核酸探针组合物、预处理液、核酸检测试剂盒及检测方法

1.本发明涉及生物化学检测技术领域，特别是涉及核酸探针组合物、预处理液、核酸检测试剂盒及检测方法。


背景技术：

2.核酸检测即对dna和rna检测，是目前对病毒、细菌等最先进、可靠的检验方法。临床上常用于乙肝、丙肝、艾滋病、呼吸道病原体等的检测。目前核酸检测主要采用聚合酶链反应(pcr)、反转录-聚合酶链反应(rt-pcr)、环介导等温扩增(lamp)等核酸扩增技术，这些技术需要通过对温度的精准控制实现对目标核酸片段的扩增进而进行检测，具有提高检测特异性、降低假阳性概率等优势，但同时耗时长、需要专业人员操作、高度依赖仪器设备，无法实现便携、快速检测。
3.中国专利cn111593145a发明了一种crispr/cas12一步核酸检测方法及新型冠状病毒检测试剂盒，此方法相较于传统的rt-qpcr技术，可以将扩增和检测同步进行，实现一步、一体化的核酸检测。但此方法仍旧依赖于核酸扩增技术，即需要专业的仪器设备与人员进行操作，无法应用于资源短缺地区或大规模快速检测等应用场景。


技术实现要素：

4.基于此，有必要提供一种核酸探针组合物、预处理液、核酸检测试剂盒及检测方法，不需要pcr即可实现高灵敏度、低假阳性检测待测样品中的核酸。
5.一种核酸探针组合物，包括：
6.检测探针；
7.质控探针；
8.第一核酸探针，包括不重叠的第一序列区和第二序列区，所述第一序列区用于与待检测核酸的标记辅助序列区互补配对；
9.第二核酸探针，包括不重叠的第三序列区和第四序列区，所述第三序列区用于与待检测核酸的捕获辅助序列区互补配对，所述标记辅助序列区与所述捕获辅助序列区不同或者至少部分序列不同，所述第四序列区用于与所述检测探针互补配对；
10.报告探针，包括不重叠的第五序列区和第六序列区，所述第五序列区用于与所述质控探针互补配对；
11.信号放大探针，所述信号放大探针包括依次连接的放大链前置引导序列区和多个依次连接的放大序列区，其选自a)或b)；
12.a)所述放大序列区分别包括一段用于与所述报告探针的所述第六序列区互补配对的第一配对序列，所述放大链前置引导序列区用于与所述第一核酸探针的所述第二序列区互补配对；
13.b)所述信号放大探针包括多个级次，能够按照与所述第一核酸探针的结合的先后顺序由第一级次到更高级次逐级配对，低级次的信号放大探针的放大序列区至少包括一段
用于与高级次的信号放大探针的放大链前置引导序列区互补配对的第二配对序列；第一级次的信号放大探针的放大链前置引导序列区用于与所述第一核酸探针的第二序列区互补配对，最高级次的信号放大探针的放大序列区至少包括一段用于与所述报告探针的所述第六序列区互补配对的序列。
14.在其中一个实施例中，a)中所述第一配对序列相同；
15.或；
16.b)中同一个级次的所述信号放大探针上的所述第二配对序列相同。
17.3.根据权利要求1所述的核酸探针组合物，其特征在于，在同一个所述信号放大探针上，各所述放大序列区的序列相同。
18.在其中一个实施例中，在a)中，整个所述放大序列区能够与所述报告探针互补配对；
19.或者，在b)中，最高级次的所述信号放大探针的整个所述放大序列区能够与所述报告探针互补配对。
20.在其中一个实施例中，在b)中，非最高级次的信号放大探针中，所述最高级次的信号放大探针的放大序列区包括与相邻高级次的所述信号放大探针的放大链前置引导序列区互补配对的序列区以及与所述报告探针互补配对的序列区。
21.在其中一个实施例中，所述信号放大探针的长度为100bp～600bp。
22.在其中一个实施例中，所述放大序列区的个数为5～30个。
23.在其中一个实施例中，在b)中，所述信号放大探针有2级次、3级次、4级次或5级次。
24.在其中一个实施例中，所述第一核酸探针有多种，每种所述第一核酸探针的第一序列区不同，且与所述标记辅助序列区的配对位置不重叠。
25.在其中一个实施例中，所述第二核酸探针有多种，每种所述第二核酸探针的第三序列区不同，且与所述捕获辅助序列区的配对位置不重叠。
