一种薯蓣皂苷元的提取方法与流程

1.本发明属于活性物质提取技术领域，尤其涉及一种薯蓣皂苷元的提取方法。


背景技术：

2.薯蓣皂苷元(diosgenin)俗称皂素，是一种植物自然合成的甾体皂苷元，结构式为c
27h42
o3，相对分子质量为414.63，薯蓣皂苷元广泛存在于豆科和薯蓣科植物中。薯蓣皂苷元可以从盾叶薯蓣、穿龙薯蓣、黄山药、紫黄姜等植物的块茎中提取获得。薯蓣皂苷元是生产甾体激素类药物的重要基础原料，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化等多种显著的药理作用，有很广泛的药用价值。
3.在植物体内，薯蓣皂苷元是与葡萄糖、鼠李糖结合成薯蓣皂苷(dioscin)形式而存在。提取分离时，一般是先用稀酸将薯蓣皂苷水解成薯蓣皂苷元与单糖；因薯蓣皂苷元不溶于水，混存于植物残渣中，故可用有机溶剂(如石油醚)直接从植物残渣中提取出薯蓣皂苷元。但是，由于薯预皂苷与纤维素结合存在于细胞壁中，加之植物细胞壁比较坚韧，因此经典的直接酸水解法很难将薯预皂苷元提取完全，另外，传统的有机溶剂回流萃取薯蓣皂苷元的分离提纯技术耗时(一般时常达6h以上)且为粗提物含多种杂质，往往达不到所需要的纯度要求。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种操作简单、提取率高和杂质占比少的薯蓣皂苷元的提取方法。
5.本发明提供了一种薯蓣皂苷元的提取方法，包括以下步骤：
6.1)将薯蓣根状茎切片、烘干、粉碎获得薯蓣粉；
7.2)将步骤1)获得的薯蓣粉与水混合、发酵获得发酵薯蓣粉；
8.3)将所述发酵薯蓣粉与盐酸混合、水解、抽滤，收集滤渣；
9.4)将所述滤渣烘干后用甲醇复溶，超声提取、过滤获得滤液；
10.5)将步骤4)获得的滤液进行高效液相色谱分析，收集薯蓣皂苷元峰对应的洗脱液获得薯蓣皂苷元。
11.优选的，步骤1)中所述烘干包括第一烘干和第二烘干，所述第一烘干的温度为75～85℃，所述第一烘干的时间为4～6min，所述第二烘干的温度为45～55℃，所述第二烘干至物料为恒重时结束。
12.优选的，步骤1)所述粉碎后的物料过50～70目筛，收集筛下组分获得薯蓣粉。
13.优选的，步骤2)中所述薯蓣粉与去离子水的料液比为80～120mg∶1ml，所述发酵的温度为38～42℃，所述发酵的时间为40～60h。
14.优选的，步骤3)所述盐酸的浓度为2.3～2.7mol/l；所述发酵薯蓣粉与盐酸的料液比为4～6mg∶1ml。
15.优选的，所述水解的温度为98～102℃，所述水解的时间为3～5h，所述水解为回流
水解。
16.优选的，步骤3)所述水解后、过滤前，还包括调节ph至中性的步骤。
17.优选的，步骤4)中所述的超声提取的超声功率为150～200w，所述超声提取的频率为35～45hz，所述超声提取的时间为25～35min。
18.优选的，步骤4)中所述过滤为滤膜过滤，所述滤膜的孔径为0.2～0.3μm。
19.优选的，所述高效液相色谱分析的条件如下：色谱柱，c18反相hplc色谱柱，流动相a为水，流动性b为乙腈，流速为0.9～1.1ml/min，检测波长为紫外210nm，洗脱梯度如下：
[0020][0021]
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明提供的薯蓣皂苷元的提取方法将薯蓣根状茎在粉碎前进行两次烘干，75～85℃，4～6min烘干步骤能够使薯蓣根状茎中分解甾体皂苷的酶失活，提高薯蓣皂苷元的提取率。从而避免长时间室温放置或传统方法中直接采用45～55℃烘干过程使薯蓣中甾体皂苷发生分解，导致提取率下降；本发明所述方法中还包括发酵的步骤，所述发酵步骤的作用是让薯蓣粉浸润自然发酵数天，有助于材料中淀粉分解，植物体疏松而提高薯蓣皂苷元的提取率。避免经典的直接酸水解法很难将薯预皂苷元提取完全的缺点。
