一种培养毛竹原生质体及诱导细胞壁再生的方法及其应用与流程

protoplasts of suspension
‑
cultured bambusa cells.botanical bulletin of academia sinica,31:29
‑
34)。
10.2005年，science杂志在其创刊125周年时提出把“植物如何形成细胞壁”作为接下来25年需要解决的重要科学问题之一。而且植物细胞壁是被了解最少的细胞结构，人们对细胞壁的利用率还不到其年产量的2％。
11.2010年，hisamoto和kobayashi从lithachne pauciflora、phyllostachys meyeri、sasa jotanii和bambusa vulgaris四种竹类植物的嫩叶中分别游离出原生质体(hisamoto y,kobayashi m(2010)protoplast isolation from bamboo leaves.plant biotechnology,27:353
‑
358)。
12.禾本科植物的组培及原生质体培养技术相较于双子叶植物，难度更大。竹类植物的原生质体培养技术及细胞壁再生研究仍存在很大局限性，仅在少数竹种中展开实验。毛竹(phyllostachys edulis)作为重要的非木材料和木材替代品，在林业产业和生态建设中发挥重要作用，目前，还缺乏对毛竹原生质体细胞壁再生过程进行系统的动态研究报道。
13.毛竹种子的无菌培养污染率高、胚性愈伤组织诱导率低及非胚性愈伤组织来源的原生质体活性低等问题，严重限制了对毛竹原生质体细胞壁再生的研究。2013年，yuan等利用毛竹种子诱导出胚性愈伤组织，经历胚状体发育后能够再生出幼苗，移栽到温室后可以正常生长(yuan jl,yue jj,wu xl,et al(2013)protocol for callus induction and somatic embryogenesis in moso bamboo.plos one,8(12):81954
‑
81958)。公开于2015年的cn 105145355a中也提到了毛竹一种原生质体培养的方法，通过对胚性愈伤组织进行酶解，将酶解后获得的原生质体进行过滤、离心和纯化，然后将纯化后的原生质体在适当的培养基上培养，使得原生质体再生细胞壁、形成胚性愈伤组织、并萌发形成再生植株，最后再生植株经过壮苗、炼苗后移栽成活。不过，已有的研究报道中所提到对毛竹原生质体进行培养的方法仍然存在重复性差、效率低、再生细胞壁困难等诸多特点。
14.此外，目前对毛竹细胞壁的研究多集中于解析其细胞壁的微观结构和化学组成、次生细胞壁形成及单一基因家族的功能研究等，缺乏对原生质体培养及细胞壁再生过程的整体监测和系统研究。


技术实现要素：

15.本发明结合大量的理论研究和实验探索，首次提出了一种培养毛竹原生质体及诱导细胞壁再生的方法及其在相关研究中的应用。
16.具体而言，本发明首先提供了一种培养毛竹原生质体及诱导细胞壁再生的方法，其包括：
17.(1)将经过消毒的毛竹种子接种在愈伤诱导培养基中培养，以诱导得到胚性愈伤组织；
18.所述愈伤诱导培养基中含有200
‑
300mg/l的头孢霉素；
19.(2)将所述胚性愈伤组织接种于愈伤组织增殖培养基中培养，并将长出新的愈伤组织剥离并进行酶解，以得到游离的裸露原生质体；
20.(3)利用预冷的改良的原生质体培养基重悬原生质体，并进行活化处理；
21.所述改良的原生质体培养基中含有1.5
‑
2.5mg/l的2,4
‑
d和0.15
‑
0.25mg/l的6
‑
ba；所述活化处理具体为：在43
‑
47℃热激处理4.5
‑
5.5min，然后在
‑
2～4℃处理5
‑
15s；
22.(4)将活化处理后的原生质体接种于所述改良的原生质体培养基进行培养。
23.本发明发现，通过上述方法，尤其在胚性愈伤组织的诱导阶段(即本发明的步骤(2))及原生质体的活化和培养阶段(即本发明的步骤(3)～(4))分别对愈伤诱导培养基及原生质体培养基进行改良后，可以大幅改善毛竹的原生质体及细胞壁的再生效果及成功率，同时其再生结果也具有良好的重复性。