26.在其中一个实施例中，所述报告探针上连接有标记物。
27.在其中一个实施例中，所述标记物选自胶体金、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶中的任意一种或多种。
28.一种预处理液，包括溶剂以及所述的核酸探针组合物中所定义的第一核酸探针、第二核酸探针和信号放大探针。
29.在其中一个实施例中，所述溶剂选自柠檬酸钠溶液、sspe溶液、denhardt's溶液及磷酸盐溶液中的至少一种。
30.在其中一个实施例中，所述预处理液中的所述第一核酸探针、所述第二核酸探针和所述信号放大探针的摩尔比为(8～12):(0.8～1.2):(0.8～1.2)。
31.一种核酸检测试剂盒，包括核酸检测试纸条和所述的预处理液，所述核酸检测试纸条包括依次搭接的样品垫、连接垫、反应膜及吸水垫，所述连接垫上包被有报告探针，所述反应膜上设有相互间隔的检测线及质控线，所述检测线较所述质控线更靠近所述连接垫，所述检测线上包被有检测探针，所述质控线上包被有质控探针。
32.在其中一个实施例中，所述核酸检测试纸条放置在卡壳中，所述卡壳具有推拉结构。
33.一种核酸的检测方法，采用所述的核酸检测试剂盒，并包括以下步骤：
34.将待检测的待测样品与所述预处理液混合，得到待检测液；
35.将所述待检测液施加在所述样品垫上进行报告探针检测。
36.在其中一个实施例中，所述报告探针上连接的所述标记物包括酶，还包括：将所述待检测液施加在所述样品垫上0.5min～30min后，将所述酶的显色反应底物施加在所述样品垫上。
37.本发明的核酸检测系统不仅包含能够实现基本核酸检测的报告探针、检测探针、质控探针，还包括信号放大体系，通过第一核酸探针、第二核酸探针及一个或多个信号放大探针，待检测核酸、第一核酸探针、第二核酸探针及一个或多个信号放大探针、报告探针、检测探针及质控探针通过复杂的适配实现信号放大效果。通过各种方式的配合实现信号的放大，先人为将待检测核酸划分出标记辅助序列区和捕获辅助区。利用标记辅助区依次与第一核酸探针、一个或多个信号放大探针及报告探针的多级配对实现信号的放大，尤其是信号放大探针包括多个依次连接的放大序列区，与报告探针直接配对的信号放大探针中的每个放大序列区都能够与报告探针互补配对，从而使得一个信号放大探针上能够配对多个报告探针，实现报告探针的富集从而将待检测核酸在标记端的报告信号放大。通过在待检测核酸上形成分支链的方式实现标记信号放大和捕获方式信号放大，实现整个核酸检测的信号放大，大大降低检测灵敏度和假阳性的发生。
38.并且，本发明不限制待检测核酸的长度，可广泛适用于病毒、细菌等任何来源的核酸检测。待检测核酸的序列越长可用于信号放大的区域越多，信号放大越明显。
附图说明
39.图1为本发明一实施例的核酸检测试纸条的结构示意图；
40.图2为本发明一实施例的核酸检测试纸条装置的结构示意图；
41.图3为本发明实施例的核酸检测结果图。
具体实施方式
42.为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
43.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
44.本发明实施例提供一种核酸探针组合物，包括：检测探针、质控探针、报告探针、第一核酸探针、第二核酸探针、一个或多个信号放大探针。
45.第一核酸探针，包括不重叠的第一序列区和第二序列区，所述第一序列区用于与待检测核酸的标记辅助序列区互补配对。
46.第二核酸探针，包括不重叠的第三序列区和第四序列区，所述第三序列区用于与待检测核酸的捕获辅助序列区互补配对，所述标记辅助序列区与所述捕获辅助序列区不同
或者至少部分序列不同，所述第四序列区用于与所述检测探针互补配对。
47.报告探针，包括不重叠的第五序列区和第六序列区，所述第五序列区用于与所述质控探针互补配对。
48.信号放大探针，所述信号放大探针包括依次连接的放大链前置引导序列区和多个依次连接的放大序列区。
