自分泌trem2 scfv的嵌合抗原受体细胞及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，更具体地，涉及自分泌trem2 scfv的嵌合抗原受体细胞及其制备方法和应用。
背景技术：
2.car-t细胞疗法，即嵌合抗原受体t细胞疗法，是利用基因工程技术，将合成的嵌合抗原受体(cars)表达在t细胞上，从而使t细胞能够识别特地的癌细胞并被高度激活，从而更好地杀伤肿瘤细胞。car具有四个主要组件的模块化元件：抗原结合结构域、铰链、跨膜结构域和细胞内信号结构域。这些元件都具有独特的功能，并且可以通过组成元件的变化来实现car的最佳分子设计。
3.目前，在欧洲和美国已经批准了两款靶向cd19的car-t细胞产品，即yescarta和kymriah。两种产品最大的差别在于其共刺激结构域：yescarta是使用cd28，而kymriah则是使用4-1bb。kymriah已被批准用于复发或难治性b细胞恶性肿瘤，例如25岁以下患者的急性淋巴细胞白血病(all)，以及两次或以上复发或难治性弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)全身疗法；而yescarta主要被批准用于dlbcl和原发性纵隔大b细胞淋巴瘤(pmbcl)。迄今为止，使用car-t疗法时，成人all患者表现出最佳的完全缓解(cr)率(83％-93％)。但值得注意的是，由于在使用car-t疗法之前通常需要对患者进行非清髓化疗，因此这种高缓解率可能不能完全归功于car-t疗法。此外，儿童all患者的完全缓解率也较高，在67％和90％之间。相比之下，dlbcl患者的cr率介于43％和54％之间，慢性淋巴细胞白血病(cll)患者的cr率介于21％和29％之间。在car-t细胞治疗后，所有患者的疾病复发风险都很高，一项研究中显示有41％的患者在12个月内复发。
4.此外，目前car-t细胞在实体瘤中的效果普遍较差。在治疗实体瘤时，car-t细胞存在许多局限性，例如细胞因子释放综合征、抗原丢失导致的肿瘤逃逸、趋化因子受体谱不足、强直信号或耗竭导致的car-t细胞衰竭等。car-t细胞一旦进入肿瘤微环境，其对肿瘤细胞的细胞毒性和自身的增殖能力都会受到抑制。抑制的方式可以是通过接触依赖性的方式，也可以通过肿瘤和抑制性细胞分泌的细胞因子介导。tgf-β，ido，免疫检查点，以及抑制性免疫细胞(髓源抑制细胞)都可以抑制car-t细胞。一般情况下，树突状细胞是引起t细胞反应的关键调节因子。在促炎环境中，t细胞遇到树突状细胞后会被有效地激发，从而引起针对靶细胞的免疫应答；但是在缺乏炎症的环境中，t细胞可能会无免疫应答。例如，il-10不仅可以损害树突状细胞的抗肿瘤功能，还可以通过下调肿瘤细胞中tap1和tap2的表达，进而阻止抗原加工和呈递，使car-t细胞失去了内源性免疫系统的支持。tfg-β则是由肿瘤细胞和treg细胞共同产生的另一种广泛存在的细胞因子，它可以抑制t细胞的活化、增殖和分化。而ctla-4和pd-1则可以通过驱动t细胞进入无反应状态，使其无免疫应答。除此以外，物理因素如缺氧、营养缺乏、低ph的也会导致浸润免疫细胞发生功能障碍。因此，有必要对car-t细胞进一步修饰，从而提升car-t细胞杀伤肿瘤的效果。
5.此前已经有文献表明，trem2是一种与多种配体相互作用的受体，其中许多配体是
组织损伤的标志。trem2可由肿瘤浸润的巨噬细胞表达，越来越多的证据表明trem2在肿瘤相关巨噬细胞(tams)和髓源性抑制细胞(mdscs)中起作用。最近的一项研究发现，与健康对照组相比，肺癌患者和荷瘤小鼠的外周血单核细胞和tams上trem2显著上调。此外，肿瘤细胞周围巨噬细胞的trem2水平与肿瘤进展呈正相关。总之，越来越多的证据表明trem2在促进肿瘤免疫抑制微环境中起着重要作用。因此，trem2可能是靶向治疗肿瘤骨髓浸润和增强免疫检查点免疫治疗的理想靶标。
技术实现要素：
6.本发明所要解决的技术问题是克服现有技术所描述的上述缺陷，首先提供一种自分泌trem2 scfv的嵌合抗原受体。
