一株黏着剑菌及其在制备微生物肥料中的应用的制作方法

1.本发明涉及微生物菌剂领域，具体涉及一种黏着剑菌及其菌剂和应用。


背景技术：

2.土壤盐渍化以及因灌溉引起的土壤次生盐渍化是由自然或人类活动引起的一种主要环境风险，通常出现在气候干旱、土壤蒸发强度大、地下水位高且含有较多可溶性盐类的地区。据统计，全球20％的耕地和近半数的灌溉土地都受到不同程度的盐害威胁，而这比例还在不断攀升。我国的盐渍地总面积约1亿公顷，主要分布在西北、东北、华北及滨海地区在内的17个省。当土壤盐浓度达到一定值时会破坏植物细胞的正常生命活动，使植株的生长受到抑制，造成土地产出率低、农业综合生产力严重不足，并直接影响着地区的生态安全以及经济的可持续发展。
3.当前，如何提高农作物的耐盐碱性、抗盐碱性已成为科研工作者面临的重大挑战。无论从改良土壤的角度，还是提高作物耐盐碱性的角度，促进植物在盐生环境的生长都是解决问题的关键。植物根际促生菌(plant growth-promoting rhizobacteria，pgpr)是植物根际土壤中一类可以促进植物生长、防治病害、增加作物产量的微生物。应用pgpr将有助于减轻盐分对植物的不良影响。