[0022]
进一步的，本发明所述提取方法是在添加自然发酵过程的基础上，重新对经典的直接酸解过程中的盐酸的浓度以及水解的时间进行了限定，在上述盐酸浓度以及水解时间进行水解获得的薯蓣皂苷元的含量高。从而在保证薯蓣皂苷元高提取率的前提下，降低盐酸的浓度和减少酸水解的时间，避免盐酸浓度太高和耗时太多，导致水解费用增高，效益降低。
[0023]
进一步的，本发明所述提取方法中采用新型高效的超声波技术，利用其产生的强烈的空化效应、机械粉碎作用以及热效应等，可以加速薯蓣皂苷元的溶出，从而提高浸出率，缩短提取时间，同时可以避免回流萃取时高温对薯蓣皂苷元的影响，也进一步降低了操作成本。避免了传统的有机溶剂回流萃取薯蓣皂苷元的分离提纯技术提取率低、耗时和污染性强等缺点。
[0024]
进一步的，本发明所述提取方法中采用高效液相色谱进行分离富集，获得的薯蓣皂苷元纯度更高可达100％；所述高效液相色谱具有分离富集和检测的双重作用。该方法操作简单，方便，安全性高，污染性小。避免了传统的有机溶剂回流萃取薯蓣皂苷元的分离提纯技术为粗提物含多种杂质，往往达不到所需要的纯度要求的缺点。
附图说明
[0025]
图1为薯蓣皂苷元标准品溶液色谱图；
[0026]
图2为菊叶薯蓣粗提取物溶液色谱图；
[0027]
图3为薯蓣皂苷元标准曲线图。
具体实施方式
[0028]
本发明提供了一种薯蓣皂苷元的提取方法，包括以下步骤：1)将薯蓣根状茎切片、烘干、粉碎获得薯蓣粉；2)将步骤1)获得的薯蓣粉与水混合、发酵获得发酵薯蓣粉；3)将所述发酵薯蓣粉与盐酸混合、水解、抽滤，收集滤渣；4)将所述滤渣烘干后用甲醇复溶，超声提取、过滤获得滤液；5)将步骤4)获得的滤液进行高效液相色谱分析，收集薯蓣皂苷元峰对应的洗脱液获得薯蓣皂苷元。
[0029]
在本发明中，将薯蓣根状茎切片、烘干、粉碎获得薯蓣粉。本发明对所述薯蓣根状茎的来源没有特殊限定，采用本领域常规来源的薯蓣根状茎即可，在本发明具体实施过程中，所述薯蓣根状茎优选的来源于3年生菊叶薯蓣根状茎。本发明中，优选的将所述薯蓣根状茎清洗干净后，置于阴凉处晾至表面无明显水分后，进行切片。在本发明中，所述切片的厚度优选为40～60mm；本发明在所述切片后进行烘干，所述烘干优选的包括第一烘干和第二烘干，所述第一烘干的温度为75～85℃，进一步优选为78～82℃，更进一步优选为80℃；所述第一烘干的时间优选为4～6min，进一步优选为5min；所述第二烘干的温度优选为45～55℃，进一步优选为48～52℃，更进一步优选为50℃；在本发明中，所述第二烘干至物料为恒重时结束。在本发明中，所述烘干优选的在烘箱中进行。本发明在所述烘干后进行粉碎，所述粉碎后的物料过筛，收集筛下组分获得薯蓣粉。在本发明中，所述过筛的目数优选为50～70目，进一步优选为60目。
[0030]
本发明在获得所述薯蓣粉后，将获得的薯蓣粉与水混合、发酵获得发酵薯蓣粉。在本发明中，所述薯蓣粉与去离子水的料液比优选为(80～120)mg∶1ml，进一步优选为(90～110)mg∶1ml，更进一步优选为100mg∶1ml；所述发酵的温度优选为38～42℃，进一步优选为39～41℃；所述发酵的时间优选为40～60h，进一步优选为45～55h，更进一步优选为48h。在本发明中，所述发酵步骤的作用是让薯蓣粉浸润自然发酵数天，有助于材料中淀粉分解，植物体疏松而提高薯蓣皂苷元的提取率。
[0031]