24.其中，毛竹种子的表面和胚乳易受真菌和细菌的污染，使得在无菌操作中污染率较高。目前，还没有针对毛竹种子内源细菌进行消毒的文献。通过在愈伤诱导培养基中加入200
‑
300mg/l的头孢霉素，可有效抑制毛竹种子中内源细菌的污染，抑菌率可达95％以上。通过在原生质体培养基中加入1.5
‑
2.5mg/l的2,4
‑
d和0.15
‑
0.25mg/l的6
‑
ba，可以大幅提升毛竹原生质体的细胞壁再生率。
25.本领域人员可根据常识设置培养毛竹原生质体及诱导细胞壁再生的方法中所涉及的其他试剂、培养基及具体操作，均可以获得上述所提到的效果。不过，为了进一步优化毛竹原生质体及细胞壁的再生效果，本发明对影响其再生效果的关键因素进行了进一步探究与优化。
26.作为优选，步骤(1)中，所述愈伤诱导培养基中含有ms培养基(4.43g/l ms)、4
‑
6mg/l 2,4
‑
d、300
‑
500mg/l脯氨酸、300
‑
500mg/l谷氨酰胺、100
‑
300mg/l水解酪蛋白、50
‑
100mg/l肌醇、50
‑
100mg/lpvp
‑
40、25
‑
35g/l蔗糖、2
‑
2.5g/l植物凝胶、200
‑
300mg/l头孢霉素，ph值为5.75
‑
5.80。
27.作为优选，步骤(1)中，通过以下方式对毛竹种子进行消毒：
28.将去掉种皮的毛竹种子在流水中冲泡20
‑
28h后，用180
‑
220mg/l的赤霉素溶液再浸泡1.5
‑
2.5h，剪去其尾部；而后在超净台中，将种子用70
‑
80％酒精浸泡0.5
‑
1.5min后，用无菌水清洗；然后用含1.8
‑
2.2％有效氯和0.04
‑
0.06％吐温
‑
20的次氯酸钠消毒液浸泡18
‑
25min，用无菌水清洗；再用含0.04
‑
0.06％吐温
‑
20的0.1％氯化汞浸泡18
‑
25min，最后用无菌水清洗。
29.作为优选，步骤(1)中，在每个培养器皿中单独接种一个经过消毒的毛竹种子。
30.作为一种优选的实施方式，可将每粒种子单独接种于1.5ml的离心管中。
31.本发明还发现，毛竹种子培养过程中容易发生交叉污染，而通过上述操作，可以进一步有效避免种子的交叉污染，极大减轻后期更换培养皿的工作量。
32.为了保证再生效果，本领域人员知晓，应当选取选取当年结实、籽粒饱满、表面光洁无霉变的毛竹种子。
33.作为优选，步骤(2)中，所述愈伤组织增殖培养基中含有ms培养基(4.43g/l ms)、1
‑
3mg/l 2,4
‑
d、300
‑
500mg/l脯氨酸、300
‑
500mg/l谷氨酰胺、100
‑
300mg/l水解酪蛋白、100
‑
200mg/l肌醇、50
‑
100mg/l pvp
‑
40、5
‑
10mg/l抗坏血酸、25
‑
35g/l蔗糖、2
‑
2.5g/l植物凝胶，ph值为5.75
‑
5.80。
34.作为优选，在步骤(2)的所述酶解中，所使用的酶解液中含有2.0
±
0.5％的纤维素酶cellulose r
‑
10、1.0
±
0.5％的半纤维素酶hemicellulase、1.0
±
0.5％的离析酶macerozyme r
‑
10、1.0
±
0.5％的果胶酶pectolyase y
‑
23、0.5
‑
0.7m的甘露醇、18
‑
22mm的mes、18
‑
22mm的kcl、0.008
‑
0.012m的cacl2、0.18
‑
0.22％的bsa，ph值为5.75
‑
5.80。
35.作为一种优选的实施方式，本发明中的纤维素酶为cellulose“onozuka”r
‑
10。
36.作为优选，所述酶解的条件为24
±
2℃、80
‑
120rpm/min下避光酶解。
37.在一个优选的实施方案中，酶解时间为2
‑
3h。
38.作为优选，在步骤(2)中的酶解结束后，将酶解液冷却至0
‑
