沙林鼠种布鲁氏菌脂多糖的单克隆抗体及应用的制作方法

1.本发明涉及单克隆抗体制备技术领域，具体涉及沙林鼠种布鲁氏菌脂多糖(lps)的单克隆抗体及应用。


背景技术：

2.布鲁氏菌(brucella)属于人畜共患病原菌，感染后病人最明显的症状表现波浪热，又称“地中海弛张热”或“马他耳热”。世界动物卫生组织(oie)将布鲁氏菌病(brucellosis,简称布病)列为b类传染病，根据《中华人民共和国传染病防治法》规定为乙类传染病。能够引起人类和多种动物的急性和慢急性感染，母畜感染布鲁氏菌主要表现为繁殖能力减退、易流产、产死胎。公畜则会引起睾丸炎及不育症状。人与人之间通过接触传播方式罕见，感染布鲁氏菌病主要是接触感染动物的带菌分泌物，通过破损的皮肤黏膜、呼吸道及消化道进入机体。急性期病人表现轻微的流感症状，慢性期病人表现反复发热(波浪热)、贫血、关节出现疼痛、脾脏、睾丸肿大等症状，严重者丧失劳动力，对社会公共卫生体系构成较大威胁。
3.布鲁氏菌的细胞膜由三层膜组成，由内向外依次是细胞质膜、外周胞质膜、外膜。布鲁氏菌的外膜包括三个部分，分别是外膜蛋白(omps)、脂多糖(lps)、磷脂。布鲁氏菌感染后产生的大多数抗体是针对脂多糖(lps)。lps主要是由类脂a、核心多糖、o侧链三部分构成，布鲁氏菌属分为光滑型(s型)或粗糙型(r型)的依据是o侧链的有无。
4.据相关文献报道针对布鲁氏菌早期抗体或者主要抗体的elisa试剂盒，临床运用具有较高的敏感性和特异性(mantur et al 2007)。步志高等、丁家波等分别利用热酚水法提取羊种布鲁氏菌脂多糖(lps)、猪种s2布鲁氏菌脂多糖(lps)，排除交叉反应，制备针对布鲁氏菌脂多糖的单抗，在此基础上发明了不同的elisa方法检测疑似布鲁氏菌病的样品(步志高等2014、丁家波等2017)。朱良全利用犬种布鲁氏菌单克隆抗体，发明了犬种布鲁氏菌的竞争elisa方法(朱良全等2020)。
5.国内外文献、专利暂无检索出在沙林鼠种布鲁氏菌脂多糖单克隆抗体的基础上建立检测方法。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供了一种杂交瘤细胞株2h2，所述的杂交瘤细胞株2h2的保藏编号为cctcc no:c2021134。
7.本发明的另一个目的在于提供了杂交瘤细胞株2h2分泌的单抗。
8.本发明的最后一个目的在于提供了杂交瘤细胞株2h2或其分泌的单抗在制备布鲁氏菌特别是沙林鼠种布鲁氏菌检测试剂盒中的应用。
9.为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
10.申请人用热酚水法提取沙林鼠种布鲁氏菌脂多糖(lps)，80℃1h热灭活沙林鼠种布鲁氏菌免疫balb/c小鼠；将免疫小鼠的脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合；有限稀释法和间
接elisa方法筛选一株阳性杂交瘤细胞株，命名为2h2，杂交瘤细胞株2h2的保藏编号为cctcc no:c2021134；制备2h2株沙林鼠种布鲁氏菌lps单克隆抗体，重链亚型为igg1，轻链类型为κ型，浓度为8.775mg/ml，效价为1:512000，所述杂交瘤细胞株2h2已于2021年6月3日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：杂交瘤细胞株2h2，保藏编号：cctcc no:c2021134，地址：中国武汉武汉大学。
11.本发明的保护内容还包括，杂交瘤细胞株2h2分泌的单抗。
12.杂交瘤细胞株2h2或其分泌的单抗在制备布鲁氏菌检测试剂盒，特别是沙林鼠种布鲁氏菌检测试剂盒中的应用。
13.与现有技术相比，本发明具有以下优点：
14.选择沙林鼠种布鲁氏菌提取脂多糖(lps)，对比布鲁氏菌属合成脂多糖(lps)关键酶基因的同源性，结果表明同源性高达99％以上，因此选择沙林鼠种布鲁氏菌株的脂多糖(lps)作为抗原制备单抗。与此同时该菌能够有效降低实验室人员操作时感染布鲁氏菌病的风险。
