一种基因编辑酵母体外合成麝香酮的方法

1.本发明属于麝香酮合成技术领域，具体涉及一种基因编辑酵母体外合成麝香酮的方法。


背景技术：

2.麝香酮不仅是名贵中药麝香的重要成分，也是一种重要的香料。目前麝香酮的主要生产方法有两种：第一种是通过饲养麝科动物林麝（moschus berezovskii），通过活体取香，即把成熟雄体香囊中的干燥分泌物麝香经蒸馏提取，得到麝香酮。然而，该方法存在由于资源少，近亲繁殖导致品种退化进而导致麝香产量下降的问题；其次，雄麝的泌香具有年周期性，一年之中在5～7月份泌香一次，麝香年产量只有10克左右。同时随着林麝年龄增长，麝香的质量与产量也会下降。因此，通过林麝养殖的方法难以大批量地获得麝香酮。
3.第二种是化学合成麝香酮。目前主要通过环十五烷酮的甲基化、闭环法和环酮扩环法三种化学方式来合成麝香酮。环十五烷酮的甲基化是在环十五烷酮β位插入甲基而得到麝香酮的方法。但这种方法依赖于环十五酮的价格，目前环十五酮的价格还是比较昂贵的。闭环法主要是通过开链化合物分子内闭环来合成麝香酮，主要包括羟醛缩合闭环法、醇酮缩合闭环法、dieckman缩合闭环法、分子内酰化闭环法、自由基加成闭环法、prins反应闭环法、emmons-horner反应闭环法、分子内1-3偶极加成闭环法、分子内亲和取代闭环法、端炔氧化偶联闭环法等。然而该方法反应周期长，操作复杂，产率极低，总产率只有5%。环酮扩环法是以环十二酮为原料在其α位引入一个取代的异丁基（或甲基丙稀）结构侧链，通过扩环形成麝香酮。该方法虽然底物原料便宜，但合成环境要求高，路线复杂。
4.综上，当前生产麝香酮的方法无论是通过养殖林麝还是通过各种途径的化学合成，其缺点都很明显。通过人工养殖林麝来获得麝香酮，产物很少，周期长，成本高；化学合成则具有产率低，操作复杂，路线复杂，合成环境要求高，周期长等缺点。