49.信号放大探针选自a)或b)。
50.a)所述放大序列区分别包括一段用于与所述报告探针的所述第六序列区互补配对的第一配对序列，所述放大链前置引导序列区用于与所述第一核酸探针的所述第二序列区互补配对。
51.b)所述信号放大探针包括多个级次，能够按照与所述第一核酸探针的结合的先后顺序由第一级次到更高级次能够逐级配对，低级次的信号放大探针的放大序列区至少包括一段用于与高级次的信号放大探针的放大链前置引导序列区互补配对的第二配对序列；第一级次的信号放大探针的放大链前置引导序列区用于与所述第一核酸探针的第二序列区互补配对，最高级次的信号放大探针的放大序列区至少包括一段用于与所述报告探针的所述第六序列区互补配对的序列。
52.本发明的核酸检测系统不仅包含能够实现基本核酸检测的报告探针、检测探针、质控探针，还包括信号放大体系，通过第一核酸探针、第二核酸探针及一个或多个信号放大探针，待检测核酸、第一核酸探针、第二核酸探针及一个或多个信号放大探针、报告探针、检测探针及质控探针通过复杂的适配实现信号放大效果。通过各种方式的配合实现信号的放大，先人为将待检测核酸划分出标记辅助序列区和捕获辅助区。利用标记辅助区依次与第一核酸探针、一个或多个信号放大探针及报告探针的多级配对实现信号的放大，尤其是信号放大探针包括多个依次连接的放大序列区，与报告探针直接配对的信号放大探针中的每个放大序列区都能够与报告探针互补配对，从而使得一个信号放大探针上能够配对多个报告探针，实现报告探针的富集从而将待检测核酸在标记端的报告信号放大。通过在待检测核酸上形成分支链的方式实现标记信号放大和捕获方式信号放大，实现整个核酸检测的信号放大，大大降低检测灵敏度和假阳性的发生。
53.并且，本发明不限制待检测核酸的长度，可广泛适用于病毒、细菌等任何来源的核酸检测。待检测核酸的序列越长可用于信号放大的区域越多，信号放大越明显。
54.上述的“人为将待检测核酸划分标记辅助区和捕获辅助区”，对于标记辅助区和捕获辅助区的划分没有特别的限制，基本的条件是这两个辅助区不完全重叠，优选是辅助区和捕获辅助区没有重叠的序列区段，从而可以保证第一核酸探针和第二核酸探针分别配对在待检测核酸的不同序列区，避免第一核酸探针、第二核酸探针与带检测核酸竞争性配对而出现假阴性现象。更优选地，标记辅助区和捕获辅助区分别划分在待检测核酸分子的5’端和3’端，或者是靠近5’端和靠近3’端的序列段。
55.所述信号放大探针可以仅有一级，也可以有2级次、3级次、4级次、5级次或更多级。
56.信号放大探针有一级时，该信号放大探针的放大链前置引导序列区与所述第一核酸探针的所述第二序列区互补配对，各放大序列区分别与至少一个报告探针互补配对。
57.信号放大探针有二级及以上时，第一级次的信号放大探针的放大链前置引导序列区与所述第一核酸探针的所述第二序列区互补配对，第一级次的各放大序列区分别与至少
一个第二级次的信号放大探针的放大链前置引导序列区互补配对，最高级次的信号放大探针的放大链前置引导序列区与相邻低级次的信号放大探针的放大序列区互补配对，最高级次的信号放大探针的各放大序列区分别与至少一个报告探针互补配对，第一级次和最高级次之间的其他级次的信号放大探针的放大链前置引导序列区分别与相邻低级次的信号放大探针的放大序列区互补配对。
58.具体的，信号放大探针有二级时，第一级次的信号放大探针的放大链前置引导序列区与所述第一核酸探针的所述第二序列区互补配对，第一级次的信号放大探针的放大序列区与第二级次的信号放大探针的放大链前置引导序列区互补配对；第二级次的信号放大探针的各放大序列区分别与至少一个报告探针互补配对。
59.在同一个所述信号放大探针上，各放大序列区的的序列可以不完全相同，但至少每个放大序列区都应包括一段配对区实现与报告探针或相邻高级次的信号放大探针互补配对。