7.本发明的第二个目的是提供编码一种自分泌trem2 scfv的嵌合抗原受体的基因序列。
8.本发明的第三个目的是提供表达上述嵌合抗原受体的细胞。
9.本发明的第四个目的是提供一种靶向治疗肿瘤的药物。
10.本发明的目的通过以下技术方案实现：
11.一种自分泌trem2 scfv的嵌合抗原受体，包含信号肽、能够结合肿瘤抗原的单链可变片段、铰链区、跨膜结构域、共刺激分子、免疫受体酪氨酸活化基序、自剪切肽段、抗trem2抗体的单链可变片段。
12.优选的，所述肿瘤抗原选自afp、bcma、b7h4、cd52、cd56、cd80、cdk4/m、cea、ct、dam、egfr、erbb3、elf2m、emmprin、epcam、g250、gage、gntv、hage、her2、hpve7、hsp70、htert、ice、igf1r、il2r、il5、lage、ldlr/fut、mage、mart1、mart2、mesothelin、mucl、prame、psma、rage、sage、tgff3、tpi/m、vegf、wtl、mlsn。
13.trem2有效地抑制了单核细胞分泌促炎细胞因子。另外，trem2在肿瘤微环境中，也可以抑制巨噬细胞和树突状细胞的抗原提呈功能，从而抑制t细胞的活化。为进一步优化car设计，克服肿瘤免疫抑制微环境、血液肿瘤易复发的问题，本发明在原来car表达载体上加入trem2 scfv，从而使设计的car-t能够表达分泌trem2 scfv，通过在肿瘤微环境中分泌的trem2 scfv，可以增强树突状细胞和巨噬细胞的抗原提呈能力，促进car-t细胞的活化，减少car-t细胞的衰竭。本发明的嵌合抗原受体t细胞显著提高car-t细胞在体内的抗肿瘤能力。
14.更优选的，所述肿瘤抗原为mlsn。
15.本发明还提供编码所述的自分泌trem2 scfv的嵌合抗原受体的基因序列，如seq id no：1所示。
16.本发明还提供含有所述基因序列的慢病毒载体。
17.本发明还提供表达所述嵌合抗原受体的细胞，所述细胞为t细胞或者含有t细胞的细胞群。
18.本发明还提供上述细胞的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
19.(1)获取特异性可自分泌trem2 scfv且靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体的核酸序列；
20.(2)将特异性可自分泌trem2 scfv且靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体的核酸序列重
组到慢病毒表达载体中，获得慢病毒表达质粒；
21.(3)将表达质粒转染至293t细胞；包装获得病毒颗粒，经离心浓缩后获得慢病毒浓缩液；
22.(4)将慢病毒浓缩液感染t淋巴细胞，从而获得可自分trem2 scfv且靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体修饰的t淋巴细胞。
23.本发明还提供一种靶向治疗肿瘤的药物，所述药物含有所述的嵌合抗原受体，或者能够表达所述嵌合抗原受体。
24.优选的，所述肿瘤为实体瘤或者血液瘤。
25.在本发明提供的该用途的具体实施例中，所述肿瘤为非小细胞肺癌。值得注意的是，本发明的car特征在于它包含分泌trem2 scfv。
26.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
27.本发明的可自分泌trem2 scfv的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，所述的嵌合抗原受体细胞可以特异性识别和杀伤高表达肿瘤相关抗原的肿瘤细胞，同时自分泌trem2 scfv。通过在肿瘤微环境中分泌的trem2 scfv，可以增强树突状细胞和巨噬细胞的抗原提呈能力，促进car-t细胞的活化，减少car-t细胞的衰竭，进而促进car-t分泌颗粒酶、穿孔素等杀伤物质，最终达到提高car-t细胞抗肿瘤能力的目的。
