烟草NtEXB1基因在植株分枝发育调控中应用的制作方法

烟草ntexb1基因在植株分枝发育调控中应用
技术领域
1.本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一个烟草ntexb1基因在植株分枝发育调控中应用专利申请事宜。


背景技术：

2.植物的分枝是通过腋生分生组织发育形成的，在植物株型调控中具有决定性作用，而植物株型又与作物产量和品质密切相关，因此，植物株型调控研究具有重要的生产应用意义。而已有研究表明，植物侧枝发育虽然受植物激素、环境等多种因素的影响，但归根结底而言，遗传因素对于植物分枝发育仍然是具有基础性决定作用的。
3.相关植物基因研究工作表明，大量的基因均参与了植物的分枝发育调控过程，比如植物腋分生组织发育起始相关的番茄ls基因，研究表明，将ls基因发生突变后，营养生长阶段的腋生分生组织形成被完全抑制。另有研究表明，myb转录因子家族的rax1和rax2基因在拟南芥腋分生组织形成中发挥重要作用。再如，研究表明，tb1基因是调控玉米腋芽休眠的关键基因，在调控腋芽发育中具有关键作用。
4.烟草作为一种以收获叶片为生产原料的经济作物，其分枝发育相关基因研究，对于于改良烟草株型和提升烟叶产量，显然具有重要的技术意义。


技术实现要素：

5.基于分枝发育基因对于烟草生产的重要技术意义，本技术通过对烟草ntexb1基因与植株分枝发育活动相关研究，从而为烟草株型调控奠定一定技术基础。
6.本技术所采取的技术方案简述如下。
7.烟草ntexb1基因在植株分枝发育调控中应用，烟草ntexb1基因与烟草腋芽处分枝发育相关，具有增加或者减少植物分枝的作用，可用于植物株型调控；所述植物，具体例如为烟草；具体应用时，通过基因工程技术手段，通过将ntexb1基因沉默进而抑制ntexb1基因表达翻译为ntexb1蛋白后，基因沉默植株中，烟草腋芽生长缓慢（即，通过基因沉默方式抑制烟草分枝发育）；所述烟草ntexb1基因，其编码碱基序列长度为927bp，序列如seq id no.1所示；具体如下：atgtctgataataaccctttttatcatgattacttgggaacaggagggataaataatgcattttctaatttctttggtgatcaaaatccctcaatttatgatcaaataatacctcctaatacacaaacccctcatcaggattttgatccttcatcttatatgagtactctcactgagtgtttacatggttctatggactataactctttatcaaatgttcttggcatgagttgctcatcttctgaagttgtttgtccaccattagatcaagaatcttcaagaaaaaacactgctgaaattccattgactccaaattctttggtctcttcatcttctagtgaggctggaggtgaagaagattcttcaaaaagcaagaaagatttgcaagcaaaagatcagtgtgaagatggagatgataagtctaagaaagtgagcaaagcaaagaagaaaggagaaaagaagcaaaaggagccgcgatttgcctttatgactaagagtgagattgacaatcttgaagatggcta
tcgatggagaaaatatgggcagaaagcagtgaaaaatagtccttttccgaggagttattacagatgcacaagtcaaaagtgcagtgtgaagaaacgtgtggaaagatcatatgaagatccatcagtcgtgatcactacatacgaaggccaacataatcatcactgtcccgcaactcttcgtggaaatgcagctgcagctatgctttcaccttccttcttatcctcttcacaattaattcctcaagatgtactctttgcccaaatgcttacaaccccaaccaatcaaaatcagctccctattaattattctgtctataattatcagcagcaaccccaattaggtcctgaatatggcctatttcaagatatggttgcatcattgatccacaaacgagagccatga；烟草ntexb1基因所编码烟草分枝发育调控蛋白ntexb1的氨基酸序列长度为308aa，氨基酸序列如seq id no.2所示，具体如下：msdnnpfyhdylgtgginnafsnffgdqnpsiydqiippntqtphqdfdpssymstlteclhgsmdynslsnvlgmscsssevvcppldqessrkntaeipltpnslvssssseaggeedsskskkdlqakdqcedgddkskkvskakkkgekkqkeprfafmtkseidnledgyrwrkygqkavknspfprsyyrctsqkcsvkkrversyedpsvvittyegqhnhhcpatlrgnaaaamlspsflsssqlipqdvlfaqmlttptnqnqlpinysvynyqqqpqlgpeyglfqdmvaslihkrep。
