用于乌梢蛇药材、标准汤剂及中药配方颗粒PCR鉴别的引物组合及其应用、鉴别方法与流程

用于乌梢蛇药材、标准汤剂及中药配方颗粒pcr鉴别的引物组合及其应用、鉴别方法
技术领域
1.本发明涉及中药鉴别技术领域，尤其涉及一种用于乌梢蛇药材、标准汤剂及中药配方颗粒pcr鉴别的引物组合及其应用、鉴别方法。


背景技术：

2.我国蛇类物种约有两百余种，其中有20余种为常见蛇类，包括蕲蛇agkistrodon acutus、乌梢蛇zaocys dhumnades、金钱白花蛇bungarus multicinctus、金环蛇bungarus fasciatus、滑鼠蛇ptyas mucosus、圆斑蝰daboia russelii、眼镜蛇naja naja、赤链蛇lycodon rufozonatus、王锦蛇elaphe carinata、灰鼠蛇ptyas korros、短尾蝮蛇gloydius brevicaudus、黑眉锦蛇elaphe taeniura、百花锦蛇elaphe moellendorffi等，其多数不具有临床药效。由于多种蛇类形态近似，药材鉴别困难，特别是加工处理时剖去内脏后，要进行干燥熏黑处理，皮上的花纹特征、颜色几近消失，难以辨认，尤其是经过水提取制成标准汤剂，进一步加工成中药配方颗粒后，在失去药材性状后，更难以进行有效的鉴别。
3.一些研究指出，可采用pcr法(聚合酶链式反应法)对乌梢蛇药材进行鉴定。然而，对于乌梢蛇标准汤剂、中药配方颗粒而言，一者其往往含有一定比例的辅料，导致现有方法dna提取效率不高；二者标准汤剂、中药配方颗粒在制备过程中，往往需要加热提取，导致dna降解，难以存留超过200bp的dna片段，导致现有方法检测精度低。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题在于，提供一种用于乌梢蛇药材、标准汤剂及中药配方颗粒pcr鉴别的引物组合，其专属性良好，可有效解决dna失去形态后难以鉴别的问题。
5.本发明还要解决的技术问题在于，提供一种上述引物组合在鉴别乌梢蛇药材、乌梢蛇标准汤剂、或乌梢蛇中药配方颗粒中的应用。
6.本发明还要解决的技术问题在于，提供一种上述引物组合在鉴别乌梢蛇药材、乌梢蛇标准汤剂、或乌梢蛇中药配方颗粒的试剂盒中的应用。
7.本发明还要解决的技术问题在于，提供一种基于上述的用于乌梢蛇药材、标准汤剂及中药配方颗粒pcr鉴别的引物组合的鉴别方法。
8.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于乌梢蛇药材、标准汤剂及中药配方颗粒pcr鉴别的引物组合，其包括引物一和引物二，所述引物一为核苷酸序列如seq id no：1所示的dna分子；所述引物二为核苷酸序列如seq id no：2所示的dna分子。
9.相应的，本发明还公开了上述的用于乌梢蛇药材、标准汤剂及中药配方颗粒pcr鉴别的引物组合在鉴别乌梢蛇药材、乌梢蛇标准汤剂、或乌梢蛇中药配方颗粒中的应用。
10.相应的，本发明还公开了上述的用于乌梢蛇药材、标准汤剂及中药配方颗粒pcr鉴别的引物组合在鉴别乌梢蛇药材、乌梢蛇标准汤剂、或乌梢蛇中药配方颗粒的试剂盒中的应用。
11.相应的，本发明还公开了一种基于上述的用于乌梢蛇药材、标准汤剂及中药配方颗粒pcr鉴别的引物组合的鉴别方法，其包括：
12.提取待检测样品的基因组dna；
13.以所述基因组dna为dna模板，采用上述的用于乌梢蛇药材、标准汤剂及中药配方颗粒pcr鉴别的引物组合进行pcr扩增，若扩增产物中含有135bp的dna片段，则待检测样品为乌梢蛇药材、乌梢蛇标准汤剂或乌梢蛇中药配方颗粒。
14.作为上述技术方案的改进，提取待检测样品的基因组dna的方法如下：
15.取待检测样品，加入ctab沉淀液、蛋白酶k沉淀提取2～3次；取沉淀物加入ctab提取液、β-巯基乙醇提取，然后加入氯仿-异戊醇萃取2～3次，取萃取后上清液，加入异丙醇或异丙醇-乙酸钠沉淀提取，沉淀物经洗涤、孵育后用水溶解，即得待检测样品的基因组dna。
16.作为上述技术方案的改进，提取待检测样品的基因组dna的方法如下：