附图说明
28.图1为msln car-trem2-t细胞分子结构的设计；
29.图2显示msln car-trem2-t细胞能大量产生anti-trem2 scfv；
30.图3显示msln car-trem2-t细胞对pc-9细胞的裂解率高于msln car-t细胞；
31.图4显示msln car-trem2-t细胞能提高pc-9荷瘤小鼠的生存率。
具体实施方式
32.下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
33.下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
34.实施例1 car质粒的构建
35.本发明提供的嵌合抗原受体，由cd8α信号肽、msln scfv、cd8铰链区、cd8跨膜区、4-1bb胞内信号区、cd3ζ胞内信号区、t2a自剪切序列、抗体分泌信号肽、trem2 scfv串联形成，结构如图1所示；抗trem2单链抗体(抗trem2 scfv)基因序列来自本实验室构建的单克隆抗体序列，将其进行密码子优化，以保证在编码氨基酸序列不变的情况下更适合t细胞的表达，基因序列信息如序列表seq id no.1所示。设计好序列以后，委托上海捷瑞生物公司合成。
36.在完成msln car-trem2 scfv的合成后，亚克隆至含有cd19-car-t的pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp的质粒中，代替掉cd19 car中的抗cd19 scfv，从而获得含有msln car-trem2 scfv的pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp的质粒。
37.实施例2 car慢病毒的包装和滴定
38.利用上述构建的含有msln car-trem2 scfv的pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp的质粒，即可进一步制备包含msln car-trem2 scfv序列的慢病毒。
39.利用三质粒系统包装慢病毒用于后续的实验。三质粒系统分别是含有msln car-trem2 scfv的pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp的质粒、pspax2质粒和pmd2.g质粒。本发明中是利用293t细胞包装慢病毒。收集293t培养基上清中的病毒，然后通过超高速离心、重悬，以及后续的慢病毒滴度滴定，即可用于靶细胞的感染。感染的靶细胞是293t细胞：将293t细胞铺于微孔板中，待其长至70％-80％的密度。
40.本实施例中慢病毒的包装具体操作如下：
41.(1)将293t包装细胞以1.3-1.5x105细胞/ml的浓度接种到培养板中的接种培养基中。孵育细胞过夜。约24小时后，细胞应约70％汇合。
42.(2)转染包装细胞：准备3种转染质粒的混合物：pmd2.g质粒、pspax2质粒、重组质粒，以及optimem培养基。
43.(3)用optimem稀释lipofectamine 2,000：10μl lipofectamine 90μl optimem。滴加lipofectamine试剂，并通过旋转尖端或轻拂试管进行混合(勿通过移液或涡旋混合)；在室温下孵育5分钟。
44.(4)将3种质粒混合物逐滴添加到稀释的lipofectamine试剂中，并通过旋转尖端或轻弹试管进行混合。
45.(5)在室温下将转染混合物孵育5-40分钟。
46.(6)小心地将转染混合物转移到接种培养基中的包装细胞中，包装细胞可能对扰动敏感；注意不要将细胞从培养皿中移出。
47.(7)孵育细胞过夜，更换培养基以除去转染试剂。
48.(8)孵育细胞过夜。
49.(9)转染后约40小时收获含有慢病毒的培养基。将介质转移到存储管中。