15.利用杂交瘤技术成功制备了一株杂交瘤细胞株2h2；该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体2h2的亚型为igg1，轻链类型为κ型；浓度为8.775mg/ml，效价为1:512000，其纯度和效价高，亲和性好，结合能力强，特异性良好。能够为今后开展布鲁氏菌病原及抗体检测方法的建立奠定良好的实验基础。
附图说明
16.图1为免疫小鼠抗体效价elisa检测结果。
17.图2为western blot鉴定2h2和3b9单抗对不同细菌的特异性检测结果。
18.图3为2h2单抗双抗夹心elisa最佳封闭条件确认结果。
19.图4为2h2单抗双抗夹心elisa单抗样品最佳孵育条件的确认结果。
20.图5为2h2单抗双抗夹心elisa特异性试验结果。
具体实施方式
21.本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
22.实施例1：
23.沙林鼠种布鲁氏菌脂多糖的单克隆抗体的制备：
24.1.抗原脂多糖(lps)制备
25.取培养24h的沙林鼠种布鲁氏菌(b.neotomae)菌液于4℃、10000r/min条件下离心15min，收菌泥，用pbs洗2次，离心收取菌泥，称取菌泥重量，按照菌泥和水1:4的比例加入等量的66℃预热的蒸馏水和饱和酚，混匀后66℃水浴搅拌30min，4℃冷却，10000r/min离心15min，加入提前4℃预冷的500ml饱和醋酸钠甲醇溶液沉淀脂多糖(lps)，放置4℃冰箱孵育2h以上，然后10000r/min离心10min，沉淀重悬于80ml灭菌纯水，4℃搅拌18h，然后10000r/min离心10min，上清液保存于4℃冰箱，沉淀再悬浮于80ml灭菌纯水，4℃再搅拌2h，10000r/min离心15min，并与前述上清液混合。弃掉上清液，随后向两次收集共160ml粗制脂多糖(lps)提取液中加入8g三氯乙酸(tca)，室温搅拌10～15min后，10000r/min离心15min去除
沉淀，收集上清。上清液以纯水透析，至少换液两次；(使用纯水透析，每次透析3h，透析4次左右)即粗提取得脂多糖(lps)，将透析后样品于-80℃冰箱预冻，放置真空冻干机中，冻干过夜。对冻干的脂多糖(lps)称重，以1mg/ml的含量悬浮于碳酸盐缓冲液中，然后以1ml分装至西林瓶冻干，-80℃保存。采用12％的sds-page凝胶进行电泳，并进行银染显色，检测脂多糖(lps)的完整性。
26.2.动物免疫
27.将灭活的沙林鼠种布鲁氏菌与弗氏完全佐剂等体积混合并进行充分乳化，皮下多点注射初次免疫5只spf级balb/c雌性小鼠，剂量为3
×
109cfu/只；初次免疫后，每隔两周进行加强免疫一次，共五次，剂量为3
×
109cfu/只。
28.采用间接elisa方法对免疫小鼠抗体效价进行检测阳性小鼠血清稀释效价均达1:12800以上，其中4号小鼠血清稀释效价比最高(图1)。为此选取4号小鼠加强免疫，注射剂量为6
×
109cfu/只，用于细胞融合。
29.3.细胞融合
30.a.饲养细胞的制备
31.杂交瘤细胞生长依赖一定量的细胞密度，此外饲养细胞可以分泌一些细胞生长因子等帮助杂交瘤细胞的生长。取spf 8～10周龄雌性balb/c小鼠一只，摘眼球放血处死，收集血液并分离血清，即为阴性血清。75％酒精中浸泡5min，移入无菌操作台内，操作步骤与免疫脾细胞制备方法相同。在腹中部剪小口，撕开皮肤，用5ml注射器吸取含hat的完全1640培养基5ml，用消毒镊子提起腹膜，小心插入针头，注入培养液，按摩后抽回，重复一次，两次吸取液混合。与研磨并离心重悬后脾细胞混合加hat完全培养基至100～150ml，然后铺10块96孔细胞板，每孔100～150μl，放5％co2培养箱，37℃过夜备用。
32.b.免疫脾细胞的制备
33.强化免疫小鼠，眼眶放血收集阳性血清，75％酒精浸泡5min，固定小鼠，无菌取脾脏，加3ml基本1640匀浆器中研磨，补加基本1640至10ml，静置2min，吸上层于50ml离心管中，再补加10ml的1640于匀浆器中，重复洗两次。
34.c.骨髓瘤细胞的制备