17.取待检测样品0.3～0.8g，研磨成粉末，置离心管中，加入1～1.8ml的ctab沉淀液、15～25μl蛋白酶k，混合均匀，在60～70℃下加热45～65min，冷却至室温后离心，弃去上清液；加入800～1000μl ctab沉淀液，15～25μl蛋白酶k，混合均匀，在60～70℃下加热45～65min，冷却至室温后离心，弃去上清液；取沉淀加入800～1000μl ctab提取液，5～15μlβ-巯基乙醇，混合均匀，在60～70℃下加热100～150min，离心，冷却至室温，取提取后上清液，加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，震荡混匀后离心，取上清液700～800μl，再加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，震荡混匀后离心，取上清液400～500μl，加入等体积的异丙醇或异丙醇-乙酸钠混合液，于-30～-20℃静置30～60min，离心后弃去上清液，再用乙醇洗涤沉淀2～4次，弃去上清液，沉淀于35～38℃孵育20～40min，待乙醇挥发后，加入30～50μl灭菌水溶解，即得到待检测样品的基因组dna。
18.作为上述技术方案的改进，所述ctab沉淀液包括ctab、tris-hcl、edta和水；其中，ctab的浓度为1～3％(w/v)，tris-hcl的浓度为80～120mmol/l，edta的浓度为10～30mmol/l；
19.所述ctab提取液包括ctab、tris-hcl、edta、nacl、pvp40和水；其中，ctab的浓度为1～3％(w/v)，tris-hcl的浓度为80～120mmol/l，edta的浓度为10～30mmol/l，nacl的浓度为1～3mol/l，pvp40的浓度为10～30％(w/v)。
20.作为上述技术方案的改进，将dna模板、引物组合、pcr缓冲液、dntp、rtaq、水混合均匀，得到pcr扩增体系；
21.将所述pcr扩增体系按照预设扩增程序进行扩增，得到扩增产物；
22.将所述扩增产物进行电泳分析，记录其电泳图谱，若图谱中含有135bp的dna片段，则待检测样品为乌梢蛇药材、乌梢蛇标准汤剂或乌梢蛇中药配方颗粒。
23.作为上述技术方案的改进，所述pcr扩增体系由下述物质组成：
24.10
×
pcr bufferⅰ(mg
2
pulse)2.5μl，dntp mixture 0.6μl，引物一0.3μl，引物二0.3μl，rtaq 0.3μl，dna模板1μl，去离子水20μl。
25.作为上述技术方案的改进，所述pcr扩增程序为：
26.将所述扩增体系在90～95℃预变性3～7min，然后在预设程序下循环30～40次，最后在70～75℃延伸3～7min；
27.其中，所述预设程序为：将扩增体系在90～95℃变性25～32s，然后在59～61℃退
id no：1所示的dna分子；引物二为核苷酸序列如seq id no：2所示的dna分子。
40.通过对常见蛇类物种的cytochrome oxidase i序列的同源比对分析，确定乌梢蛇的snp位点，再根据含有该snp位点的碱基序列设计引物，并综合考虑高温提取对dna碱基序列的破坏作用、产物条带、引物评分等信息，得到上述引物组合。根据上述引物组合对乌梢蛇药材、乌梢蛇标准汤剂、乌梢蛇中药配方颗粒进行pcr扩增，可获得135bp大小的特异性片段。
41.本发明还提供了上述引物组合在鉴别乌梢蛇药材、乌梢蛇标准汤剂、或乌梢蛇中药配方颗粒中的应用。需要说明的是，本发明中的引物组合可用于鉴定含有乌梢蛇的各种物质，如药材、标准汤剂、中药配方颗粒、饮片、含乌梢蛇的中药复方(如风湿祛痛胶囊)等。
42.本发明还提供了上述引物组合鉴别乌梢蛇药材、乌梢蛇标准汤剂、或乌梢蛇中药配方颗粒的试剂盒中的应用。具体的，该试剂盒包括上述的引物组合，还包括pcr缓冲液、dntp、rtaq和水。
43.本发明还公开了一种基于上述用于乌梢蛇药材、标准汤剂及中药配方颗粒pcr鉴别的引物组合的鉴别方法，其包括：
44.(1)提取待检测样品的基因组dna；
45.其中，待检测样品以固态形式提供，标准汤剂以冻干粉的形式提供(即将标准汤剂冷冻干燥后得到冻干粉)。
46.具体的，提取方法如下：
47.a、取待检测样品，加入ctab沉淀液、蛋白酶k沉淀提取2～3次，得到沉淀物；
