一种碱裂解法提取细菌质粒的试剂盒及其方法

1.本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种碱裂解法提取细菌质粒的试剂盒及其方法。


背景技术：

2.质粒是细菌中的一种独立于染色体以外的能够自我复制的环状dna分子，可以用于基因的保存和复制、酶切、重组载体的构建和转化等研究。质粒的质量与分子生物学研究进程密切相关，质量好的质粒有利于分子生物学研究的顺利进行。
3.提取大肠杆菌中的质粒一般都包括裂解细菌、变性蛋白质和核酸、复性质粒和除去杂质、沉淀质粒等步骤。由于传统的sds碱裂解法(j.萨姆布鲁克(sambrook.j.)，d.w.拉塞尔著，黄培堂等译.分子克隆实验指南[m].科学出版社，2008年)提取质粒时，溶液i葡萄糖的浓度低也没有加入rnase酶、溶液iii中没有加蛋白抑制剂，并且需要苯酚氯仿抽提来去除蛋白质，提取所需的时间长，提取到的质粒少，可能降解了，也含有大量的细菌rna，不能用于测序和酶切等操作。目前市场中的各种质粒提取试剂盒，由于运用了硅胶膜技术或者磁珠技术，提取质粒的耗时短，但是需要使用rnase和溶菌酶等生物制剂容易失效，保存的时间短，所以对于一些实验人员少和资金不足的实验室来说会造成试剂的浪费和资金的损失。


技术实现要素：

[0004]
本发明的目的在于提供了一种碱裂解法提取细菌质粒的试剂盒，通过改进细菌悬浮液和质粒复性液的组成和浓度，减少了质粒提取的时间，使得提取得到的质粒更加完整，消除了蛋白质和细菌基因组dna和rna的污染。
[0005]
为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
[0006]
本发明提供了一种碱裂解法提取细菌质粒的试剂盒，所述试剂盒包括细菌悬浮液和质粒复性液；
[0007]
所述细菌悬浮液的组成成分包括：50-120mmol/l葡萄糖、10-30mmol/l edta、20-30mmol/l tris-hcl、1.5-3.0mol/l licl、0.5-1.5mol/l nh4ac；所述质粒复性液的组成成分包括：0.8-3mol/l kac和3.5-4.5mol/l异硫氰酸胍。
[0008]
优选的，所述试剂盒还包括细菌裂解液，所述细菌裂解液的组成成分包括0.2mol/l naoh和1％sds。
[0009]
优选的，所述试剂盒还包括洗涤液，所述洗涤液的组成成分包括70％-80％乙醇水溶液。
[0010]
本发明还提供了利用上述试剂盒提取细菌质粒的方法，所述方法包括如下步骤：
[0011]
利用细菌悬浮液悬浮细菌后加入细菌裂解液进行变性裂解，然后加入质粒复性液进行质粒复性，离心，所得上清液转入硅胶柱中，经洗涤液洗涤，即得所述质粒。
[0012]
优选的，所述细菌悬浮液与细菌的体积比为(150-370)μl：(1-5)ml。
[0013]
优选的，所述细菌裂解液与细菌的体积比为(250-370)μl：(1-5)ml，所述变性裂解的时间为4-5min。
[0014]
优选的，所述质粒复性液与细菌的体积比为(320-520)μl：(1-5)ml，所述质粒复性的时间为1-3min。
[0015]
优选的，所述洗涤液与细菌的体积比为(500-650)μl：(1-5)ml，所述洗涤的次数为2-3次。
[0016]
优选的，洗涤后的硅胶柱利用35-50μl 60℃双蒸水洗脱即得所述质粒。
[0017]
优选的，所述细菌包括大肠杆菌dh5α、top10、jm109或农杆菌eha105，gv3101。
[0018]
本发明提供了一种改良的碱裂解法提取细菌质粒的方法，由于使用了传统碱裂解法中使用的naoh来裂解细菌，使用sds来除去蛋白质，使得细菌裂解彻底和除去蛋白的效果好；在细菌悬浮液中添加了无机盐licl和nh4ac，使细菌裂解液中rna容易沉淀去掉，去除细菌rna的效果好，使得提取溶液的保存时间长，需要的经费少；而且在质粒复性液中添加了高浓度的异硫氰酸胍，能够变性dna酶，防止了质粒的降解，保证了提取的质粒完整。同时本发明采用了硅胶膜技术，收集溶液中的质粒所需时间短，减少了质粒与溶液的接触时间。因此采用本发明所述试剂盒和方法提取的质粒完整、无蛋白质和细菌基因组dna和rna的污染，不仅可以提取4kb左右的小质粒，也可以提取13kb左右的大的质粒，能够满足分子生物学实验的测序和酶切等操作。
附图说明
[0019]
