一种D-泛酸的制备方法与流程

一种d-泛酸的制备方法
技术领域
1.本发明涉及生物合成领域，具体涉及一种d-泛酸的制备方法。


背景技术：

2.泛酸又称维生素b5，为包括人和家畜在内的哺乳动物的必须营养元素，并在机体细胞中用于生物合成辅酶a(coa)和酰基载体蛋白(acp)，进而参与一百多种细胞代谢反应。现有技术一般用缬氨酸作为底物生产d-泛酸，但存在反应步骤繁琐、反应时间长、酮泛解酸转化成泛解酸过程中的辅酶nadph消耗带来的成本高等缺陷，限制了其产业化应用前景。需要研究更为高效的d-泛酸制备方法。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种d-泛酸的制备方法，包括下述步骤：
4.(1)将缬氨酸、甲醛、β-丙氨酸、复合酶加水混合，所述复合酶包括l-氨基酸脱氨酶、甲酸脱氢酶、醛缩酶、酮泛解酸还原酶和泛酸合成酶；
5.(2)添加甲酸铵，在25～55℃、ph为4-7条件下，经酶催化反应10-60h，制得d-泛酸。
6.本发明优选的技术方案，复合酶中l-氨基酸脱氨酶为4-15u/l，优选为6-12u/l。
7.本发明优选的技术方案，复合酶中醛缩酶为10-20u/l，优选为15-18u/l。
8.本发明优选的技术方案，复合酶中甲酸脱氢酶为4-15u/l，优选为6-12u/l。
9.本发明优选的技术方案，复合酶中酮泛解酸还原酶为4-15u/l，优选为6-12u/l。
10.本发明优选的技术方案，复合酶中泛酸合成酶为4-15u/l，优选为6-14u/l。
11.本发明优选的技术方案，甲酸铵以流加方式进行添加。
12.本发明优选的技术方案，甲酸铵的浓度为1.5g/l-2.5g/l，优选为1.8g/l-2.2g/l。
13.本发明优选的技术方案，所述缬氨酸：甲醛：β-丙氨酸的摩尔比为(0.9-1.3):(0.9-1.2):1，优选为(1.0-1.2):(1.0-1.1):1。
14.本发明的优选技术方案中，酶催化体系中还可加入金属盐或磷酸盐溶液。
15.本发明的优选技术方案中，所述金属盐或磷酸盐选自锌盐、钙盐、铜盐、镁盐、钠盐、钾盐中的任一种或其组合，优选为氯化锌、氯化钙、氯化铜、硫酸锌、硫酸钙、硫酸铜、磷酸镁、磷酸锌、磷酸钙、磷酸铜、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢钙、磷酸钙、焦磷酸钙、磷酸二氢钾、酸式焦磷酸钠、磷酸钠、焦磷酸钠中的任一种或其组合。
16.本发明优选的技术方案，所述金属盐或磷酸盐溶液浓度为0-50mm，优选为1～40mm，更优选为5～30mm。
17.本发明优选的技术方案，金属盐溶液中的zn
2
浓度为0～15mm，优选为5～10mm。
18.本发明优选的技术方案，金属盐溶液中的cu
2
浓度为0～15mm，优选为5～10mm。
19.本发明优选的技术方案，金属盐溶液中的ca
2
浓度为0～9mm，优选为2～7mm。
20.本发明优选的技术方案，磷酸盐溶液中的po
43-浓度为0～15mm，优选为2～10mm。
21.本发明优选的技术方案，磷酸盐溶液中的hpo
42-浓度为0～15mm，优选为2～10mm。
22.本发明优选的技术方案，磷酸盐溶液中的h2po
4-浓度为0～15mm，优选为2～10mm。
23.本发明优选的技术方案，酶催化反应温度为30～40℃。
24.本发明优选的技术方案，酶催化反应体系ph5-7。
25.本发明的优选方案中，用于调节酶催化反应体系ph的ph调节剂选自氨水、氢氧化钠、碳酸氢钠、三乙胺、氢氧化钾、磷酸钠、柠檬酸钠、苹果酸钠、磷酸盐缓冲液、tris缓冲液、硫酸的任一种。
26.本发明的另一目的在于提供一种如上所述的方法制备得到的d-泛酸在制备d-泛酸钙中的应用。
27.除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。
28.除非另有说明，本发明按照下述方法检测转化率和收率。
29.1、酶活
30.酶活为酶活力的度量单位，单位为u。在本技术中，定义1个酶活单位表示1ml底物溶液在1分钟内转化生成1umold-泛酸的酶量。
31.2、转化率
32.分别在转化时间t＝0和t＝m(m为大于0的任一数值)时，取反应液稀释100倍，过滤后hplc检测，分别记录缬氨酸浓度为s0和sm，以及在t＝m时d-泛酸浓度为nm。
33.转化率(m时刻)＝(nm*0.534)/(s
0-sm)
34.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
35.1、本发明以缬氨酸、甲醛、甲酸铵和β-丙氨酸为底物发酵转化生成d-泛酸，原料价廉易得，反应成本低。
36.2、本发明通过增加辅酶循环达到辅酶nadph再生，降低生产成本。