8.烟草ntexb1基因pcr扩增用引物序列，具体设计如下：ntexb1-f: 5'-atgtctgataataaccctttttatc-3'ntexb1-r: 5'-gataaaaagggttattatcagacat-3'。
9.用于敲低烟草ntexb1基因表达的重组载体，该重组载体命名为pbwa(v)ks-rnai-ntexb1，通过如下步骤构建获得：（一）设计引物，并进行pcr扩增基于基因沉默目的序列，设计pcr扩增用引物序列如下：ntexb1-f( )：5
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cagtggtctcacaacacacaaacccctcatcagga-3’，ntexb1-f(-)：5
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cgatggtctcacaggtttgcttgcaaatctttctt-3’；利用上述引物扩增目的片段序列如下：acacaaacccctcatcaggattttgatccttcatcttatatgagtactctcactgagtgtttacatggttctatggactataactctttatcaaatgttcttggcatgagttgctcatcttctgaagttgtttgtccaccattagatcaagaatcttcaagaaaaaacactgctgaaattccattgactccaaattctttggtctcttcatcttctagtgaggctggaggtgaagaagattcttcaaaaagcaagaaagatttgcaagcaaa；ntexb1-r( )：5
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cagtggtctcagggctttgcttgcaaatctttctt-3’；ntexb1-r(-)：5
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cagtggtctcatacaacacaaacccctcatcagga-3’；利用上述引物扩增目的片段序列如下：tttgcttgcaaatctttcttgctttttgaagaatcttcttcacctccagcctcactagaagatgaagagaccaaagaatttggagtcaatggaatttcagcagtgttttttcttgaagattcttgatctaatggtggacaaacaacttcagaagatgagcaactcatgccaagaacatttgataaagagttatagtccatagaaccatgtaaacactcagtgagagtactcatataagatgaaggatcaaaatcctgatgaggggtttgtgt；随后，以烟草cdna为模板，分别利用上述引物进行pcr扩增，并对扩增产物进行提取、纯化备用，获得干扰载体的目标序列片段；（二）酶切、连接将步骤（一）中所得pcr扩增产物与pbwa(v)ks-rnai载体分别进行bsai/eco31i双酶切，并利用t4_ligase对酶切产物进行连接；
（三）转化和筛选将步骤（二）中连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，进行筛选、鉴定获得重组构建正确的重组质粒表达载体pbwa(v)ks-rnai-ntexb1 。
10.所述重组载体pbwa(v)ks-rnai-ntexb1在植物中应用，将该重组载体转化植物后，能够降低ntexb1基因翻译表达水平，进而用于抑制植物分枝发育，从而实现株型调控效果。
11.一种调控植物株型的植物新品种培育方法，利用农杆菌介导的基因转化方法，将重组载体pbwa(v)ks-rnai-ntexb1转化植物后，进一步筛选、鉴定获得ntexb1基因表达降低新品种，该新品种腋芽生长缓慢。