图1为改良的碱裂解法提取大肠杆菌质粒电泳图，其中，a为实施例1提取结果，b为实施例2提取结果，c为实施例3提取结果，d为对比例1提取结果，e为对比例2提取结果，f为对比例3提取结果，g为对比例4提取结果，h为对比例5提取结果，a为pbi121-egfp质粒，b为pgm-t载体与目的基因构建的重组质粒，c为细菌rna，1代表对含有pgm-t载体与目的基因构建的重组质粒的dh5α培养液的提取结果，2代表对含有pbi121-egfp质粒的dh5α培养液的提取结果。
具体实施方式
[0020]
本发明提供了一种碱裂解法提取细菌质粒的试剂盒，所述试剂盒包括细菌悬浮液和质粒复性液；
[0021]
所述细菌悬浮液的组成成分包括：50-120mmol/l葡萄糖、10-30mmol/l edta、20-30mmol/l tris-hcl、1.5-3.0mol/l licl、0.5-1.5mol/l nh4ac；所述质粒复性液的组成成分包括：0.8-3mol/l kac和3.5-4.5mol/l异硫氰酸胍。
[0022]
本发明中，所述细菌悬浮液的组成成分优选包括：80-110mmol/l葡萄糖、15-25mmol/l edta、22-28mmol/l tris-hcl、2.0-2.8mol/l licl、0.8-1.3mol/l nh4ac，更优选包括：100mmol/l葡萄糖、20mmol/l edta、25mmol/l tris-hcl、2.5mol/l licl、1.0mol/l nh4ac。本发明中，所述细菌悬浮液的ph优选为8.0。本发明中，所述质粒复性液的组成成分优选包括：0.9-2.0mol/l kac和3.8-4.2mol/l异硫氰酸胍，更优选包括：质粒复性液的组成成分包括：1.0mol/l kac和4.0mol/l异硫氰酸胍。本发明中，所述质粒复性液的ph优选为4.8。本发明中，所述细菌悬浮液主要是为了悬浮离心收集的菌体，添加licl和nh4ac能使细
菌裂解液中rna容易沉淀去掉，提高质粒纯度；同时，所述细菌悬浮液中增加了葡萄糖和edta的浓度，提高了溶液的渗透压，有利于质粒提取的质量。本发明中，所述质粒复性液主要起到中和及盐析作用，可使变性的质粒复性，其中加入高浓度的异硫氰酸胍，可以防止质粒的降解，保证质粒的完整。
[0023]
本发明中，所述试剂盒还包括细菌裂解液，所述细菌裂解液的组成成分包括0.2mol/l naoh和1％sds。本发明中，所述试剂盒还包括洗涤液，所述洗涤液的组成成分优选包括70％-80％乙醇水溶液。本发明中，所述细菌裂解液主要起到破坏细胞膜和变性核酸的作用，所述洗涤液主要是对质粒进行洗涤，以保证质粒的纯度和质量。
[0024]
本发明还提供了一种碱裂解法提取细菌质粒的方法，所述方法包括如下步骤：
[0025]
利用本发明细菌悬浮液悬浮细菌后加入细菌裂解液进行变性裂解，然后加入本发明质粒复性液进行质粒复性，离心，所得上清液转入硅胶柱中，经洗涤液洗涤即得所述质粒。
[0026]
本发明中，所述细菌在悬浮之前优选的进行离心，所述离心的转速优选为11000-13000r/min，更优选为12000r/min，所述离心的时间优选为1min；经过所述离心后去掉上清液，保留沉淀进行后续的悬浮。本发明中，所述细菌悬浮液与细菌的体积比优选为(150-370)μl：(1-5)ml，更优选为(200-350)μl：(2-4)ml。本发明中，所述细菌裂解液与细菌的体积比优选为(250-370)μl：(1-5)ml，更优选为(280-350)μl：(2-4)ml，所述变性裂解的时间优选为4-5min，更优选为4.5min。所述质粒复性液与细菌的体积比优选为(320-520)μl：(1-5)ml，更优选为(400-500)μl：(2-4)ml，所述质粒复性的时间优选为1-3min，更优选为2min。本发明中，所述悬浮、所述变性裂解和所述复性的温度均优选为20-28℃，更优选为25℃。本发明中，所述细菌优选为细菌培养液，本发明对所述细菌培养液的培养方式并没有特殊限定，采用本领域常规的细菌培养方式即可。
[0027]