50.(10)每12-24小时重复一次病毒收获，并用6ml收获培养基替换，以后的收获期病毒滴度趋于降低；最后一次收获后，丢弃包装细胞；病毒收获物可以根据需要合并。
51.(11)以1,250rpm的转速将含有病毒的培养基旋转5分钟，以沉淀收获期间收集的所有包装细胞。
52.(12)病毒可以在4℃下短时间(数小时至数天)存储，但应在-20℃或-80℃下冷冻以进行长期存储。为了减少冷冻/解冻循环的次数，请在长期储存之前将大规模病毒制剂分装到较小的储存管中。
53.通过上述的慢病毒包装，我们获得了含有目的基因的慢病毒。由于不同的细胞器感染复数不同，因此有必要进一步确定慢病毒载体的滴度。由于慢病毒带有荧光标记可以使用显微镜来确定荧光细胞的百分比，进而确定慢病毒滴度。本实施例中慢病毒滴度滴定的具体操作如下：
54.(1)将293t细胞接种到6孔培养皿的每个孔中。
55.(2)将细胞孵育过夜。
56.(3)如果使用新鲜收集的病毒，可通过0.45μm聚醚砜过滤器进行过滤，以除去细胞和碎片。
57.(4)在冻融循环中，慢病毒滴度会降低。如果要冷冻并分装病毒，必须从冷冻原种确定滴度，以解决与冻融相关的滴度损失。
58.(5)如果使用冷冻病毒，须在温水中搅拌，在37℃下快速融化慢病毒等分试样。
59.(6)将慢病毒稀释液制备到含有10μg/ml聚乙烯的dmem中。充分混合稀释液。
60.(7)从细胞中轻轻吸出培养基。
61.(8)向每孔中加入1.5ml病毒稀释液(每孔稀释一孔，剩余一孔)。
62.(9)计数剩余孔中的细胞，计算滴度需要细胞计数。
63.(10)孵育48-72小时。
64.(11)轻轻吸出培养基，并用1ml pbs代替。
65.(12)计算每个孔中荧光阳性细胞的百分比。
66.计算滴度时，仅考虑荧光阳性细胞少于40％的孔。滴定方法假设每个单元有1个积分事件。当百分比超过40％时，可能会对带有多个整合事件的细胞进行计数，这会导致低估真正的效价。
67.实施例3 car免疫细胞的制备
68.通过上述步骤确定好慢病毒的滴度后，即可使用慢病毒感染免疫细胞，进而获得稳定表达嵌合抗原受体的免疫细胞；本实例中，优选t细胞作为感染的细胞。慢病毒感染细胞的具体步骤如下：
69.(1)48孔板的包被：为了让慢病毒更加容易地感染t细胞，本实验中使用retronection将微孔板预包被。使用pbs将retronection稀释至15μg/ml，然后吸取150μl加至48孔板中，并在4℃下孵育过夜。第二天，吸去retronection溶液，并使用pbs洗涤2遍，备用。
70.(2)将使用cd3和cd28活化48小时后的t细胞，收集至15ml的离心管中，然后使用无血清培养基重悬。将重悬后的t细胞加至上述包被的48孔板中，调整t细胞的密度至1-5x106个细胞/ml。
71.(3)将包装好的car-t慢病毒，以moi为5的量加至微孔板中，轻轻混匀；然后使用离心机，以300xg的速度将微孔板离心60分钟。离心完成后，将微孔板放回培养箱中培养。
72.(4)t细胞继续培养大约2天后，将旧培养基换成新的，并在t细胞后续培养的不同时间点，检测car-t细胞的阳性率。
73.实施例4 car-t细胞分泌trem2 scfv的检测
74.为比较t、msln car-t、msln car-trem2-t细胞的trem2 scfv分泌情况，将实施例制备的t、msln car-t、msln car-trem2-t培养3天，回收上清液，通过elisa法测定trem2 scfv。检测结果显示对照组t、msln car-t均未检测到trem2 scfv，msln car-trem2-t检测到trem2细胞因子为300ng/ml以上(图2)。也进一步验证msln car-trem2-t可以分泌trem2 scfv。
75.实施例5 car-t细胞肿瘤杀伤能力的检测
76.为比较t、msln car-t、msln car-trem2-t细胞对肿瘤细胞杀伤能力的差异，我们采用cytotox非放射性细胞毒性检测法检测car-t细胞和肿瘤洗白共孵育后上清中ldh的释放量。cytotox非放射性细胞毒性检测是一种基于比色法的检测方法，可定量测量乳酸脱氢酶(ldh)。ldh是一种稳定的胞质酶，在细胞裂解时会释放出来。释放到上清中的