技术实现要素：

4.发明目的：为了解决植物抗盐的问题，本发明提供了一种黏着剑菌，本发明进一步地提供了以黏着剑菌为活性微生物的菌剂及其菌剂在增强农作物抗盐胁迫能力中的应用。
5.技术方案：本发明所述一种黏着剑菌，其分类命名为黏着剑菌(ensiferadhaerens)，菌株号为cn-02，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2020年12月11日，保藏编号为cgmcc no.21357，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所保藏中心，邮编100101。该菌株是发明人于2020年5月从南京市浦口区汤泉镇稻田土中选育的菌株。
6.黏着剑菌cn-02具有下述性质：1、菌落形态学特征在lb固体培养基上30℃培养16-24h后显微镜观察到细胞为单细胞，杆状，菌体长1.0-1.5μm，宽0.4-0.6μm。属于革兰氏阴性菌、无芽胞。在上述培养基中30℃培养12h菌体可以大量生长，菌落呈乳白色、不透明、光滑、有粘液、凸起、边缘规整。
7.2、16srdna序列分析16srdna序列长度1388bp，核苷酸序列见序列表seq.no.1所示。将16srdna序列和genebank数据库中的相关种进行比较，构建16srdna全序列为基础的系统发育树。结果表明：菌株cn-02与黏着剑菌达到100％同源。所以认定本发明的菌株为黏着剑菌，具体为ensiferadhaerens cn-02。
8.本发明进一步提供了所述黏着剑菌在提高农作物产量、提升农作物品质、增强农
作物抗盐性中任意一种或几种中的应用。黏着剑菌cn-02可以产生胞外多糖，由于该胞外多糖具有吸水性，通过与植物共生，能维持高渗条件下植物内部的渗透压，因此具有增强植物抗盐的能力。上述胞外多糖产生菌可与有机肥混合使用，也可以单独使用，改善根际微生物环境，促进植物生长，增强植物抗盐能力，减少化肥使用量。
9.优选地，所述农作物为粮食作物、蔬菜类作物或瓜果类作物。
10.本发明进一步提供了所述黏着剑菌在发酵制备胞外多糖中的应用，制备步骤如下：将所述黏着剑菌接种于lb培养基中25-35℃活化12-24h，将活化的黏着剑菌转接于发酵培养基中，30-35℃培养36-50h得到发酵液，发酵液中胞外多糖产量高达7.4g/l。
11.所述发酵培养基配方如下：碳源10-100g/l，氮源1-30g/l，无机盐0.01-50g/l，ph5.0-9.0，所述溶剂为水。
12.所述碳源为葡萄糖、乳糖、木糖、柠檬酸和淀粉中的任意一种或几种的组合；所述氮源为蛋白胨、酵母膏、玉米浆、(nh4)2so4、nh4cl、(nh4)2hpo4和nh4no3中的任意一种或几种的组合；所述无机盐为硫酸盐、磷酸盐、磷酸二氢盐、磷酸氢二盐和盐酸盐中的任意一种或几种的组合。
13.本发明更进一步提供一种活性微生物菌剂，它包含所述黏着剑菌。
14.本发明更进一步提供所述菌剂的制备方法，步骤如下：将所述黏着剑菌接种于lb培养基中25-35℃活化12-24h，将活化的黏着剑菌转接于发酵培养基中，30-35℃培养36-50h得到发酵液，发酵液或发酵液后处理得到的体系即为菌剂，即所述发酵液、发酵液浓缩得到的浓缩液或发酵液干燥得到的粉剂即为菌剂。
15.所述菌剂的剂型为溶液、悬浮液、颗粒剂、粉剂或棒剂，所述菌剂中菌体浓度为1
×
10
8-9
×
109cfu/g。
16.所述lb培养基配方如下：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l，ph6.0-8.0，所述溶剂为水。
17.所述发酵培养基配方如下：碳源10-100g/l，氮源1-30g/l，无机盐0.01-50g/l，ph5.0-9.0，所述溶剂为水。
18.所述碳源为葡萄糖、乳糖、木糖、柠檬酸和淀粉中的任意一种或几种的组合；所述氮源为蛋白胨、酵母膏、玉米浆、(nh4)2so4、nh4cl、(nh4)2hpo4和nh4no3中的任意一种或几种的组合；所述无机盐为硫酸盐、磷酸盐、磷酸二氢盐、磷酸氢二盐和盐酸盐中的任意一种或几种的组合。
19.本发明进一步提供所述菌剂在提高农作物产量、提升农作物品质、增强农作物抗盐性中任意一种或几种中的应用；所述菌剂通过灌根或喷施处理，施用于农作物、园林作物。菌剂可与有机肥混合使用，也可以单独使用，改善根际微生物环境，促进植物生长，增强植物抗盐能力，减少化肥使用量。
20.优选地，所述农作物为粮食作物、蔬菜类作物或瓜果类作物。
21.有益效果：(1)本发明从土壤中筛选出具有增强植物抗盐能力并产生胞外多糖的黏着剑菌cn-02，并以黏着剑菌cn-02为菌种发酵培养制备得到黏着剑菌cn-02菌剂。黏着剑菌cn-02可黏附于植物根系，亦可进入植物内与植物共生，提高植物对外界营养元素的吸收，改善自身代谢系统，维持植物内部水势等，从而促进植物生长发育，提高产量，同时增强植物抗旱能力。对充分发挥土壤生态肥力、保持农业生态环境的平衡等具有极其重要意义
和应用价值。(2)本发明提供的黏着剑菌cn-02菌剂不存在生产过程中向环境排放污染物，黏着剑菌cn-02是一种真正意义上的环保型肥料；且本发明提供的黏着剑菌cn-02菌剂的制备方法，生产工艺简单，生产效率高，能实现工业化大生产，具有良好的经济效应和社会效应。
具体实施方式
22.实施例1黏着剑菌的筛选和鉴定黏着剑菌cn-02是发明人从南京市浦口区汤泉镇稻田土中选育(以产多糖为标准)的菌株，筛选过程如下：将采集的土样溶于无菌水中，震荡、混匀。将样品溶液进行梯度稀释，取10-4