60.在一些实施方式中，在同一个所述信号放大探针上，各所述放大序列区的所述配对序列相同。即，在同一个信号放大探针上各放大序列区形成多个配对分支，各配对分支除了与报告探针或相邻高级次的信号放大探针互补配对的配对区，各放大序列区的未参与配对的序列也相同，以此使得配对分支结构更整齐，提高空间利用，使得各放大序列区的配对位得到充分配对。a)中所述第一配对序列相同；或；b)中同一个级次的所述信号放大探针上的所述第二配对序列相同。
61.在一些实施方式中，所述信号放大探针为一个，即在a)中整个所述放大序列区能够与所述报告探针互补配对。在一些实施方式中，所述信号放大探针为多个，即在b)中最高级次的所述信号放大探针的整个所述放大序列区能够与所述报告探针互补配对。即，信号放大探针的整个所述放大序列区均是配对序列区。
62.优选的，在同一个所述信号放大探针上，各所述放大序列区的序列相同。即，放大链前置引导序列区与多个重复的放大序列区依次相连。
63.在一些实施方式中，所述信号放大探针为多个，即在b)中非最高级次的信号放大探针中，所述最高级次的信号放大探针的放大序列区包括与相邻高级次的所述信号放大探针的放大链前置引导序列区互补配对的序列区以及与所述报告探针互补配对的序列区。即，在多级次的信号放大探针中，除最高级次外，各级次的信号放大探针的放大序列区能够既与相邻高级次的信号放大探针互补配对，同时也与报告探针互补配对。
64.在一些实施方式中，放大链前置引导序列区上也包括与所述报告探针互补配对的序列区。
65.在一些实施方式中，所述信号放大探针的长度可以为100bp～600bp。这里为单个信号放大探针的长度。
66.在一些实施方式中，所述信号放大探针的放大链前置引导序列的长度可为10bp～20bp。
67.在一些实施方式中，所述信号放大探针的单个放大序列区的的长度可为10bp～30bp。
68.在一些实施方式中，每个信号放大探针的所述放大序列区的个数可以为5～30个。
69.在一些实施方式中，所述第一核酸探针有多种，每种所述第一核酸探的第一序列
区不同，且与所述标记辅助序列区的配对位置不重叠。即，将待检测核酸划分为多个标记辅助区，各标记辅助区分别与一第一核酸探针互补配对，在一个待检测核酸分子上形成多个标记辅助序列区配对的分支，进一步提高信号放大的程度。
70.在一些实施方式中，所述第二核酸探针有多种，每种所述第二核酸探针的第三序列区不同，且与所述捕获辅助序列区的配对位置不重叠。即，将待检测核酸划分为多个捕获辅助区，各标记辅助区分别与一第二核酸探针互补配对，在一个待检测核酸分子上形成多个捕获辅助序列区配对的分支，进一步提高信号放大的程度。
71.在一些实施方式中，所述报告探针上连接有标记物，该标记物用于信号检测。
72.如本文所用的术语“标记物”指可用于提供可检测的(优选可定量的)效果且可以连接至核酸或蛋白的任何原子或分子。标记物包括但不限于染料；放射性标记，诸如
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p；结合部分诸如生物素；半抗原诸如地高辛；发光、发磷光或发荧光部分；和单独的荧光染料或与可以通过荧光共振能量转移(fret)抑制或移动发射光谱的部分组合的荧光染料。标记物可以提供可通过荧光、放射性、比色、重量测定、x射线衍射或吸收、磁性、酶活性等检测的信号。标记可以是带电荷的部分(正电荷或负电荷)或可选地，可以是电荷中性的。标记物可以包括核酸或蛋白序列或由其组合，只要包含标记物的序列是可检测的。在一些实施方案中，核酸在没有标记物的情况下直接检测(例如，直接读取序列)。
73.在一些优选的实施方式中，所述标记物是荧光团、比色标记、量子点、生物素以及其他可以用于探测的标签分子(如用于拉曼衍射成像的炔烃基团，用于click反应的环烯烃，用于聚合物标记的引发集团)，也可以选自多肽/蛋白分子，lna/pna，非天然氨基酸及其类似物(比如拟肽)，非天然核酸及其类似物(拟核苷酸)和纳米结构(包括无机纳米颗粒，nv-center，聚集/组装诱导发光分子，稀土离子配体分子，多金属氧簇等)。更优选的，所述标记物选自胶体金、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶中的任意一种或多种。