本发明在获得所述发酵薯蓣粉后，将所述发酵薯蓣粉与盐酸混合、水解、过滤，收集滤渣。在本发明中，所述盐酸的浓度优选为2.3～2.7mol/l，进一步优选为2.4～2.6mol/l，更进一步优选为2.5mol/l；所述发酵薯蓣粉与盐酸的料液比优选为(4～6)mg∶1ml，进一步优选为5mg∶1ml。在本发明中，所述水解的温度优选为98～102℃，进一步优选为99～101℃，更进一步优选为100℃；所述水解的时间优选为3～5h，进一步优选为4h；所述水解优选为回流水解，本发明对所述回流水解没有特殊限定，采用本领域常规的回流设备进行回流水解即可。
[0032]
本发明在所述水解后、过滤前，优选的还包括调节ph至中性的步骤，在本发明具体实施过程中，优选的采用氢氧化钠溶液调节ph，所述氢氧化钠溶液的浓度优选为1.5～2.5mol/l，进一步优选为1.8～2.2mol/l，更进一步优选为2mol/l。在本发明中，所述抽滤优选的采用布氏漏斗进行。
[0033]
本发明在获得所述滤渣后，将所述滤渣烘干后用甲醇复溶，超声提取、过滤获得滤液。在本发明中，优选的将所述滤渣连同滤纸一同烘干，所述烘干的温度优选为98～102℃，进一步优选为100℃，所述烘干的时间为1.5～2.5h，进一步优选为2h。本发明在所述烘干
后，优选的将所述滤渣连同滤纸用甲醇复溶，所述甲醇优选为色谱级甲醇，所述甲醇与原料薯蓣粉的比例优选为(50～150)mg:(15～25)ml，进一步优选为(80～120)mg:(18～22)ml，更进一步优选为100mg:20ml。在本发明中，所述超声提取的超声功率优选为150～200w，进一步优选为160w～190w，更进一步优选为180w；所述超声提取的频率优选为35～45hz，进一步优选为38～42hz，更进一步优选为40hz；所述超声提取的时间优选为25～35min，进一步优选为28～32min，更进一步优选为30min。在本发明中，采用超声提取的方法提取薯蓣皂苷元具有得率高、时间短、能耗低等优势。
[0034]
在本发明中，所述过滤优选为滤膜过滤，所述滤膜的孔径优选为0.2～0.3μm，进一步优选为0.22μm。
[0035]
本发明在获得所述滤液后，将获得的滤液进行高效液相色谱分析，收集薯蓣皂苷元峰对应的洗脱液获得薯蓣皂苷元。在本发明中，所述高效液相色谱分析的条件优选如下：色谱柱，c18反相hplc色谱柱，流动相a为水，流动性b为乙腈，流速为0.9～1.1ml/min，进一步优选为1.0ml/min；检测波长为紫外210nm，洗脱梯度如表1所示。
[0036]
表1洗脱梯度程度
[0037][0038]
在本发明中，所述超高效液相色谱分析还包括利用薯蓣皂苷元标准品制备标准品溶液，然后对标准品溶液进行稀释，检测不同浓度的标准品溶液对应的峰面积，以标准品溶液的薯蓣皂苷元浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标制备标准曲线；利用待测样品的峰面积和标准曲线计算待测样品中薯蓣皂苷元的浓度，进而计算薯蓣皂苷元的提取率。在本发明中，所述薯蓣皂苷元标准品购自上海源叶生物科技有限公司，纯度≥98％。本发明所述标准曲线的制备方法以及检测线性范围参见实施例记载，在此不再赘述。
[0039]
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0040]
实施例1
[0041]
设备和原料
[0042]
高效液相色谱仪(依利特3100系统，3100紫外检测器)；csim-180d超声波清洗机，(中国科工卫(科学、工业、卫生)仪器仪表有限公司)；砂芯过滤装置；0.22μm滤膜(购自津隆(天津)商贸有限公司)。