37.3、本发明将甲酸转化为易挥发的二氧化碳，既利于提高反应效率，缩短生产周期，减低三废生成及其回收处理成本，本发明制备工艺简单，适宜工业化生成。
附图说明
38.图1实施例1-6和对比例1的转化率。
具体实施方式
39.以下结合实施例对本发明做进一步的说明。
40.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
41.实施例1
42.向反应容器中加入缬氨酸、甲醛、β-丙氨酸、复合酶，加水至总体积为5l，搅拌溶解，使得反应体系中：缬氨酸质量为300g，甲醛质量为69.07g，β-丙氨酸质量为196.89g，l-氨基酸脱氨酶为12u/l、甲酸脱氢酶为12u/l、醛缩酶为18u/l、酮泛解酸还原酶为12u/l，泛酸合成酶为12u/l。流加甲酸铵，维持反应液中甲酸铵浓度为2g/l。调节溶液温度为37℃，用
氨水和稀硫酸调节溶液ph为5-7，在搅拌条件下持续反应22h，得到d-泛酸溶液，经检测，d-泛酸转化率见图1。
43.实施例2
44.向反应容器中加入缬氨酸、甲醛、β-丙氨酸、复合酶，加水至总体积为5l，搅拌溶解，使得反应体系中：缬氨酸质量为300g，甲醛质量为69.07g，β-丙氨酸质量为196.89g，l-氨基酸脱氨酶为12u/l、甲酸脱氢酶为12u/l、醛缩酶为18u/l、酮泛解酸还原酶为12u/l，泛酸合成酶为10u/l。流加甲酸铵，维持反应液中甲酸铵浓度为2g/l。调节溶液温度为37℃，用氨水和稀硫酸调节溶液ph为5-7，在搅拌条件下持续反应22h，得到d-泛酸溶液，经检测，d-泛酸转化率见图1。
45.实施例3
46.向反应容器中加入缬氨酸、甲醛、β-丙氨酸、复合酶，加水至总体积为5l，搅拌溶解，使得反应体系中：缬氨酸质量为300g，甲醛质量为69.07g，β-丙氨酸质量为196.89g，l-氨基酸脱氨酶为12u/l、甲酸脱氢酶为12u/l、醛缩酶为18u/l、酮泛解酸还原酶为12u/l，泛酸合成酶为14u/l。流加甲酸铵，维持反应液中甲酸铵浓度为2g/l。调节溶液温度为37℃，用氨水和稀硫酸调节溶液ph为5-7，在搅拌条件下持续反应22h，得到d-泛酸溶液，经检测，d-泛酸转化率见图1。
47.实施例4
48.向反应容器中加入缬氨酸、甲醛、β-丙氨酸、复合酶、氯化锌，加水至总体积为5l，搅拌溶解，使得反应体系中：缬氨酸质量为300g，甲醛质量为69.07g，β-丙氨酸质量为196.89g，氯化锌质量为3.4g/l，l-氨基酸脱氨酶为12u/l、甲酸脱氢酶为12u/l、醛缩酶为18u/l、酮泛解酸还原酶为12u/l，泛酸合成酶酶活为14u/l。流加甲酸铵，维持反应液中甲酸铵浓度为2g/l。调节溶液温度为37℃，用氨水和稀硫酸调节溶液ph为5-7，在搅拌条件下持续反应22h，得到d-泛酸溶液，经检测，d-泛酸转化率见图1。
49.实施例5
50.向反应容器中加入缬氨酸、甲醛、β-丙氨酸、复合酶、硫酸铜，加水至总体积为5l，搅拌溶解，使得反应体系中：缬氨酸质量为300g，甲醛质量为69.07g，β-丙氨酸质量为196.89g，硫酸铜质量为4.8g，l-氨基酸脱氨酶为12u/l、甲酸脱氢酶为12u/l、醛缩酶为18u/l、酮泛解酸还原酶为12u/l，泛酸合成酶为14u/l。流加甲酸铵，维持反应液中甲酸铵浓度为2g/l。调节溶液温度为37℃，用氨水和稀硫酸调节溶液ph为5-7，在搅拌条件下持续反应22h，得到d-泛酸溶液，经检测，d-泛酸转化率见图1。
51.实施例6
52.向反应容器中加入缬氨酸、甲醛、β-丙氨酸、复合酶、磷酸氢二钠，加水至总体积为5l，搅拌溶解，使得反应体系中：缬氨酸质量为300g，甲醛质量为69.07g，β-丙氨酸质量为196.89g，磷酸氢二钠质量为7g，l-氨基酸脱氨酶为12u/l、甲酸脱氢酶为12u/l、醛缩酶为18u/l、酮泛解酸还原酶为12u/l，泛酸合成酶为14u/l。流加甲酸铵，维持反应液中甲酸铵浓度为2g/l。调节溶液温度为37℃，用氨水和稀硫酸调节溶液ph为5-7，在搅拌条件下持续反应22h，得到d-泛酸溶液，经检测，d-泛酸转化率见图1。
53.对比例1
54.向反应容器中加入缬氨酸、甲醛、复合酶、β-丙氨酸，加水至总体积为5l，搅拌溶
解，使得反应体系中：缬氨酸质量为300g，甲醛质量为69.07g，β-丙氨酸质量为196.89g，过氧化氢酶为12u/l，酮异戊酸还原酶为12u/l，羟甲基转移酶为18u/l，甲酸脱氢酶为12u/l，泛酸合成酶14u/l。流加甲酸铵，维持反应液中甲酸铵浓度为2g/l。调节溶液温度为37℃，反应过程中采用稀硫酸和氨水调节溶液ph为5-7，在搅拌条件下持续反应22h，得到d-泛酸溶液，经检测，d-泛酸转化率见图1。