74.本发明实施例还提供一种预处理液，包括溶剂以及上述任一实施方式的核酸探针组合物中所定义的第一核酸探针、第二核酸探针和信号放大探针。
75.该预处理液用于与上述任一实施方式的核酸探针组合物中所定义的检测探针、质控探针及报告探针相互配合以检测目的核酸。
76.该预处理液用于采用试纸条对核酸进行检测时作为待检测待测样品的预混液。
77.在一些实施方式中，所述溶剂选自柠檬酸钠溶液、sspe溶液(sspe：saline-sodium phosphate-edta)、denhardt's溶液及磷酸盐溶液中的至少一种。
78.在一些实施方式中，所述预处理液中的所述第一核酸探针、所述第二核酸探针和所述信号放大探针的摩尔比可以为(8～12):(0.8～1.2):(0.8～1.2)。优选为10:1:1。
79.本发明实施例还提供一种核酸检测试剂盒，包括核酸检测试纸条和所述的预处理液，所述核酸检测试纸条包括依次搭接的样品垫、连接垫、反应膜及吸水垫，所述连接垫上包被有所述的核酸探针组合物中所定义的报告探针，所述反应膜上设有相互间隔的检测线及质控线，所述检测线较所述质控线更靠近所述连接垫，所述检测线上包被有所述的核酸探针组合物中所定义的检测探针，所述质控线上包被有所述的核酸探针组合物中所定义的质控探针。
80.反应膜可以为硝化纤维素膜等。
81.核酸检测试纸条还包括底板，样品垫、连接垫、反应膜及吸水垫，搭接在该底板上。
82.在一些实施方式中，样品垫的制备步骤为：将玻璃纤维膜置于含有聚乙二醇辛基苯基醚和/或曲拉通x-100的溶液中浸泡0.1-12h，然后烘干并储存于干燥器中。该方法可以促进待测待测样品的流动，减少样品的滞留与堵塞。
83.标记有标记物的报告探针的具体形式可以为报告探针标记的胶体金、报告探针与辣根过氧化物酶共同标记的胶体金、辣根过氧化物酶修饰的报告探针或和碱性磷酸酶修饰的报告探针中的一种。
84.在一实施方式中，报告探针标记的胶体金的制备包括如下步骤：
85.制备胶体金(例如通过柠檬酸钠法)，然后在胶体金的表面修饰上报告探针，将制备溶液以5000-30000rpm的转速离心5-60min，去除游离的报告探针，得到报告探针修饰的胶体金。
86.在一实施方式中，报告探针与辣根过氧化物酶共同标记的胶体金的制备包括如下步骤：
87.制备胶体金，然后在胶体金的表面修饰上报告探针，将制备溶液以5000-30000rpm的转速离心5-60min，去除游离的报告探针，得到报告探针修饰的胶体金。然后加入辣根过氧化物酶，促使辣根过氧化物酶替代一部分报告探针，同样以5000-30000rpm的转速离心5-60min，去除过量的辣根过氧化物酶，得到报告探针与辣根过氧化物酶共同标记的胶体金。
88.在一实施方式中，辣根过氧化物酶修饰的报告探针的制备包括如下步骤：
89.将生物素修饰的报告探针与链霉亲和素修饰的辣根过氧化物酶混合反应，得到辣根过氧化物酶修饰的报告探针。
90.在一实施方式中，碱性磷酸酶修饰的报告探针的制备包括如下步骤：
91.将报告探针与碱性磷酸酶混合反应，得到碱性磷酸酶修饰的报告探针。
92.在一些实施方式中，连接垫的制备方法包括步骤：将连接垫置于含有牛血清蛋白和磷酸氢二钠的缓冲液中浸泡1-1000分钟，然后烘干并储存于干燥器中。将标记物标记的报告探针喷涂于连接垫，室温干燥保存。
93.在一些实施方式中，反应膜的制备方法包括如下步骤：将检测探针和质控探针分别修饰在反应膜基体上形成检测线(t线)和质控线(c线)，置于含有脱脂牛奶的三乙醇胺缓冲盐水溶液中浸泡，然后在室温下干燥并储存于干燥器中。
94.在一些实施方式中，反应膜基体上施加有链霉亲和素。所述检测探针的5’端修饰有生物素。所述质控探针的3’端修饰有生物素。通过反应膜基体上的链霉亲和素将质控探针和检测探针修饰在反应膜上。
95.在一些实施方式中，该核酸检测试剂盒还包括卡壳，核酸检测试纸条装在卡壳中，卡壳可具有壳体及推拉结构，推拉结构用于将该核酸检测试纸条拉入或者推出该卡壳的壳体，设置该卡壳结构更有利于检测中试纸条的使用便利。