35.将小鼠脱颈椎处死，用75％的酒精浸泡5min消毒。将小鼠背面朝上固定置解剖板，无菌状态下剥开皮毛，将取下的肿瘤块放入匀浆器中。先加5ml基础1640培养基，轻轻研磨，研磨充分后再补加10ml基础1640培养基，混匀后静置2min，轻轻吸取上清5ml至50ml无菌离心管，然后再补加10ml基础1640培养基两次，每次补加后混匀静置2min，第一次吸出10ml，第二次全部吸出，最后一次吸取时可适当弃掉底部3ml左右液体，避免吸取时吸到大的组织块。1000r/min离心10min，弃去上清，用基础1640培养基重悬细胞，将细胞悬液体积保持在30ml左右。在另一个50ml离心管中加入大约20ml淋巴细胞分离液，将上步中的细胞悬液贴壁缓慢加入淋巴细胞分离液上方(细胞悬液与淋巴细胞分离液体积比例为(1:1～2:1)。1200r/min离心10～15min，吸取液面分界线处的白色致密细胞层，用基础1640培养基洗涤两次，最终用10ml基础1640培养基重悬细胞并计数。
36.d.细胞融合
37.将分离的骨髓瘤细胞和免疫脾细胞按照1:10或1:5的比例充分混匀，离心，骨髓瘤细胞(1～2
×
107)与免疫脾细胞(1
×
108)于50ml离心管混匀，1200r/min离心10min。用无菌
滤纸吸净离心管壁上残余的培养基液体，以免融合剂的作用浓度受到影响，轻弹离心管底部使细胞团块略微松动，离心后的脾细胞与骨髓瘤细胞的混合团块需拍成云雾状，待彻底拍成云雾状。提前将50％peg4000融合剂置于37℃温箱预热。融合过程应置于37℃水浴中进行，将37℃预热的50％peg4000取出0.8ml，1min内加入离心管底部的细胞团中，尽量减少枪头对细胞与细胞之间的碰撞，边加边匀速转动加完之后，用一次性胶头轻轻搅拌30s，加完后匀速转动30s待融合剂充分作用。缓慢加入基础1640培养基(提前37℃预热)终止融合反应。前2min加入2ml(即60s对应1ml)在第3～4min内加入3ml，在第5min内加入5ml，最后加入约30ml终止反应，整个操作尽量在10min之内完成。1000r/min离心8min，弃去上清，将细胞沉淀于37℃温箱放置5～8min。用含有预先制备的饲养细胞的hat培养基(提前37℃预热)轻轻重悬细胞沉淀，铺于96孔细胞板中培养，每孔100μl。置于培养箱(37℃，5％co2)中培养。
38.4.杂交瘤细胞筛选
39.融合后第一天补加hat完全1640培养基50μl，以后3天尽量少移动培养板，每天观察细胞，以检查污染、ph值及集落生长情况。如有污染，立即用强酸或强碱处理。融合后的第4天换ht完全1640培养基每孔200μl，第7天补加ht完全1640培养基50μl，对单个、多个细胞克隆的孔分别作出标记。当细胞集落长至培养孔1/4～1/3左右时，用间接elisa检测细胞培养的上清。在进行间接elisa检测细胞上清效价时，每孔吸出50μl作为一抗，二抗为稀释度1:10000的辣根过氧化酶标记的羊抗鼠igg(h l)。用提取的沙林鼠种布鲁氏菌脂多糖(lps)和大肠杆菌脂多糖(lps)分别作为包被抗原，elisa检测筛选阳性值高和阴性值低的孔，视为阳性杂交瘤细胞。将对应的阳性杂交瘤细胞做好标记，补加ht培养基准备扩大，准备做亚克隆。
40.将第一次筛选出的杂交瘤细胞用上述同样的筛选方法进行第二次筛选和第三次筛选，最终得到两株能稳定分泌抗沙林鼠种布鲁氏菌脂多糖(lps)的阳性杂交瘤细胞株，命名为2h2和3b9。
41.5.小鼠腹水单克隆抗体的制备及纯化
42.将建立的阳性细胞株2h2和3b9进行扩大培养，连续培养3到4代后，间接elisa方法检测细胞上清效价，依然较高的效价，则这两株细胞株用于制备腹水。
43.预刺激：选择8～10周龄的雌性balb/c小鼠，首先腹腔注射弗氏不完全佐剂500μl/只。5～7天后腹腔注射杂交瘤细胞，扩大培养的杂交瘤细胞用基础1640培养基重悬，1000r/min离心10min。每只小鼠大约注射5
×
105～1
×
106细胞，注射量控制在每只小鼠300μl左右。注射后第7天左右开始观察小鼠腹腔是否明显膨大，待小鼠行动不便时，先用酒精棉擦拭小鼠腹部，再用20ml注射器针头插入小鼠腹部便于腹腔液体流出，同时注意针眼存在会对小鼠造成感染，做好消毒工作。10000 r/min，4℃离心15 min吸取上清即为腹水，弃掉上部的油脂成分，弃掉底部可能有的红细胞等杂质，于-80℃冻存。