12.基于前期工作积累，本技术中，发明人选择烟草ntexb1基因作为研究对象，通过对该基因组织表达特点研究，发明人发现：烟草ntexb1基因在雌蕊处表达量最高，同时在腋芽中有相对较高的表达量，而在顶芽中表达量最低，即，该基因有可能可特定作用于腋芽相关组织调节。进一步对该基因沉默后植株表型研究后发现，通过降低ntexb1基因表达量后，烟草腋芽发育速度明显变缓。基于这些结果，可为针对性培育合适植株株型新品种奠定一定理论基础和技术基础。
附图说明
13.图1为ntexb1基因在不同组织中的表达特征；图2为ntexb1干扰植株中ntexb1基因表达量分析结果；图中exb1-1、exb1-2、exb1-5、exb1-6表示的为不同的转基因株系，符合名称并不具有特殊技术含义；图3为ntexb1干扰植株的腋芽长度，图中exb-1、exb-2表示的为不同的转基因栽培株系，符合名称不具有特殊技术含义。
具体实施方式
14.下面结合实施例对本技术做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。
15.生物材料：烟草品种：k326，一种常见的栽培烟草品种，实施例中所采用种子由国家烟草基因研究中心保存提供；载体：peasy-t1 simple 载体，购自北京全式金生物技术有限公司；pbwa(v)ks-rnai 载体，由武汉伯远生物科技有限公司提供；菌株：trans1-t1化学感受态细胞，购自北京全式金生物技术有限公司；lba4404农杆菌菌株，生物实验中常用菌株，可公开获得；引物的合成和dna测序由北京六合华大基因科技股份有限公司提供完成；实验试剂：荧光定量pcr酶（sybr qpcr kit），购自郑州安赛生物科技有限公司；反转录试剂盒、t4连接酶、限制性内切酶，购自宝生物工程（大连）有限公司；dna扩增酶，购自北京全式金生物技术有限公司；rna 提取试剂盒（superpure plant polyrna kit）、dna纯化胶回收试剂盒购自
qiagen公司。
16.实施例1基于前期研究工作总结，发明人选择烟草ntexb1基因作为研究对象。为便于对该基因对植物生长实际影响情况进行明确，发明人首先对该基因进行了克隆。具体过程简介如下。
17.（1）制备cdna作为克隆模板取旺长期烟草（k326）的叶片100mg作为样品，在液氮中充分研磨，参照rna提取试剂盒说明书提取总rna，然后反转录为cdna备用；（2）设计引物，进行pcr扩增设计用于扩增ntexb1基因的引物序列如下：ntexb1-f: 5'-atgtctgataataaccctttttatc-3'ntexb1-r: 5'-gataaaaagggttattatcagacat-3'以步骤（1）中所制备cdna为模板，利用上述引物进行pcr扩增，50 μl扩增体系设计如下：cdna 模板，2 μl；上、下游引物，各1 ul；2
×
transstart goldpfu pcr supermix，25 μl；ddh2o加至50 ul。
18.pcr扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸40s，共30个循环；再72℃终延伸10min。
19.对pcr扩增产物进行电泳检测分析后，参照胶回收试剂盒说明书，对pcr扩增产物进行回收纯化。
20.（3）与peasy-t1载体连接、转化将步骤（2）中所提取pcr扩增产物连接到peasy-t1载体上，具体连接体系参考如下：pcr扩增产物，6μl；peasy-t1 载体，1μl；混匀后，25℃连接25 min。
21.随后，将上述连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞中，具体转化过程操作参考如下：冰上溶解感受态细胞后，加连接产物于50μl的trans1-t1感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30 min；42℃水浴中热激30s，立即置于冰上2min；加入250μl平衡至室温的lb（不含抗生素），37℃摇荡培养1h；混合后均匀地涂布到lb固体平板（含60μg/μl 氨苄青霉素）平板上，倒置培养皿，37℃培养过夜。
22.挑取白斑扩增培养后，提取质粒dna，并对重组质粒进行菌液pcr鉴定，随后，将重组正确的阳性重组质粒送样测序，获得ntexb1基因序列。