48.具体的，取待检测样品0.3～0.8g，研磨成粉末，置离心管中，加入1～1.8ml在65℃预热的ctab沉淀液、15～25μl蛋白酶k，混合均匀，在60～70℃下加热45～65min，冷却至室温后离心，弃去上清液；加入800～1000μl ctab沉淀液，15～25μl蛋白酶k，混合均匀，在60～70℃下加热45～65min，冷却至室温后离心，弃去上清液，即得；
49.其中，ctab沉淀液的组成为2％(w/v)ctab，100mmol/l tris-hcl(ph＝8.0)，20mmol/l edta(ph＝8.0)。
50.b、取沉淀物加入ctab提取液、β-巯基乙醇提取，然后加入氯仿-异戊醇萃取2～3次，得萃取后上清液；
51.具体的，在沉淀物中加入800～1000μl ctab提取液，5～15μlβ-巯基乙醇，混合均匀，在60～70℃下加热100～150min，离心，冷却至室温，取提取后上清液，加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)混合液，震荡混匀后离心，取上清液700～800μl，再加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)混合液，震荡混匀后离心，取上清液400～500μl，即得。
52.需要说明的是，在本步骤中，在采用ctab提取液、β-巯基乙醇提取结束后，可直接加入氯仿-异戊醇，也可取提取后所得上清液再加入氯仿-异戊醇，取上清液再加入氯仿-异戊醇可提升提取准确度。
53.其中，ctab提取液：1～3％(w/v)ctab，80～120mmol/l tris-hcl(ph＝8.0)，10～30mmol/l edta(ph＝8.0)，1～3mol/lnacl，10～30％(w/v)pvp40。
54.c、取提取液加入异丙醇或异丙醇-乙酸钠沉淀提取，沉淀物经洗涤、孵育后用水溶解，即得待检测样品的基因组dna。
55.具体的，取提取液，加入等体积的异丙醇或异丙醇-3mol/l乙酸钠混合液，于-30
～-20℃静置30～60min，离心后弃去上清液，再用乙醇洗涤沉淀2～4次，弃去上清液，沉淀于35～38℃孵育20～40min，待乙醇挥发后，加入30～50μl灭菌水溶解，即得到待检测样品的基因组dna，作为dna模板。
56.需要说明的是，申请人在面临乌梢蛇标准汤剂、乌梢蛇中药配方颗粒中基因组dna提取时，尝试了传统的ctab法、螯合树脂法、曲拉通-100法、sds法、碱式裂解法、dneasy blood&tissue kit法、磁珠法，但均得到了不溶性沉淀。故，本发明人在传统ctab法的基础上，对ctab沉淀液、ctab提取液以及提取程序加以改进，得到了上述提取方法。上述提取方法尽量多地保留乌梢蛇标准汤剂、乌梢蛇中药配方颗粒中的基因组dna信息，同时可克服辅料干扰的问题。
57.(2)形成pcr扩增体系，并进行扩增，得到扩增产物；
58.具体的，将dna模板、引物组合、pcr缓冲液、dntp、rtaq、水混合均匀，得到pcr扩增体系；
59.更具体的，pcr扩增体系的总体积为25μl，其包括：10
×
pcr bufferⅰ(mg
2
pulse)2.5μl，dntp mixture 0.6μl，引物一0.3μl，引物二0.3μl，rtaq 0.3μl，dna模板1μl，去离子水20μl。
60.扩增程序为：90～95℃预变性3～7min；90～95℃变性25～32s，59～61℃退火25～32s，70～73℃延伸28～35s，循环30～40次；最后在70～75℃延伸3～7min。
61.优选的，扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，59～61℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后在72℃延伸5min。
62.(3)将扩增产物进行分析；
63.具体的，可采用电泳法或荧光染色法对扩增产物进行分析，但不限于此。
64.优选的，采用电泳法对扩增产物进行分析，具体如下：
65.取扩增产物，加入5μl 6
×