ldh越多，说明裂解的细胞越多。此外，本实例中，优选pc-9细胞作为被杀伤的细胞。具体操作步骤如下：
77.(1)对照：实验对照包括：效应细胞自发ldh释放：校正效应细胞自发释放出来的ldh；靶细胞自发ldh释放：校正靶细胞自发释放出来的ldh；靶细胞最大ldh释放：计算时需要该对照以确定100％的ldh释放；体积校正对照：校正由于加入裂解液(10x)引起的体积变化；培养基背景对照：校正由培养基中血清产生的ldh活性以及酚红造成的背景吸收；ldh阳性对照：2ul阳性对照加入到10mlpbs 1％bsa中。
78.(2)实验孔：加入固定数量的肿瘤细胞细胞至96孔板中，然后加入不同数量的效应细胞或外泌体。终体积不少于100ul/孔；然后在250g转速下离心4min，使效靶细胞充分接触。
79.(3)将上述培养系统培养4-8小时；在收集前45min，在靶细胞最大ldh对照孔中添加10ul裂解液。
80.(4)4小时后，在250g转速下离心4min。
81.(5)然后，吸取50ul上清，加至新的96孔板中。
82.(6)加入配好的50ul底物，使用锡箔纸包裹避光，室温孵育30min。
83.(7)加入50ul终止液。
84.(8)戳破大气泡，1h内在492nm中检测。
85.(9)计算：细胞毒性＝(实验-效应细胞自发-靶细胞白发)/(靶细胞最大一靶细胞自发)x 100％。结果显示，msln car-trem2-t细胞对pc-9细胞的裂解能力最强(图3)。
86.实施例6 car-t细胞体内的抗肿瘤效果
87.为比较t、msln car-t、msln car-trem2-t细胞在体内抗肿瘤效果的差异，我们将pc-9细胞种植到小鼠后，分别给不同组的小鼠输注不同的细胞，然后观察小鼠的生存率差异。具体操作如下：
88.(1)细胞准备：将pc-9肺癌细胞培养至对数生长期，待肺癌细胞生长至90％融合度的时候，使用胰酶消化、收集细胞，然后使用pbs洗涤3次，并使用pbs将细胞密度调整至1x107个/ml，备用。
89.(2)动物准备：将5-6周龄的balb/c小鼠，分组：t细胞组、msln car-t细胞组、msln car-trem2-t细胞组。
90.(3)使用1ml的注射针，将100μl的肺癌细胞接种于小鼠左下侧腹股沟中。每天测量小鼠肿瘤的体积大小。待肿瘤体积大小达到50至100mm3后，开始给予小鼠注射药物。肿瘤体积＝1/2x长(mm)x宽(mm)2。
91.(4)使用胰岛素针，分别给予t细胞组、msln car-t细胞组、msln car-trem2-t细胞组注射200μl相应的细胞。
92.(5)将注射药物当天记为0天，每天观察小鼠体重等变化，记录其死亡情况。
93.结果显示，注射msln car-trem2-t细胞的小鼠死亡率最低(图4)。
94.以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，更具体地，涉及自分泌trem2 scfv的嵌合抗原受体细胞及其制备方法和应用。
背景技术：
2.car-t细胞疗法，即嵌合抗原受体t细胞疗法，是利用基因工程技术，将合成的嵌合抗原受体(cars)表达在t细胞上，从而使t细胞能够识别特地的癌细胞并被高度激活，从而更好地杀伤肿瘤细胞。car具有四个主要组件的模块化元件：抗原结合结构域、铰链、跨膜结构域和细胞内信号结构域。这些元件都具有独特的功能，并且可以通过组成元件的变化来实现car的最佳分子设计。