96.本发明实施例还提供一种核酸的检测方法，采用所述的核酸检测试剂盒，并包括以下步骤：
97.将待检测的待测样品与所述预处理液混合，得到待检测液；
98.将所述待检测液施加在所述样品垫上进行报告探针检测。
99.根据报告探针上的标记物的不同，报告探针检测的方式不同。
100.报告探针检测包括裸眼检测部分或电子化检测部分。所述的裸眼检测为裸眼直接
观测到试纸条显色结果即检测结果。所述的电子化检测为使用光学方法收集经过辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶催化底物显色或增强化学发光进行信号放大后检测线和质控线的明场或荧光信号，通过图像分析得到检测结果。
101.在一些实施方式中，所述报告探针上连接的所述标记物包括酶，还包括：将所述待检测液施加在所述样品垫上0.5min～30min后，将所述酶的显色反应底物施加在所述样品垫上。
102.具体的，报告探针修饰有胶体金时，通过裸眼检测即可得到检测结果。检测线和质控线均显红色，则说明待测样品中含有目标核酸序列；检测线无色，质控线显红色，待测样品中无目标核酸序列。
103.具体的，连接垫上为报告探针和辣根过氧化物酶共同修饰的胶体金时，检测方法可以为：
104.将待测液滴加在样品垫上，在0.5-30min后，在样品垫滴加10-300μl缓冲液(如柠檬酸钠缓冲液)，等待0.5-30min；
105.将辣根过氧化物酶的显色反应底物滴加在样品垫上，在0.5-30min后可通过裸眼检测或电子化检测得到检测结果；
106.所述裸眼检测为，检测线和质控线均显深褐色，待测样品中含有目标核酸序列；检测线无色，质控线显深褐色，待测样品中无目标核酸序列；
107.所述的电子化检测为，检测线和质控线处的信号经过图像处理后，较试纸条其他位置的信号有明显不同，则待测样品中含有目标核酸序列；检测线处的信号经过图像处理后，较试纸条其他位置的信号无明显不同，待测样品中无目标核酸序列；
108.具体的，连接垫上为辣根过氧化物酶修饰的报告探针时，检测方法可以为：
109.将待测液滴加在样品垫上，在0.5-30min后，在样品垫滴加10-150μl化学发光反应液，等待5-30min后通过电子化检测得到检测结果；
110.所述的电子化检测为，检测线和质控线处的信号经过图像处理后，较试纸条其他位置的信号有明显不同，则待测样品中含有目标核酸序列；检测线处的信号经过图像处理后，较试纸条其他位置的信号无明显不同，待测样品中无目标核酸序列。
111.具体的，连接垫上为碱性磷酸酶修饰的报告探针时，检测方法可以为：
112.将待测液滴加在样品垫上，在0.5-30min后，在样品垫滴加10-150μl显色反应底物，等待5-30min后通过电子化检测得到检测结果；
113.所述的电子化检测为，检测线和质控线处的信号经过图像处理后，较试纸条其他位置的信号有明显不同，则待测样品中含有目标核酸序列；检测线处的信号经过图像处理后，较试纸条其他位置的信号无明显不同，待测样品中无目标核酸序列。
114.优选的，所述的柠檬酸钠缓冲液的浓度可为0.1mol/l～10mol/l。
115.以下为具体实施例。
116.实施例1(以sars-cov-2为例)
117.请参阅图1和图2，一种核酸检测装置及其检测方法，所述的检测方法采用核酸检测试纸条1作为反应单元，核酸检测试纸条1放置在卡壳2中，卡壳2具有推拉结构3。使用的核酸检测试纸条1包括底板4以及依次互相搭接固定于底板4上的样品垫5、连接垫6、硝化纤维素膜和吸水垫10；
118.所述的连接垫6固定有报告基团，报告基团为探针标记的胶体金；反应膜7基膜为硝化纤维素膜，其上设置有检测线8和质控线9；所述的检测线8固定有检测探针；所述的质控线9固定有质控探针。
119.检测探针5’端用生物素修饰，质控探针3’端用生物素修饰，硝化纤维素膜上附有链霉亲和素，检测探针和质控探针通过生物素-链霉亲和素结合固定在反应膜7上。