loading buffer，混匀，取混合产物5～10μl点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于115～125v电压条件下电泳45～60min，经gelred显色，得到电泳图谱。若电泳图谱中含有135bp的dna片段，则待检测样品为乌梢蛇药材、乌梢蛇标准汤剂或乌梢蛇中药配方颗粒。
66.下面以具体实施例对本发明进行说明。
67.实施例1引物设计
68.以中国药典2020年版乌梢蛇及常见蛇类nadh；cytochrome oxidase i；12s rrna；16s rrna；cytochrome b序列分析为基础，利用bioedit软件对genebank数据库中常见蛇类物种的cytochrome oxidase i序列进行同源比对，校对后分析乌梢蛇的特异性snp位点，将包含snp位点的碱基序列导入到primer premier 5软件中，进行引物设计。
69.经序列对比发现，乌梢蛇特异性位点为t而其他为a或c，确定该snp位点后，使snp位点接近正向引物3’端，通过移动上游引物位置，调节引物得分及gc含量，并借助primer premier 5软件，进一步调节反向引物位置，通过最终引物评分、产物条带得分以确定最佳组合。在设计过程中，还需考虑到经高温提取后，对dna碱基序列的破坏作用。综合以上因素，获得的引物组合如下：
70.引物一：5
’‑
cccctaataatcggagcg-3；
71.引物二：5
’‑
tactgttcacccagtgcc-3’。
72.实施例2鉴定方法建立
73.(1)dna提取及浓度调节
74.取干燥的样品0.5g，研磨成粉末，置2ml离心管中，加入1.5ml在65℃预热的ctab沉淀液、20μl蛋白酶k，混匀，65℃水浴加热60min，冷却至室温后，以10000r/min离心5min，弃上清液，再加入900μl ctab沉淀液、20μl蛋白酶k，同法操作。向该离心管中依次加入900μl ctab提取液、10μlβ-巯基乙醇，混匀，65℃水浴加热120min，离心，待冷却至室温后取上清液；加入等体积的氯仿-异戊醇(24﹕1)，震荡3min，混匀；再以12000r/min，4℃离心10min，取上清液750μl加入新的2ml离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇(24﹕1)，震荡3min，混匀；再以12000r/min，4℃离心10min；再取上清液450μl于1.5ml离心管中，加入等体积异丙醇，于-20℃静置30～60min。取出该离心管以12000r/min离心5min，弃上清液，再分别用75％乙醇、无水乙醇洗涤沉淀两次，弃上清液，沉淀于37℃孵育30min，待乙醇挥发后，加灭菌水30μl使溶解。
75.其中，ctab沉淀液组成如下：2％(w/v)ctab(上海源叶生物科技有限公司)，100mm tris-hcl(ph＝8.0)(beijing solarbio)，20mm edta(ph＝8.0)(shanghai yu bo biotech co.,ltd)。
76.ctab提取液组成如下：2％(w/v)ctab(上海源叶生物科技有限公司)，100mm tris-hcl(ph＝8.0)(beijing solarbio)，20mm edta(ph＝8.0)(shanghai yu bo biotech co.,ltd)，2.5mol/lnacl(西陇科学股份有限公司)，20％pvp40(上海源叶生物科技有限公司)。
77.取上述dna样品，采用biospec-nano微量紫外分光光度计测定dna浓度，同时记录od260/od230，od260/od280，并调整浓度到50ng/μl，得到dna模板。
78.(2)设计引物组合
79.引物组合的序列为：引物一(正向引物)如seq id no：1所示；引物二(反向引物)如seq id no：2所示。
80.(3)pcr扩增
81.pcr扩增体系：10
×
pcr buffer i(mg
2
pluse)2.5μl，2.5mmol/l的dntp mixture 0.6μl，10μmol/l的引物一0.3μl，10μmol/l的引物二0.3μl，5u/μl的rtaq聚合酶0.3μl，50ng/μl的dna模板1μl，去离子水20μl。上述液体震荡混匀，瞬时离心，即得pcr扩增体系。