6℃，而后与预冷的w5溶液混合，并用80
‑
120目的细胞筛过滤混合液；收集滤液并在0
‑
6℃、400
‑
600g离心5
‑
10min，弃上清；而后再利用预冷的改良的原生质体培养基重悬沉淀。
39.优选地，所述w5溶液中含有8
‑
10g/l的nacl、0.12
‑
0.13m cacl2、4
‑
6mm kcl、1.5
‑
2.5mm mes和1.5
‑
2.0g/l的葡萄糖。
40.作为优选，步骤(3)
‑
(4)中，所述改良的原生质体培养基是以km8p培养基为基础，添加35
‑
45g/l甘露醇、15
‑
25ml/l椰乳、0.20
‑
0.30g/l酶水解酪蛋白、1.5
‑
2.5mg/l的2,4
‑
d、0.15
‑
0.25mg/l的6
‑
ba，ph值为5.75
‑
5.80。
41.作为优选，步骤(1)、(2)、(4)中，所述培养具体为：在24
±
2℃的黑暗环境下培养。
42.优选地，步骤(4)中，原生质体的接种密度为2
‑
10
×
105cells/ml。
43.本领域人员可对上述方案进行组合，得到本发明培养毛竹原生质体及诱导细胞壁再生的方法的较优实施例。
44.作为本发明的一种优选方案，所述的培养毛竹原生质体及诱导细胞壁再生的方法的具体步骤包括：
45.(1)将去掉种皮的毛竹种子在流水中冲泡20
‑
28h后，用180
‑
220mg/l的赤霉素溶液再浸泡1.5
‑
2.5h，剪去其尾部；而后在超净台中，将种子用70
‑
80％酒精浸泡0.5
‑
1.5min后，用无菌水清洗；然后用含1.8
‑
2.2％有效氯和0.04
‑
0.06％吐温
‑
20的次氯酸钠消毒液浸泡18
‑
25min，用无菌水清洗；再用含0.04
‑
0.06％吐温
‑
20的0.1％氯化汞浸泡18
‑
25min，最后用无菌水清洗，完成种子消毒；
46.将经过消毒的毛竹种子接种在愈伤诱导培养基中培养，在每个培养器皿中单独接种一个毛竹种子，在24
±
2℃的黑暗环境下培养，以诱导得到胚性愈伤组织；
47.所述愈伤诱导培养基中含有ms培养基、4
‑
6mg/l 2,4
‑
d、300
‑
500mg/l脯氨酸、300
‑
500mg/l谷氨酰胺、100
‑
300mg/l水解酪蛋白、50
‑
100mg/l肌醇、50
‑
100mg/l pvp
‑
40、25
‑
35g/l蔗糖、2
‑
2.5g/l植物凝胶、200
‑
300mg/l头孢霉素，ph值为5.75
‑
5.80；
48.(2)将所述胚性愈伤组织接种于愈伤组织增殖培养基中，并在24
±
2℃的黑暗环境下培养，将长出新的愈伤组织剥离并在24
±
2℃、80
‑
120rpm/min下避光酶解，以得到游离的裸露原生质体；
49.所述愈伤组织增殖培养基中含有ms培养基、1
‑
3mg/l 2,4
‑
d、300
‑
500mg/l脯氨酸、300
‑
500mg/l谷氨酰胺、100
‑
300mg/l水解酪蛋白、100
‑
200mg/l肌醇、50
‑
100mg/l pvp
‑
40、5
‑
10mg/l抗坏血酸、25
‑
35g/l蔗糖、2
‑
2.5g/l植物凝胶，ph值为5.75
‑
5.80；
50.在进行所述酶解时，所使用的酶解液中含有2.0
±
0.5％的纤维素酶cellulose r
‑
10、1.0
±
0.5％的半纤维素酶hemicellulase、1.0
±
0.5％的离析酶macerozyme r
‑
10、1.0
±
0.5％的果胶酶pectolyase y
‑
23、0.5
‑
0.7m的甘露醇、18
‑
22mm的mes、18
‑
22mm的kcl、0.008
‑
0.012m的cacl2、0.18
‑
0.22％的bsa，ph值为5.75
‑
5.80；
51.(3)将酶解液冷却至0
‑
6℃，而后与预冷的w5溶液混合，并用80
‑
120目的细胞筛过滤混合液；收集滤液并在0
‑
6℃、400
‑
600g离心5
‑
10min，弃上清；而后再利用预冷的改良的