、10-5
、10-6
三个浓度梯度的稀释液在固体培养基(培养基成分：蔗糖20g/l，蛋白胨5g/l，牛肉膏1g/l，nacl 5g/l，琼脂20g/l)上均匀涂布。置于30℃恒温培养箱中培养48h，期间每天查看平板，观察菌落特征，以粘性菌落作为筛选目标。从中挑取能够产高粘胞外多糖的单菌落在固体培养难平板上采用划线法纯化。
23.将上步获得的单菌落分别接种到液体培养基(培养基成分：蔗糖20g/l，蛋白胨5g/l，牛肉膏1g/l，nacl5 g/l)中养，于摇床上30℃进行震荡发酵培养，48h后对比不同菌株的发酵液粘度，其中发酵液粘度最高的菌株即为本发明所述的黏着剑菌cn-02。
24.黏着剑菌cn-02具有下述性质：在lb固体培养基上30℃培养16-24h后显微镜观察到细胞为单细胞，杆状，菌体长1.0-1.5μm，宽0.4-0.6μm。属于革兰氏阴性菌、无鞭毛、无芽胞。在上述培养基中30℃培养12h菌体可以大量生长，菌落呈乳白色、不透明、光滑、有粘液、凸起、边缘规整。e.adhaerenscn-02的16s rdna如序列表seq id no.1所示，序列全长为1388bp。通过ncbi数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的blastn序列比对工具比较，认定本发明的菌株为黏着剑菌，命名为cn-02。
25.实施例2黏着剑菌cn-02菌剂将4℃斜面保存的e.adhaerenscn-02活化，接种于茄子瓶培养基(即活化培养基)上，活化温度为30℃，活化时间为16h。挑取茄子瓶上大量的菌种，接种于发酵培养基中，发酵罐中无菌空气的通气量为0.2vvm，搅拌速度为200rpm，30℃培养48h得发酵液，菌剂中的菌体数量可达到5
×
109cfu/g以上。
26.所述活化培养基为lb培养基，发酵培养基组分为：葡萄糖40g/l，牛肉膏8g/l，nacl 6g/l，蛋白胨10g/l，ph为7.0。
27.实施例3黏着剑菌cn-02产胞外多糖的能力测定使用苯酚硫酸法定量检测实施例2发酵液中的胞外多糖含量，根据无水葡萄糖制作的标准曲线计算黏着剑菌cn-02的胞外多糖产生量。结果表明，黏着剑菌cn-02胞外多糖的产量达到7.4g/l。
28.实施例4黏着剑菌cn-02可以显著提高白菜产量本发明所用菌剂制备方法同实施例2。以白菜为实验对象，开展盆栽实验。试验设4种处理方式：
处理1(t1)正常浇水；处理2(t2)首次浇水时添加0.6％的盐；处理3(t3)正常浇水并施用实施；例2制备的菌剂(每盆加入5ml菌剂，菌剂含水量计入浇水量)；处理4(t4)首次浇水时添加0.6％的盐并施用实施例2制备的菌剂(每盆加入5ml菌剂，菌剂含水量计入浇水量)。
29.处理3和处理4菌剂通过喷施方法施加。
30.四个处理的其他常规肥料施用量及日常管理均保持一致，在白菜收获期检测产量等各项指标，实验结果见表1。表1白菜盆栽实验中不同处理条件下的生长状况处理根长(cm)叶长(cm)鲜重(g)增产％t16.9
±
0.429.3
±
0.3142.3
±
1.6—t26.2
±
0.618.9
±
0.596.7
±
4.3-32.04t313.2
±
0.532.3
±
0.6170.5
±
1.419.8t412.6
±
0.728.6
±
0.4149.7
±
2.55.2
31.在白菜盆栽实验中，正常浇水量下处理3与处理1相比，根长、叶长与鲜重均有明显的提升，增产达19.8％；处理2产量下降了32.04％；而当施加菌剂时，处理4增产5.2％，且与处理2相比，在根长，叶长与产鲜重上都有大幅度的提升。说明黏着剑菌cn-02不仅能促进农作物生长，在增强农作物抗盐能力上有非常显著的优异表现。
32.实施例5黏着剑菌cn-02可以显著提高小麦产量本发明所用菌剂制备方法同实施例2。以小麦为研究对象，开展小区实验。实验设置3种处理方式，每个处理方式设3次重复，共计9个小区，小区面积为5m
×
4m＝20m2，各小区随机分布。
33.处理1(t1)不加菌剂处理，即为空白组；处理2(t2)施加实施例2制备的菌剂(16kg/hm2)；处理3(t3)施加灭活菌剂(16kg/hm2，由实施例2制备的菌剂经高压高温灭活)。
34.处理2和处理3采用灌根方式施加。
35.三种处理的其他常规肥料施用量及日常管理均保持一致。在小麦成熟期检测小麦产量等各项指标，实验结果见表2。表2不同处理条件下小麦的产量状况结果表明，在小麦实验中，黏着剑菌cn-02明显促进了小麦的生长；产量提高了37.1％，千粒重也明显提高，而当黏着剑菌cn-02灭活后，产量与对照组几乎相同。这说明，黏着剑菌cn-02可以显著提高农作物产量与质量。
36.实施例6黏着剑菌可以显著提高西瓜产量与质量以西瓜为研究对象，开展小区实验。实验设置3种处理方式，每个处理方式设3次重复，共计9个小区，小区面积为5m
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4m＝20m2，各小区随机分布。
37.t1不加菌剂处理，即空白组；t2将种子放入容器中，然后将本发明微生物肥料(200ml/亩)稀释50倍进行拌种。
38.两种处理的其他常规肥料施用量及日常管理均保持一致。在西瓜成熟期检测西瓜产量等各项指标，实验结果见表3。表3不同处理条件下西瓜的产量及质量状况结果表明，在西瓜实验中，与对照组相比黏着剑菌cn-02明显提升了了西瓜中维生素c的含量，同时提高了西瓜的糖度、坐果率和产量。这说明，黏着剑菌cn-02显著提高了西瓜的产量和品质。