82.pcr扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s；61℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸5min。
83.(4)电泳检测
84.取扩增产物，加入6
×
loading buffer 5μl，混匀，取混合产物8μl点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于120v电压的条件下电泳50min，经gelred显色，最后于凝胶成像仪观察记录结果。
85.如果电泳图谱中含有135bp的dna片段，则待检测样品为乌梢蛇药材、乌梢蛇标准汤剂或乌梢蛇中药配方颗粒。
86.实施例3鉴定方法验证
87.选取14个已知物种的蛇类样品(具体如表1所示)。
88.采用实施例2建立的鉴别方法对样品进行鉴定。其中，pcr体系中，dna模板量为50ng。
89.表1样品表
[0090][0091][0092]
鉴定结果如图1所示，从图中可以看出，乌梢蛇药材、乌梢蛇标准汤剂(冻干粉)、乌梢蛇中药配方颗粒均存在135bp的条带；而其他样品均未得到该条带。该结果表明，本发明中的鉴别方法准确率达到100％。
[0093]
实施例4灵敏度试验
[0094]
分别取不同厂家生产的乌梢蛇中药配方颗粒(表1中样品4～6)。提取待检测样品的基因组dna，并采用ddh2o对基因组dna进行稀释，然后采用实施例2中步骤3～4的方法进行测试。
[0095]
其中，乌梢蛇中药配方颗粒(广东省佛山市)相关样品测试的pcr扩增体系中，dna模板的含量为300ng；
[0096]
乌梢蛇中药配方颗粒(江苏省江阴市)相关样品测试的pcr扩增体系中，dna模板的含量为100ng；
[0097]
乌梢蛇中药配方颗粒(四川省成都市)相关样品测试的pcr扩增体系中，dna模板的含量为80ng；
[0098]
乌梢蛇中药配方颗粒(广东省深圳市)相关样品测试的pcr扩增体系中，dna模板的含量为400ng；
[0099]
测试结果如图2所示，从图中可以看出，各厂家生产的乌梢蛇中药配方颗粒均存在135bp的条带；可见本发明的方法对于80～400ng的dna模板量均具有良好的适用性。
[0100]
实施例5方法学验证-退火温度
[0101]
(1)取表1中编号为1～2、4～5的乌梢蛇样品，编号为17的王锦蛇，编号为15的滑鼠蛇，编号为18的圆斑蝰蛇作为样品；
[0102]
(2)采用实施例2所建立的方法对样品进行鉴定；其中，鉴定过程中，分别采用57℃、59℃、61℃和63℃的退火温度。
[0103]
测试结果如图3所示，从图中可以看出，当退火温度分别为57℃、59℃、61℃、63℃时，pcr扩增条带差异较小且均空白对照无假阳性出现。当退火温度达到63℃时，条带有减弱趋势，但空白对照无假阳性出现；当退火温度为57℃时，条带较弱。因此，退火温度为59～61℃。
[0104]
实施例6方法学验证-pcr扩增体系
[0105]
(1)取表1中编号为1～2、4～5的乌梢蛇样品，编号为17的王锦蛇，编号为15的滑鼠蛇，编号为18的圆斑蝰蛇作为样品；
[0106]
(2)采用实施例2所建立的方法对样品进行鉴定；其中，鉴定过程中，其中，鉴定过程中，分别采用0.3μl的浓度为5u/μl的rtaq酶、extaq酶、speedstar酶、mightyamp酶与10
×
pcr buffer i(mg
2
pluse)2.5μl，2.5mmol/l的dntp mixture 0.6μl，10μmol/l的引物一0.3μl，10μmol/l的引物二0.3μl，50ng/μl的dna模板1μl，去离子水20μl组成扩增体系。
[0107]
测试结果如图4所示，从图中可以看出，rtaq酶和speedstar酶均获得pcr扩增条带，为保证条带的亮度，故选dna聚合酶为rtaq酶。
[0108]
以上所述是发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
[0109]