23.测序分析结果表明，ntexb1基因编码区长度为927 bp个核苷酸，具体如seq id no.1所示；进一步分析可知，其所编码的ntexb1蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。
24.实施例2
在实施例1基础上，基于荧光定量pcr技术，发明人对ntexb1基因的组织表达模式特点进行了分析研究，具体试验过程简介如下。
25.采集现蕾期烟草的雌蕊、顶芽、根、花瓣、花萼、茎、雄蕊、叶片、叶脉、腋芽作为样品，提取rna，并利用反转录试剂盒合成cdna备用（参考试剂盒说明书操作即可）。
26.以烟草ntl25基因为内参，进行荧光定量pcr检测，检测时，引物序列设计如下：检测ntexb1基因的荧光定量引物，引物序列为：ntexb1-q-f: 5
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tcttcgtggaaatgcagctg-3’，ntexb1-q-r: 5
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cctaattggggttgctgctg-3’；检测烟草ntl25基因时，具体引物设计为：ntl25-f: 5
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caaaagttacattccaccg-3’，ntl25-f: 5
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tttcttcgtcccatcaggc-3’；荧光定量pcr的条件为：第一步预变性，95℃、10 s；第二步pcr反应，95℃、5 s， 60℃、30 s，39个循环；第三步溶解曲线。
27.每个样品进行3次生物学重复，通过2
‑△△
ct
方法分析相对基因表达差异。分析结果如图1所示。可以看出，烟草ntexb1基因在雌蕊处表达量最高，另外在花瓣、雄蕊、腋芽中也有相对较高的表达量，而在顶芽中表达量最低。
28.实施例3为进一步了解ntexb1基因在植株生长发育中的作用，发明人构建了用于敲低ntexb1基因的重组表达载体pbwa(v)ks-rnai-ntexb1，下面就该重组载体的构建过程简要介绍如下。
29.（一）设计靶位点序列和pcr扩增用引物根据实施例1测序所得ntexb1基因编码序列，在ntexb1基因的编码区域选取了部分片段作为rnai构建的靶序列（272bp）：acacaaacccctcatcaggattttgatccttcatcttatatgagtactctcactgagtgtttacatggttctatggactataactctttatcaaatgttcttggcatgagttgctcatcttctgaagttgtttgtccaccattagatcaagaatcttcaagaaaaaacactgctgaaattccattgactccaaattctttggtctcttcatcttctagtgaggctggaggtgaagaagattcttcaaaaagcaagaaagatttgcaagcaaa；基于所选择的靶位点序列，进一步设计pcr扩增用引物序列如下：ntexb1-f( ):5
’‑
cagtggtctcacaacacacaaacccctcatcagga-3’，ntexb1-f(-):5
’‑
cgatggtctcacaggtttgcttgcaaatctttctt-3’；利用上述引物扩增目的片段序列如下：acacaaacccctcatcaggattttgatccttcatcttatatgagtactctcactgagtgtttacatggttctatggactataactctttatcaaatgttcttggcatgagttgctcatcttctgaagttgtttgtccaccattagatcaagaatcttcaagaaaaaacactgctgaaattccattgactccaaattctttggtctcttcatcttctagtgaggctggaggtgaagaagattcttcaaaaagcaagaaagatttgcaagcaaa；ntexb1-r( ):5
’‑
cagtggtctcagggctttgcttgcaaatctttctt-3’，ntexb1-r(-):5
’‑
cagtggtctcatacaacacaaacccctcatcagga-3’；利用上述引物扩增目的片段序列如下：tttgcttgcaaatctttcttgctttttgaagaatcttcttcacctccagcctcactagaagatgaaga