44.将rprotein g beads 4ff装入合适的层析柱，层析用5倍株体积的结合buffer进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用。将样品加到平衡好的rprotein g beads 4ff中(保证目的蛋白与rprotein g beads 4ff充分接触，提高目的蛋白的回收率)，收集流出液。用10～15倍柱体积的洗杂buffer进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。使用5～10倍柱体积的洗脱buffer，收集洗脱液，即目的蛋白组分。依次使用3倍柱体积的结合buffer和5倍柱体积的纯水平衡填料，最后再用5倍柱体积的
20％的乙醇平衡，然后保存在等体积的20％的乙醇中，置于4℃保存，防止填料被细菌污染。将洗脱液置于pbs(ph7.0,0.01m)中透析24 h，收集纯度较高的洗脱液，保存-80℃备用。
45.将上述纯化前和纯化后的腹水进行elisa效价测定，结果如下：
46.杂交瘤细胞株2h2纯化前和纯化后的腹水效价elisa测定结果
[0047][0048]
杂交瘤细胞株3b9纯化前和纯化后的腹水效价elisa测定结果
[0049][0050]
6.单克隆抗体亚型鉴定
[0051]
首先将试剂盒恢复至室温，然后用纯水把清洗液配成工作浓度(一份浓缩清洗液加19份纯水)。取出酶标板。每个样本需要8孔，阳性对照8孔，阴性对照8孔。多余的用自封袋保存，记得放入干燥剂。将细胞上清(或特异亲和纯化的抗体)50μl加入酶标微孔板，每个标本加8孔，阳性对照和阴性对照也是各加8孔每孔50μl。然后每孔再加入50μl标本稀释液。贴上封板膜37℃温育30～40 min。弃去板内液体，洗板5遍后在不掉纤维的吸水材料上拍干或机洗5遍。再在每个标本的8孔中分别加入8种酶标二抗(igg1、igg
2a
、igg3、igg
2b
、iga、igm、igκ、igλ)各100μl，通用阳性对照的8孔也一样。在加样或酶标板上做好标记。贴上封板膜37℃避光温育30～40min。吸弃板内液体，洗板5遍后在不掉纤维的吸水材料上拍干或机洗5遍。每孔分别加入显色剂a和显色剂b共100μl，换一张新的封板膜贴板避光37℃显色15min。本试剂盒特异性好一般肉眼即可观察出结果，看显色蓝的那个孔所对应的酶标二抗就知道此样本的ig类或亚类。加入反应终止液(每孔50μl)终止反应后用酶标仪od
450nm
测定吸光度。
[0052]
结果显示，沙林鼠种布鲁氏菌脂多糖单克隆抗体2h2和3b9株的重链亚型均为igg1，轻链类型均为κ型。
[0053]
7.单克隆抗体浓度检测
[0054]
使用bca蛋白浓度测定试剂盒检测抗体浓度，根据试剂盒说明书进行具体操作即可。结果显示，步骤5中，纯化后的腹水中，沙林鼠种布鲁氏菌脂多糖单克隆抗体2h2和3b9株测浓度分别为8.775和4.256mg/ml。
[0055]
8.单克隆抗体效价检测
[0056]
将单克隆抗体2h2和3b9株分别用稀释液(pbs)从1000倍和500倍开始进行倍比稀释，采用间接elisa试验方法，检测效价。结果表明效价为1:512000和1:256000，其纯度和效价高，亲和性好，结合能力强，特异性良好。
[0057]
9.单抗特异性的western blot检测
[0058]
以提取的沙林鼠种布鲁氏菌脂多糖(lps)包被酶标板，经过三次有限稀释法筛选出针对沙林鼠种布鲁氏菌脂多糖(lps)的阳性细胞株2h2和3b9，分别用纯化后的腹水，按1:2000稀释，4℃过夜孵育pvdf膜，pbs稀释igg(h l)，按1:5000稀释。western blot结果表明，纯化后的抗体均能与布鲁氏菌属发生特异性结合，且不与大肠杆菌、肠炎沙门氏菌及人苍白杆菌反应(图2)。
[0059]
以上结果表明，杂交瘤细胞2h2分泌的单克隆抗体，无论是从蛋白浓度还是从抗体效价都显著优于杂交瘤细胞3b9分泌的单抗，因此，将杂交瘤细胞2h2于2021年6月3日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：杂交瘤细胞株2h2，保藏编号：cctcc no:c2021134，地址：中国武汉武汉大学。
[0060]
10.酶标单抗及效价测定