120.所述的样品垫5、连接垫6、硝化纤维素膜和吸水垫10相互重叠2mm，检测线8和质控线9的间隔为4mm，底板4宽度为4mm。
121.其中，
122.检测探针的序列为：
[0123]5’-
cccccccccccc-3’。
[0124]
质控探针的序列为：
[0125]5’-
cgttgtccctag-3’。
[0126]
第二核酸探针的序列为:
[0127]5’-
tgaggaacgagaagagggggggggggg-3’。
[0128]
第一核酸探针的序列为：
[0129]5’-
tttgtatgcgtcaatcctcggaagtgtgct-3’。
[0130]
第一级信号放大探针由一段放大链前置引导序列和相连的5个重复的放大序列区组成，放大链前置引导序列为：
[0131]5’-
gcacacttccgagg-3’。
[0132]
第一级信号放大探针的放大序列区的序列为：
[0133]5’-
aaaacgacaggaccga-3’。
[0134]
第二级信号放大探针由一段放大链前置引导序列和相连的5个重复的放大序列区组成，放大链前置引导序列为：
[0135]5’-
taatcggtcctgtcg-3’。
[0136]
第二级信号放大探针的放大序列区的序列为：
[0137]5’-
aaatgccgttgtccctag-3’。
[0138]
报告探针的序列为：
[0139]5’-
ctagggacaacgaaagcacttggtacgggcgctgact-3’。
[0140]
待检测目标核酸序列为：
[0141]5’-
tcttctcgttcctcaaaacgtggttgacctacaaaaattgacgcatacaaa-3’。
[0142]
具体检测方法为：
[0143]
将40μl浓度为10pmol的待测样品分散于60μl含有10nmol第一核酸探针、第二核酸探针、第一级信号放大链和第二级信号放大链的柠檬酸钠缓冲液得到待测液；
[0144]
将待测液滴加在样品垫5上，在5-30min后得到试纸条显色结果；检测线8无色，质控线9显红色，待测样品中无待测目标核酸序列。如图3所示。
[0145]
实施例2(以sars-cov-2为例)
[0146]
本实施例与制备方法同实施例1，不同之处在于连接垫6上固定的报告基团为报告探针与辣根过氧化物酶共同标记的胶体金。
[0147]
具体检测方法为：
[0148]
将40μl浓度为10pmol的待测样品分散于60μl含有10nmol标记辅助区互补引物、初级信号放大链和次级信号放大链的柠檬酸钠缓冲液得到待测液；
[0149]
将待测液滴加在样品垫5上，在5-30min后将60μl柠檬酸钠缓冲液滴加在样品垫5，1-15min后将60μl显色底物滴加在样品垫5，1-30min后得到试纸条显色结果；
[0150]
通过裸眼检测，检测线8和质控线9均显深褐色，待测样品中含有目标核酸序列。如图3所示。
[0151]
对照组与实施例2基本相同，区别在于用柠檬酸钠缓冲液代替待测样品。如图3所示。
[0152]
对比例1
[0153]
直接用现有售卖的核酸产物胶体金试纸条(ajp10-100)检测实施例2的样品。该试剂盒中不包括实施例2的第一核酸探针、第二核酸探针、一个或多个信号放大探针。报告探针能够与待检测核酸序列以及检测线和质控线互补配对。
[0154]
采用上述实施例2和对比例1的试剂盒，在相同条件下进行测试如下表1。
[0155]
表1
[0156][0157]
采用上述实施例2和对比例1的试剂盒，检测100批相同的含有该待检测目标核酸序列的样品，结果为实施例2的试剂盒能够实现98个阳性检测，而对比例1的试剂盒仅能够检测出58个阳性结果。
[0158]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0159]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。