gaccaaagaatttggagtcaatggaatttcagcagtgttttttcttgaagattcttgatctaatggtggacaaacaacttcagaagatgagcaactcatgccaagaacatttgataaagagttatagtccatagaaccatgtaaacactcagtgagagtactcatataagatgaaggatcaaaatcctgatgaggggtttgtgt。
30.利用上述引物，以烟草cdna为模板进行pcr扩增，获得构建干扰载体的目标序列片段。
31.（二）酶切、连接将步骤（一）中所得pcr扩增产物与pbwa(v)ks-rnai载体分别进行bsai/eco31i双酶切，并利用t4_ligase对酶切产物进行连接；（三）转化和筛选将步骤（二）中连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，进行筛选，挑取阳性质粒进一步经菌液pcr鉴定和测序鉴定后，获得重组构建正确的重组质粒表达载体pbwa(v)ks-rnai-ntexb1（相关操作参考前述及现有技术常规操作即可，不再赘述）。
32.实施例4基于农杆菌介导的转化法，发明人进一步将实施例3 所构建重组载体pbwa(v)ks-rnai-ntexb1转化了烟草植株，以期获得ntexb1基因表达量降低或者ntexb1基因敲除的转基因植株新品种。具体实验过程简要介绍如下。
33.（1）转化农杆菌在冰上冻融农杆菌感受态细胞后，加入6 μl实施例3所制备载体pbwa(v)ks-rnai-ntexb1，轻弹混匀；随后将混合物置于预冷的电转杯中，冰上放置5 min；将电转仪参数调至：电压2.5 kv，电容25 μf，电阻200 ω；然后用吸水纸将电转杯外壁上的水滴吸除干净后，把电转杯放入电击槽中，电击5 ms；迅速加入800 μl的预热至28℃的yeb液体培养基，220 rpm、28℃振荡复苏3 h；然后将菌液4500 rpm离心1 min，弃一半体积的上清，重新悬浮后均匀涂于含有rif（100 μg/ml）、str（50 μg/ml）和kan（50 μg/ml）的yeb固体培养基上，28℃倒置培养约2~3 d，直至单菌落形成；挑取单菌落，扩培后对菌液进行pcr鉴定，鉴定正确的阳性克隆菌株，即为转化正确的农杆菌工程菌。
34.进一步将农杆菌工程菌培养至od
600
=0.6左右，4000 rpm离心5 min收集菌体，再用20 ml的ms液体培养基悬浮菌体，以此作为后续转染用侵染液。
35.（2）转化烟草植株取生长一个月左右的k326烟草无菌苗叶片，用打孔器将叶片处理成直径0.5 cm大小的叶盘，将处理后叶盘在ms固体培养基上预培养3 d；随后，将上述预培养后叶盘置于步骤（1）中的侵染液中，充分侵染10 min；用无菌的滤纸吸干浸染后叶盘周围多余的菌液，再在ms 6-ba（2 mg/l） naa（0.5 mg/l）的固体培养基上暗培养3 d；用含有cef（400 mg/l）的无菌水清洗叶盘，并用无菌滤纸吸去多余的液体，将叶盘转到含有6-ba（2 mg/l）、naa（0.5 mg/l）、cef（200 mg/l）和kan（50 mg/l）的ms固体筛选培养基上，28℃光照培养；待不定芽长到0.5cm时，转移到含cef（200 mg/l）和kan（50 mg/l）的ms固体培养基
上生根。
36.待生长一个月左右，取少量叶片，提取dna，并通过pcr方法检测阳性转基因株系。具体pcr鉴定时，引物设计为：ntexb1-j-f: 5
’‑
ttcatttggagagaacacgggggac-3’，ntexb1-j-r: 5
’‑
tcatggctctcgtttgtgga-3’。
37.转基因株系表型变化情况：进一步地，基于实时定量pcr技术，对鉴定阳性转基因株系中ntexb1基因表达情况进行检测分析（具体操作参考前述及现有技术即可）。结果如图2所示。
38.分析可以看出，与野生型k326相比，在不同rnai植株株系中，烟草ntexb1基因表达水平均明显降低，也即，表明成功构建获得了ntexb1基因表达量降低的转基因植株新品种。
39.进一步t0代植株移栽至盆中后，温室培养至12周时，对阳性株的腋芽长度表型进行检测统计，结果如图3所示。可以看出，相较于野生型k326，转基因株系腋芽发育缓慢，长度明显短于野生型。进一步结合前述ntexb1基因表达模式特点，有望利用ntexb1基因针对性对腋芽分枝发育活动进行调控，进而可为植物尤其是烟草的株型调控奠定一定技术基础。