本发明中，所得上清液转入硅胶柱中，经洗涤液洗涤即得所述质粒。所述洗涤液与细菌的体积比优选为(500-650)μl：(1-5)ml，更优选为(550-600)μl：(2-4)ml，所述洗涤的次数优选为2-3次。本发明中，所述洗涤后的硅胶柱利用60℃双蒸水洗脱即得所述质粒，所述双蒸水的用量优选为35-50μl，更优选为40μl。本发明所述硅胶柱经过洗脱后优选的进行放置和离心。所述放置的温度优选为20-28℃，更优选为25℃，所述放置的时间优选为1-3min，更优选为2min；所述离心的转速优选为11000-13000r/min，更优选为12000r/min，所述离心的时间优选为1min。本发明中，所述细菌优选的包括大肠杆菌dh5α、top10、jm109或农杆菌eha105、gv3101。
[0028]
本发明中，所用原料、试剂与设备均为已知产品，采用常规市售产品即可。
[0029]
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0030]
实施例1
[0031]
1、提取细菌质粒的试剂组成：
[0032]
细菌悬浮液：50mmol/l葡萄糖、10mmol/l edta、20mmol/l tris-hcl、1.5mol/l licl、0.5mol/l nh4ac，溶液ph8.0；
[0033]
细菌裂解液：0.2mol/l naoh，1％sds；
[0034]
质粒复性液：0.8mol/l kac和3.5mol/l异硫氰酸胍，溶液ph4.8；
[0035]
洗涤液：70％乙醇水溶液。
[0036]
2、利用步骤1所述试剂提取pgm-t与目的基因连接的重组质粒和pbi121-egfp质粒的方法：
[0037]
1)取1ml大肠杆菌dh5α培养液于1.5ml离心管中，12000r/min离心1min，去掉上清液，保留沉淀；
[0038]
2)在离心管中加入150μl细菌悬浮液，放在振荡器上充分悬浮细菌沉淀；
[0039]
3)在细菌悬浮液中加入250μl细菌裂解液，颠倒离心管5次，充分混匀溶液，室温下静置4min；
[0040]
4)在离心管中加入320μl质粒复性液，颠倒离心管6次，室温下放置2min；
[0041]
5)室温下12000r离心5min；
[0042]
6)将上清液转入到有收集管的硅胶柱中，12000r离心1min，去掉收集管中的废液；
[0043]
7)在硅胶柱中加入500μl洗涤液，室温下12000r离心1min，去掉收集管中的废液，重复该步骤1次；
[0044]
8)将硅胶柱放回收集管，12000r离心2min；
[0045]
9)将硅胶柱放入到1.5ml离心管中，开盖放置2min；
[0046]
10)在硅胶柱中加入60℃保温的35μl双蒸水，室温放置2min，12000r离心1min；
[0047]
11)去掉硅胶柱，取5μl质粒经过1％琼脂糖凝胶电泳检查质粒质量，将质粒质量好的离心管放入-18℃冰箱中保存。
[0048]
实施例2
[0049]
1、提取细菌质粒的试剂组成：
[0050]
细菌悬浮液：120mmol/l葡萄糖、30mmol/l edta、30mmol/l tris-hcl、3.0mol/l licl、1.5mol/l nh4ac，溶液ph8.0；
[0051]
细菌裂解液：0.2mol/l naoh，1％sds；
[0052]
质粒复性液：3mol/l kac和4.5mol/l异硫氰酸胍，溶液ph4.8；
[0053]
洗涤液：80％乙醇水溶液。
[0054]
2、利用步骤1所述试剂提取pgm-t与目的基因连接的重组质粒和pbi121-egfp质粒的方法：
[0055]
1)取大肠杆菌dh5α培养液于1.5ml离心管中，12000r/min离心1min，去掉上清液，保留沉淀；然后再添加大肠杆菌dh5α培养液1.5ml于同一离心管中，12000r/min离心1min，去掉上清液，保留沉淀；
[0056]
2)在离心管中加入370μl细菌悬浮液，放在振荡器上充分悬浮细菌沉淀；
[0057]
3)在细菌悬浮液中加入370μl细菌裂解液，颠倒离心管6次，充分混匀溶液，室温下静置5min；
[0058]
4)在离心管中加入520μl质粒复性液，颠倒离心管7次，室温下放置2min；
[0059]
5)室温下12000r离心5min；
[0060]
6)将上清液转入到有收集管的硅胶柱中，12000r离心1min，去掉收集管中的废液；
[0061]
7)在硅胶柱中加入650μl洗涤液，室温下12000r离心1min，去掉收集管中的废液，重复该步骤1次；
[0062]
8)将硅胶柱放回收集管，12000r离心2min；
[0063]
9)将硅胶柱放入到1.5ml离心管中，开盖放置2min；