技术实现要素：

5.针对现有技术中的上述不足，本发明提供的基因编辑酵母体外合成麝香酮的方法通过改造酵母，建立高效生物合成麝香酮体系，从而降低了麝香酮合成的成本及操作难度。
6.为了达到上述发明目的，本发明采用的技术方案为：提供一种基因编辑酵母体外合成麝香酮的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）支链脂肪酸合成：丙二酰-酰基载体蛋白质（丙二酰-acp）与2-酮异戊酸盐（2-kiv）在thi3的作用下，形成2-甲基丙烯-acp，并在脂肪酸合酶fas1/fas2的作用下，延伸合成14-甲基-十五酰-coa，在tes1的作用下，产生14-甲基-十五烷酸；（2）ω-羟基化：14-甲基-十五烷酸在cyp54a1、cyp54a13或cpr2的作用下发生ω-羟基化，形成ω-羟基-14-甲基-十五烷酸；（3）环化成酮：ω-羟基-14-甲基-十五烷酸在内酯脂肪酶（lactonizing lipase，
lipl）催化下形成麝香酮。
7.进一步地：步骤（1）中，通过过表达thi3、fas1、fas2、tes1基因，增加14-甲基-十五烷酸的合成产量；同时通过敲除adhs与fao基因，减弱脂肪酸还原醇化或氧化，从而进一步增加14-甲基-十五烷酸的合成产量。
8.进一步地：adhs基因包括adh-a4、adh-a10、adh-b2、adh-b4、adh-b1。
9.进一步地：步骤（2）中，利用crispr/cas9技术形成突变酵母内cyp52a17、cyp53a14以及cpr2基因，构建氧化能力弱的cyp54a17mut、cyp53a14mut和cpr2mut酶基因；14-甲基-十五烷酸在这些突变酶的作用下发生ω-羟基化，形成ω-羟基-14-甲基-十五烷酸。
10.进一步地：步骤（3）中，外源性导入lipl基因，使酵母表达lipl，从而具备合成麝香酮的能力。
11.本发明的有益效果为：1.本发明通过基因编辑技术，使酵母菌内过表达脂肪酸合成基因，提高支链脂肪酸合成比例，敲除包括adhs基因以及faos基因，有效降低脂肪酸的异化，提高14-甲基-十五烷酸的合成产量。
12.2.本发明通过突变原有的cyp54a17、cyp54a13或者cpr2，提高了14-甲基-十五烷酸转化为ω-羟基-14-甲基-十五烷酸的比例。
13.3.本发明通过外源导入lipl基因，从而实现催化ω-羟基-14-甲基-十五烷酸环化形成麝香酮。
14.4.本发明可使酵母获得合成麝香酮的能力，合成产量可以达到843mg/l，不仅成本低，而且可以通过工业化量产得到数量较多的产物。
附图说明
15.图1为本发明生物合成麝香酮具体路线。
具体实施方式
16.下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
17.参照图1，一种基因编辑酵母体外合成麝香酮的方法，具体步骤分为三步：步骤1.支链脂肪酸合成：丙二酰-酰基载体蛋白质（丙二酰-acp）与2-酮异戊酸盐（2-ketoisovalerate, 2-kiv）在thi3（硫胺素代谢调节蛋白，thiamine metabolism regulatory protein）的作用下，形成2-甲基丙烯-acp（2-methylpropanyl-acp），并在脂肪酸合酶fas1/fas2的作用下，延伸合成14-甲基-十五酰-辅酶a，在tes1的作用下，产生14-甲基-十五烷酸（14-methyl-pentadecanoic acid）。
18.通过过表达thi3、fas1、fas2、tes1基因，增加14-甲基-十五烷酸的合成量；同时通过敲除adhs（包括adh-a4、adh-a10、adh-b2、adh-b4、adh-b1）与fao基因，减弱脂肪酸还原醇化或氧化，从而进一步增加14-甲基-十五烷酸的合成量。
19.步骤2.ω-羟基化：14-甲基-十五烷酸在cyp54a1、cyp54a13或者cpr2的作用下发生ω-羟基化，形成ω-羟基-14-甲基-十五烷酸（ω-羟基-14-methyl-pentadecanoic acid）。然而，cyp54a1、cyp54a13或者cpr2催化能力较强，可能会导致14-甲基-十五烷酸的末端甲基发生羟基化。为避免此种情况发生，利用crispr/cas9技术形成突变酵母内cyp52a17、cyp53a14以及cpr2基因，构建氧化能力弱的cyp54a17mut、cyp53a14mut和cpr2mut酶基因。14-甲基-十五烷酸在这些突变酶的作用下发生ω-羟基化，形成ω-羟基-14-甲基-十五烷酸（ω-羟基-14-methyl-pentadecanoic acid）。
20.步骤3.环化成酮：ω-羟基-14-甲基-十五烷酸在lipl（lactonizing lipase）催化下形成麝香酮。然而酵母本身无法表达lipl，需要外源性导入lipl酶基因，使酵母表达lipl，从而具备合成麝香酮的能力。
21.本发明通过基因编辑技术，使酵母菌内过表达脂肪酸合成基因，提高支链脂肪酸合成比例，敲除包括adhs基因以及faos基因，有效降低脂肪酸的异化，提高14-甲基-十五烷酸的合成。通过突变原有的cyp54a17、cyp54a13或者cpr2，提高14-甲基-十五烷酸转化为ω-羟基-14-甲基-十五烷酸的比例。最后，通过外源导入lipl基因，从而实现催化ω-羟基-14-甲基-十五烷酸环化形成麝香酮的目的。
22.通过以上方案，就可以实现麝香酮的合成，合成产量可以达到843mg/l，不仅成本低而且可以通过工业化量产得到数量较多的产物。
23.本发明可通过改变其他具有类似功能的基因，包括但不限于脂肪酸合成酶家族、脂肪酸氧化酶家族、乙醇脱氢酶家族、cyp54家族、cyp53家族、cyp52家族、cpr2、lipl等成员达到与上述类似的目的。
24.于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
25.此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。