原生质体培养基重悬沉淀，并进行活化处理；
52.所述w5溶液中含有8
‑
10g/l的nacl、0.12
‑
0.13m cacl2、4
‑
6mm kcl、1.5
‑
2.5mm mes和1.5
‑
2.0g/l的葡萄糖；
53.所述改良的原生质体培养基是以km8p培养基为基础，添加35
‑
45g/l甘露醇、15
‑
25ml/l椰乳、0.20
‑
0.30g/l酶水解酪蛋白、1.5
‑
2.5mg/l的2,4
‑
d、0.15
‑
0.25mg/l的6
‑
ba，ph值为5.75
‑
5.80；
54.所述活化处理具体为：在43
‑
47℃热激处理4.5
‑
5.5min，然后在
‑
2～4℃处理5
‑
15s；
55.(4)将活化处理后的原生质体按2
‑
10
×
105cells/ml的接种密度接种于所述改良的原生质体培养基中，在24
±
2℃的黑暗环境下进行培养。
56.在一个具体的实施方案中，所述的培养毛竹原生质体及诱导细胞壁再生的方法的具体步骤如下：
57.(1)毛竹种子的消毒及胚性愈伤组织的诱导：选取当年结实的毛竹种子，去掉种皮，流水冲泡24h后用200mg/l的赤霉素溶液再浸泡2h，剪去其尾部。在超净操作台中，将种子用75％酒精浸泡1min后，用无菌水清洗5遍；然后用含2％有效氯的次氯酸钠消毒液(含0.05％的吐温
‑
20)浸泡20min，用无菌水清洗5遍；再用0.1％氯化汞(含0.05％的吐温
‑
20)浸泡20min，最后用无菌水清洗5遍，完成种子消毒。将经过消毒处理的种子接种在含愈伤诱导培养基的1.5ml离心管中，每管1粒，避免交叉污染。置于24
±
2℃的黑暗环境下培养，1个月后长出色泽鲜黄、质地紧实、团状的胚性愈伤组织。愈伤诱导培养基为：ms(4.43g/l) 2,4
‑
d(4
‑
6mg/l) 脯氨酸(300
‑
500mg/l) 谷氨酰胺(300
‑
500mg/l) 水解酪蛋白(100
‑
300mg/l) 肌醇(50
‑
100mg/l) pvp
‑
40(50
‑
100mg/l) 蔗糖(30g/l) 植物凝胶(2
‑
2.5g/l) 头孢霉素(200
‑
300mg/l)，ph为5.75
‑
5.80。
58.(2)胚性愈伤组织的酶解：将胚性愈伤组织接种于愈伤组织增殖培养基中，置于24
±
2℃的黑暗环境下培养14d左右，将长出新的愈伤组织；愈伤组织增殖培养基为：ms(4.43g/l) 2,4
‑
d(1
‑
3mg/l) 脯氨酸(300
‑
500mg/l) 谷氨酰胺(300
‑
500mg/l) 水解酪蛋白(100
‑
300mg/l) 肌醇(100
‑
200mg/l) pvp
‑
40(50
‑
100mg/l) 抗坏血酸(5
‑
10mg/l) 蔗糖(30g/l) 植物凝胶(2
‑
2.5g/l)，ph为5.75
‑
5.80。将新长出的愈伤组织剥离并添加到盛有酶解液(1:10)的培养皿中，置于100rpm/min的摇床中，24℃避光酶解2
‑
3h，酶解液中含有2.0％的纤维素酶cellulose“onozuka”r
‑
10、1.0％的半纤维素酶hemicellulase、1.0％的离析酶macerozyme r
‑
10、1.0％的果胶酶pectolyase y
‑
23、60％的1m的甘露醇、10％的200mm的mes、10％的200mm的kcl、1％的1m的cacl2、0.2％的bsa，ph为5.75
‑
5.80。酶解液配好后用0.22μm的滤膜过滤除菌。
59.(3)原生质体的游离与纯化：酶解完成后，将酶解液置于4℃冰箱储存30min，加入等量4℃预冷的w5溶液，用100目的细胞筛过滤混合液，收集滤液，然后4℃、400
‑
600g离心5
‑
10min，弃上清；加入4℃预冷的改良的原生质体培养基，重悬原生质体，然后4℃、400
‑
600g离心5
‑