[0061]
辣根过氧化物酶(hrp)标记纯化后的沙林鼠种布鲁氏菌脂多糖单克隆抗体2h2，结果表明纯化后的腹水，酶标后2h2单抗效价达到1:64000。
[0062]
具体如下表所示：
[0063][0064]
实施例2：
[0065]
2h2单抗elisa检测沙林鼠种布鲁氏菌的检测条件的确定：
[0066]
1.抗体包被浓度和酶标单抗稀释度的确定
[0067]
运用方阵滴定试验，确定抗体最佳包被浓度和酶标单抗稀释度，结果表明沙林鼠种布鲁氏菌脂多糖(lps)的2h2单抗包被稀释度为1:128000和酶标2h2单抗稀释度为1:16000时，测得阳性od
450nm
值与阴性od
450nm
值的值分别是1.142、0.087。考虑到抗体使用过程存在损耗，故包被2h2单抗的稀释度为1:100000，酶标2h2单抗的稀释度为1:15000。
[0068]
抗体包被浓度和酶标单抗稀释度的确定
[0069][0070][0071]
2.最佳封闭时间的确定
[0072]
结果表明，在37℃封闭2.5h的条件下，阳性布鲁氏菌od
450nm
值与阴性od
450nm
值的比值(p/n)最高，且比值为40.860，故选择37℃封闭2.5h(图3)。
[0073]
3.样品最佳孵育条件的确定
[0074]
结果表明，在37℃作用1h的条件下，阳性布鲁氏菌的od
450nm
值与阴性od
450nm
值的比值(p/n)最高，且比值为31.239，故抗原样品孵育时间为1h(图4)。
[0075]
4.底物作用时间的确定
[0076]
结果显示，在37℃避光作用15min的条件下，阳性布鲁氏菌的od
450nm
值与阴性od
450nm
值的比值(p/n)最高，且比值为26.800，故作用时间为15min，具体如下表所示：
[0077][0078]
5.布鲁氏菌双抗夹心elisa阴性临界值的确定
[0079]
通过判定30份阴性牛鼻拭子分泌物od
450nm
值，通过spss 17.0处理试验数据17.0处理试验数据从而确定阴性最大临界值为0.189，但考虑测od
450nm
值时存在波动，故设定阴性临界值为0.247，阴性临界值的确定如下表所示：
[0080][0081][0082]
上述表格中，p为阳性对照，为灭活的沙林鼠种布鲁氏菌菌液，浓度为3
×
109cfu/ml。
[0083]
实施例3：
[0084]
2h2单抗在制备布鲁氏菌elisa检测试剂盒中的应用：
[0085]
沙林鼠种布鲁氏菌双抗夹心elisa检测抗原方法：
[0086]
(1)包被：2h2单抗抗体包被稀释度为1:100000，100μl/孔，4℃孵育过夜。
[0087]
(2)洗板：洗涤液250μl/孔，洗4～5次，每次3min。
[0088]
(3)封闭：2％bsa封闭液200μl/孔，37℃孵育2.5h。
[0089]
(4)同(2)。
[0090]
(5)加入待检抗原或样品，100μl/孔，37℃孵育1h。
[0091]
(6)同(2)。
[0092]
(7)酶标单抗：故酶标2h2单抗稀释度为1:15000，100μl/孔，37℃孵育1h。
[0093]
(8)同(2)。
[0094]
(9)底物：tmb单组份显色液100μl/孔，37℃孵育15min。
[0095]
(10)终止液：终止液50μl/孔。
[0096]
(11)读数：酶标仪读取od
450nm
处数值。
[0097]
判定标准为：当od
450nm
数值＞0.247时，为布鲁氏菌阳性。
[0098]
特异性实验：
[0099]
对沙林鼠种布鲁氏菌、羊种布鲁氏菌、布鲁氏菌弱毒株m5-90、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、人苍白杆菌、pbs进行检测。结果显示，只与布鲁氏菌属发生特异性反应，对沙林鼠种布鲁氏菌的反应最佳，表明试剂盒的特异性较好(图5)。本特异性实验中，待测菌液的菌浓度均为3
×
109cfu/ml。
[0100]
敏感性试验：
[0101]
将沙林鼠种布鲁氏菌菌体从3
×
109cfu/ml稀释至3
×
101cfu/ml，检测抗原敏感性的结果表明，通过阴性临界值的确定试验，表明菌体抗原最低稀释度为3
×
105cfu/ml。
[0102]