl16-2(实施例1构建)和野生型水稻种子浸种萌发后分别放到正常培养基上生长12天，再转移到含0mm，100mm，140mm nacl的不同盐浓度的水培营养液中上生长5天，观察各株系的生长情况。
90.正常培养基配方如下：nh4no
3 80mg/l，nah2po4·
2h2o 93.6mg/l，k2so
4 52.4mg/l，cacl2·
2h2o 44.2mg/l，mgcl2·
6h2o 122mg/l，fe
·
edta 19mg/l，h3bo
3 3.01mg/l，mnso4·
5h2o 2.17mg/l，znso4·
7h2o 0.21mg/l，na2moo4·
2h2o 0.024mg/l，cuso4·
5h2o 0.075mg/l。
91.不同盐浓度水培培养基配方：在正常培养基基础上，根据不同盐浓度水平，额外添加nacl至需要的浓度(100mm nacl，140mm nacl)。
92.如图4a所示，培养5天后，在不含盐的培养液中，各株系生长无明显差异，而在不同盐浓度(100mm nacl，140mm nacl)水平培养液中，两个过表达株系相对野生型和osagl16-1、osagl16-2株系均长得更大更好，生物量增加，说明过表达株系耐盐胁迫能力更强；与之相反，osagl16-1、osagl16-2株系相对于野生型长势较弱，生物量降低。统计各株系的存活率，结果见图4b，从图中可以看出过表达株系相对野生型，存活率显著提高；osagl16-1、osagl16-2株系则在不同盐浓度下存活率都显著低于野生型。说明敲除osagl16后，植物对盐胁迫的耐受能力降低，这进一步说明osagl16在耐盐胁迫中扮演着重要角色，一旦该基因缺失，植物对外界盐胁迫的耐受能力就受到影响，如果该基因过量表达，则植物对盐胁迫的耐受性增强。
93.2、土壤培养条件下下osagl16各水稻遗传材料的生长状况
94.各株系分别在不含盐和含有75mm nacl的土壤中生长4个月，观察各株系的生长状况，结果如图5所示，osagl16过表达株系相比野生型都表现出明显的生长优势，穗部更发达，并且这种差异在盐胁迫处理条件下更显著。而敲除突变体生长态势较弱，穗部较小。统计结果表明过表达株系相对于对照分蘖数、穗粒数和千粒重都显著增加。以上这些数据说
明过表达osagl16的水稻在盐碱土壤中生长具有明显的优势，暗示这个基因将是一个具有广阔应用前景的基因，通过该基因可以显著提高农作物耐盐胁迫的能力，同时还能提高作物生物量和产量。
95.以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。