10min，弃上清，重复一遍；收集原生质体，加入少量4℃预冷的改良的原生质体培养基，重悬原生质体，进行活化处理：45℃热激处理5min，然后放入冰水内10s。w5溶液由9g/l的nacl、125ml/l的1m cacl2、25ml/l的200mm kcl、10ml/l的200mm mes和1.8g/l的葡萄糖组成；改良的原生质体培养基是以km8p培养基为基础，添加40.08g/l甘露醇、20ml/l椰乳、
0.25g/l酶水解酪蛋白、2mg/l的2,4
‑
d、0.2mg/l的6
‑
ba，ph为5.75
‑
5.80。
60.(4)原生质体的培养及细胞壁的再生：将活化处理后的原生质体接种于改良的原生质体培养基中，调整原生质体的密度为2
‑
10
×
105cells/ml，置于24
±
2℃的黑暗环境下培养。
61.进一步的，本发明还提供一种监测毛竹原生质体培养及细胞壁再生情况的方法，包括：利用所述的方法培养毛竹原生质体并诱导其细胞壁再生，其间对原生质体培养情况和/或细胞壁再生过程进行观察和记录。
62.作为一种优选方案，可在原生质体的培养过程(即本发明中步骤(4)中的培养过程)中，分别取培养0h、12h、24h、48h、72h、96h、120h和144h的原生质体，经0.001％calcofluor white m2r染色后置于荧光显微镜(激发光波长为355nm)下，观测原生质体细胞壁再生的情况并拍照。
63.在未来的研究中，可利用本发明的监测方法同时结合转录组学分析，研究参与植物细胞壁建成的关键基因群，这种方法可以避开单基因功能研究等常规育种途径的限制，通过细胞生物学和高通量测序方法实现竹类植物的种质创新，推动植物遗传育种领域的发展，具有重要的理论意义和实践价值。
64.基于上述技术方案，本发明的有益效果如下：
65.本发明通过对来源于毛竹胚性愈伤组织的原生质体进行培养，诱导其再生出完整的细胞壁，再生效果优良且成功率高，同时再生结果还具有较高的重复性。此外，利用本发明的方法还可以对原生质体及细胞壁再生过程进行监测，为研究毛竹以及其他物种细胞壁合成与调控机理、材质改良以及生物质能源等领域的研究提供切实可行的模型，为改善竹材细胞壁的质量与产量提供了理论指导，对竹产业的建设发展具有深远影响和长远意义。
附图说明
66.图1为本发明实施例中毛竹种子诱导出的胚性愈伤组织。
67.图2为本发明实施例中毛竹原生质体细胞壁再生的过程。图中，a
‑
b：0h，c
‑
d：12h，e
‑
f：24h，g
‑
h：48h，i
‑
j：72h，k
‑
l：96h，m
‑
n：120h，o
‑
p：144h；a，c，e，g，i，k，m，o为明场下拍摄的照片；b，d，f，h，j，l，n，p为荧光下拍摄的照片；bar＝20μm。
具体实施方式
68.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
69.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
70.实施例1
71.本实施例提供一种培养毛竹原生质体及诱导细胞壁再生的方法，具体步骤如下：
72.(1)选取当年结实的毛竹种子，去掉种皮，挑选籽粒饱满、表面光洁无霉变的种子，流水冲泡24h后用200mg/l的赤霉素溶液再浸泡2h，剪去其尾部。在超净操作台中，将种子用75％的酒精浸泡1min后，用无菌水清洗5遍；然后用含2％有效氯的次氯酸钠消毒液(含0.05％的吐温
‑
20)浸泡20min，用无菌水清洗5遍；再用0.1％氯化汞(含0.05％的吐温
‑
20)
浸泡20min，最后用无菌水清洗5遍，完成种子消毒。将经过消毒处理的种子接种在含愈伤诱导培养基的1.5ml离心管中，每管1粒。置于24
±
2℃的黑暗环境下培养，1个月后长出色泽鲜黄、质地紧实、团状的胚性愈伤组织(图1)。愈伤诱导培养基为：ms(4.43g/l) 2,4
‑
d(5mg/l) 脯氨酸(500mg/l) 谷氨酰胺(500mg/l) 水解酪蛋白(300mg/l) 肌醇(100mg/l) pvp
‑
40(100mg/l) 蔗糖(30g/l) 植物凝胶(2.5g/l) 头孢霉素(300mg/l)，ph为5.80。