[0043]
薯蓣皂苷元标准品(上海源叶生物科技有限公司)，纯度≥98％。
[0044]
菊叶薯蓣根状茎来源于老挝，为墨西哥引进品种，为3年生。
[0045]
甲醇、乙腈为色谱纯；盐酸为分析纯。
[0046]
提取方法
[0047]
取薯蓣根状茎，洗净后，在阴凉处晾至表面无明显水分，切成40～60mm的薄片。将
薄片置于80℃烘箱中5min，使根状茎中能够分解甾体皂苷的酶失活。之后将薄片放入50℃烘箱中直至烘干至恒重。粉碎，过60目筛，装袋，记录，4℃避光保藏。
[0048]
准确称取干燥好的粉末100mg，置三角烧瓶内，用1ml去离子水浸透，置于40℃恒温箱中发酵48h；加入2.5mol/l盐酸20ml，水浴加热至100℃，回流水解4h；冷却至室温，用2mol/l氢氧化钠溶液中和反应后的酸液至中性，用布式漏斗抽滤，残渣于100℃，2h烘干；将滤渣连同滤纸一起用色谱级甲醇20ml复溶并180w，40hz超声萃取30min；取1ml过0.22μm微孔有机滤膜，进行高效液相定量检测。
[0049]
高效液相定量检测条件如下：
[0050]
色谱柱，c18反相hplc色谱柱，流动相a为水，流动性b为乙腈，流速为1.0ml/min；检测波长为紫外210nm，洗脱梯度如表1所示，柱温为室温。
[0051]
表1洗脱梯度程度
[0052][0053]
(一)标准品溶液
[0054]
精密称取20mg薯蓣皂甙元标准品用色谱级甲醇定容至20ml，溶液浓度为1.0mg/ml，薯蓣皂甙元浓度为0.98mg/ml。用0.22μm微孔有机滤膜过滤，作为备用。
[0055]
(二)样品溶液
[0056]
样品溶液制备见上述提取方法步骤。
[0057]
将配制好的标准品溶液进行梯度稀释，配制成浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml标准系列溶液，用hplc测定皂苷元含量，以峰面积y对标准溶液浓度x进行线性回归，得到线性回归方程为y＝5917.9x-3.2811，r2＝0.9996，其中x的单位为mg/ml，y的单位为mau.s；线性范围为0.1～0.5mg/ml。绘制的薯蓣皂苷元标准曲线见图3。
[0058]
按照上述高效液相定量检测条件上样薯蓣总皂甙元粗提物进行检测。测得3年生菊叶薯蓣总皂甙元粗提物中薯蓣皂苷元的浓度为0.185mg/ml。即100mg的3年生菊叶薯蓣粉可提得3.7mg的薯蓣皂苷元。
[0059]
结果如图1和图2所示，在上述限定的条件下，薯蓣皂苷元与待测样品中其他组分色谱峰可基线分离，分离效果较好。薯蓣皂苷元标准品、待测样品的高效液相色谱图见图1和图2，其中箭头所指峰为薯蓣皂苷元峰。
[0060]
对比例1
[0061]
按照实施例1中记载的提取方法进行薯蓣皂苷元的提取，区别在于盐酸浓度为2mol/l。
[0062]
对比例2
[0063]
按照实施例1中记载的提取方法进行薯蓣皂苷元的提取，区别在于盐酸浓度为3mol/l。
[0064]
对比例3
[0065]
按照实施例1中记载的提取方法进行薯蓣皂苷元的提取，区别在于水解时间为6h。
[0066]
对比例4
[0067]
按照实施例1中记载的提取方法进行薯蓣皂苷元的提取，区别在于水解时间为8h。
[0068]
提取物中薯蓣皂苷元的含量结果如表2所示。
[0069]
表2不同盐酸浓度以及提取时间对提取获得的薯蓣皂苷元含量的影响
[0070][0071]
由上述实施例可知，本发明提供的薯蓣皂苷元的提取方法操作简单、提取率高。
[0072]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。