[0064]
10)在硅胶柱中加入60℃保温的35μl双蒸水，室温放置2min，12000r离心1min；
[0065]
11)去掉硅胶柱，取5μl质粒经过1％琼脂糖凝胶电泳检查质粒质量，将质粒质量好的离心管放入-18℃冰箱中保存。
[0066]
实施例3
[0067]
1、提取细菌质粒的试剂组成：
[0068]
细菌悬浮液：100mmol/l葡萄糖、20mmol/l edta、25mmol/l tris-hcl、2.5mol/l licl、1.0mol/l nh4ac，溶液ph8.0；
[0069]
细菌裂解液：0.2mol/l naoh，1％sds；
[0070]
质粒复性液：1.0mol/l kac和4.0mol/l异硫氰酸胍，溶液ph4.8；
[0071]
洗涤液：80％乙醇水溶液。
[0072]
2、利用步骤1所述试剂提取pgm-t与目的基因连接的重组质粒和pbi121-egfp质粒的方法：
[0073]
1)取大肠杆菌dh5α培养液1.5ml于1.5ml离心管中，12000r/min离心1min，去掉上清液，保留沉淀；然后再添加大肠杆菌dh5α培养液1.5ml于同一离心管中，12000r/min离心1min，去掉上清液，保留沉淀；以同样的操作共收集5ml大肠杆菌dh5α培养液的沉淀；
[0074]
2)在离心管中加入300μl细菌悬浮液，放在振荡器上充分悬浮细菌沉淀；
[0075]
3)在细菌悬浮液中加入300μl细菌裂解液，颠倒离心管5次，充分混匀溶液，室温下静置4min；
[0076]
4)在离心管中加入450μl质粒复性液，颠倒离心管6次，室温下放置2min；
[0077]
5)25℃下12000r离心5min；
[0078]
6)将上清液转入到有收集管的硅胶柱中，12000r离心1min，去掉收集管中的废液；
[0079]
7)在硅胶柱中加入580μl洗涤液，室温下12000r离心1min，去掉收集管中的废液，重复该步骤1次；
[0080]
8)将硅胶柱放回收集管，12000r离心2min；
[0081]
9)将硅胶柱放入到1.5ml离心管中，开盖放置2min；
[0082]
10)在硅胶柱中加入60℃保温的35μl双蒸水，室温放置2min，12000r离心1min；
[0083]
11)去掉硅胶柱，取5μl质粒经过1％琼脂糖凝胶电泳检查质粒质量，将质粒质量好的离心管放入-18℃冰箱中保存。
[0084]
对比例1
[0085]
除细菌悬浮液由100mmol/l葡萄糖、20mmol/l edta、25mmol/l tris-hcl组成外，其他试剂组成和方法与实施例3相同。
[0086]
对比例2
[0087]
除细菌悬浮液由100mmol/l葡萄糖、20mmol/l edta、25mmol/l tris-hcl、2.5mol/l licl组成外，其他试剂组成和方法与实施例3相同。
[0088]
对比例3
[0089]
除细菌悬浮液由100mmol/l葡萄糖、20mmol/l edta、25mmol/l tris-hcl、1.0mol/l nh4ac组成外，其他试剂组成和方法与实施例3相同。
[0090]
对比例4
[0091]
除质粒复性液由1.0mol/l kac组成外，其他试剂组成和方法与实施例3相同。
[0092]
对比例5
[0093]
采用经典sds碱裂解法(j.萨姆布鲁克(sambrook.j.)，d.w.拉塞尔著，黄培堂等译.分子克隆实验指南[m].科学出版社，2008年)提取细菌质粒。
[0094]
实施例4
[0095]
利用琼脂糖凝胶电泳检测实施例1-3和对比例1-5所提取到的质粒质量，结果如图1所示。
[0096]
由图1可以看出，利用传统碱裂解法提取的质粒明显发生了降解(图1h)，而利用本发明所述试剂和方法提取得到的质粒完整，无rna污染，不仅可以提取4kb的小质粒，也可以提取13kb大的质粒(图1b和图1c)。
[0097]
同时可以看出，相较于实施例2-3，本发明实施例1中的大质粒有点降解，分析其原因可能是实施例1中的细菌悬浮液中葡萄糖浓度仅为50mmol/l，浓度较低，而b、c中的细菌悬浮液中葡萄糖浓度为100-120mmol/l，提高了溶液的渗透压，保存了大质粒的完整，防止了大质粒的降解。
[0098]
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。