73.(2)将胚性愈伤组织接种于愈伤组织增殖培养基中，置于24
±
2℃的黑暗环境下培养14d左右；愈伤组织增殖培养基为：ms(4.43g/l) 2,4
‑
d(2mg/l) 脯氨酸(500mg/l) 谷氨酰胺(500mg/l) 水解酪蛋白(300mg/l) 肌醇(200mg/l) pvp
‑
40(100mg/l) 抗坏血酸(5mg/l) 蔗糖(30g/l) 植物凝胶(2.5g/l)，ph为5.80。将新长出的愈伤组织剥离并添加到盛有酶解液(1:10)的培养皿中，置于100rpm/min的摇床中，24℃避光酶解3h，酶解液中含有2.0％的纤维素酶cellulose“onozuka”r
‑
10、1.0％的半纤维素酶hemicellulase、1.0％的离析酶macerozyme r
‑
10、1.0％的果胶酶pectolyase y
‑
23、60％的1m的甘露醇、10％的200mm的mes、10％的200mm的kcl、1％的1m的cacl2、0.2％的bsa，ph为5.80；酶解液配好后用0.22μm的滤膜过滤除菌。
74.(3)酶解完成后，将酶解液置于4℃冰箱储存30min，加入等量4℃预冷的w5溶液，用100目的细胞筛过滤混合液，收集滤液，然后4℃、500g离心10min，弃上清；加入4℃预冷的改良的原生质体培养基，重悬原生质体，然后4℃、500g离心10min，弃上清，重复一遍；收集原生质体，加入少量4℃预冷的改良的原生质体培养基，重悬原生质体，进行活化处理：45℃热激处理5min，然后放入冰水内10s。w5溶液由9g/l的nacl、125ml/l的1m cacl2、25ml/l的200mm kcl、10ml/l的200mm mes和1.8g/l的葡萄糖组成；改良的原生质体培养基是以km8p培养基为基础，添加40.08g/l甘露醇、20ml/l椰乳、0.25g/l酶水解酪蛋白、2mg/l的2,4
‑
d、0.2mg/l的6
‑
ba，ph为5.80。
75.(4)将活化处理后的原生质体接种于改良的原生质体培养基中，调整原生质体的密度为2
‑
10
×
105cells/ml，置于24
±
2℃的黑暗环境下培养。
76.本实施例进一步提供监测毛竹原生质体及细胞壁再生的方法，如下：
77.在上述步骤(4)的培养过程中，分别取培养0h、12h、24h、48h、72h、96h、120h和144h的原生质体，经0.001％calcofluor white m2r染色后置于荧光显微镜(激发光波长为355nm)下，观测原生质体细胞壁再生的情况并拍照(图2)。
78.来源于毛竹胚性愈伤组织的原生质体在改良的km8p培养基中，连续培养120h可以再生出完整的细胞壁。同时，本发明的方法可以有效抑制毛竹种子中内源细菌的污染，抑菌率可达95％以上。
79.对比例1
80.本对比例与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中的愈伤诱导培养基中不含有头孢霉素。结果在实验中，种子污染率达到98％。
81.对比例2
82.本对比例与实施例1的区别仅在于，在步骤(3)
‑
(4)中，对所述改良的原生质体培养基中的激素进行替换，并统计应用各激素组合后的细胞壁再生率。
83.具体激素组合及其试验结果见表1，其中各组合均设置3个重复，其试验结果均为各重复组的平均值。
84.表1
[0085][0086]
对比例3
[0087]
本对比例按照cn 105145355a的具体实施方式中所公开的毛竹原生质体培养的方法，以毛竹胚性愈伤组织为材料，经过胚性愈伤组织的酶解、原生质体的分离与纯化、原生质体的培养等步骤，未获得细胞壁再生的毛竹原生质体，而且大部分细胞涨破。可见该方法(包括改良ms培养基)并不适合毛竹原生质体的培养，或结果的重复性较差。
[0088]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。