3.目前，在欧洲和美国已经批准了两款靶向cd19的car-t细胞产品，即yescarta和kymriah。两种产品最大的差别在于其共刺激结构域：yescarta是使用cd28，而kymriah则是使用4-1bb。kymriah已被批准用于复发或难治性b细胞恶性肿瘤，例如25岁以下患者的急性淋巴细胞白血病(all)，以及两次或以上复发或难治性弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)全身疗法；而yescarta主要被批准用于dlbcl和原发性纵隔大b细胞淋巴瘤(pmbcl)。迄今为止，使用car-t疗法时，成人all患者表现出最佳的完全缓解(cr)率(83％-93％)。但值得注意的是，由于在使用car-t疗法之前通常需要对患者进行非清髓化疗，因此这种高缓解率可能不能完全归功于car-t疗法。此外，儿童all患者的完全缓解率也较高，在67％和90％之间。相比之下，dlbcl患者的cr率介于43％和54％之间，慢性淋巴细胞白血病(cll)患者的cr率介于21％和29％之间。在car-t细胞治疗后，所有患者的疾病复发风险都很高，一项研究中显示有41％的患者在12个月内复发。
4.此外，目前car-t细胞在实体瘤中的效果普遍较差。在治疗实体瘤时，car-t细胞存在许多局限性，例如细胞因子释放综合征、抗原丢失导致的肿瘤逃逸、趋化因子受体谱不足、强直信号或耗竭导致的car-t细胞衰竭等。car-t细胞一旦进入肿瘤微环境，其对肿瘤细胞的细胞毒性和自身的增殖能力都会受到抑制。抑制的方式可以是通过接触依赖性的方式，也可以通过肿瘤和抑制性细胞分泌的细胞因子介导。tgf-β，ido，免疫检查点，以及抑制性免疫细胞(髓源抑制细胞)都可以抑制car-t细胞。一般情况下，树突状细胞是引起t细胞反应的关键调节因子。在促炎环境中，t细胞遇到树突状细胞后会被有效地激发，从而引起针对靶细胞的免疫应答；但是在缺乏炎症的环境中，t细胞可能会无免疫应答。例如，il-10不仅可以损害树突状细胞的抗肿瘤功能，还可以通过下调肿瘤细胞中tap1和tap2的表达，进而阻止抗原加工和呈递，使car-t细胞失去了内源性免疫系统的支持。tfg-β则是由肿瘤细胞和treg细胞共同产生的另一种广泛存在的细胞因子，它可以抑制t细胞的活化、增殖和分化。而ctla-4和pd-1则可以通过驱动t细胞进入无反应状态，使其无免疫应答。除此以外，物理因素如缺氧、营养缺乏、低ph的也会导致浸润免疫细胞发生功能障碍。因此，有必要对car-t细胞进一步修饰，从而提升car-t细胞杀伤肿瘤的效果。
5.此前已经有文献表明，trem2是一种与多种配体相互作用的受体，其中许多配体是
组织损伤的标志。trem2可由肿瘤浸润的巨噬细胞表达，越来越多的证据表明trem2在肿瘤相关巨噬细胞(tams)和髓源性抑制细胞(mdscs)中起作用。最近的一项研究发现，与健康对照组相比，肺癌患者和荷瘤小鼠的外周血单核细胞和tams上trem2显著上调。此外，肿瘤细胞周围巨噬细胞的trem2水平与肿瘤进展呈正相关。总之，越来越多的证据表明trem2在促进肿瘤免疫抑制微环境中起着重要作用。因此，trem2可能是靶向治疗肿瘤骨髓浸润和增强免疫检查点免疫治疗的理想靶标。
技术实现要素：
6.本发明所要解决的技术问题是克服现有技术所描述的上述缺陷，首先提供一种自分泌trem2 scfv的嵌合抗原受体。
7.本发明的第二个目的是提供编码一种自分泌trem2 scfv的嵌合抗原受体的基因序列。
8.本发明的第三个目的是提供表达上述嵌合抗原受体的细胞。
9.本发明的第四个目的是提供一种靶向治疗肿瘤的药物。
10.本发明的目的通过以下技术方案实现：
11.一种自分泌trem2 scfv的嵌合抗原受体，包含信号肽、能够结合肿瘤抗原的单链可变片段、铰链区、跨膜结构域、共刺激分子、免疫受体酪氨酸活化基序、自剪切肽段、抗trem2抗体的单链可变片段。
12.优选的，所述肿瘤抗原选自afp、bcma、b7h4、cd52、cd56、cd80、cdk4/m、cea、ct、dam、egfr、erbb3、elf2m、emmprin、epcam、g250、gage、gntv、hage、her2、hpve7、hsp70、htert、ice、igf1r、il2r、il5、lage、ldlr/fut、mage、mart1、mart2、mesothelin、mucl、prame、psma、rage、sage、tgff3、tpi/m、vegf、wtl、mlsn。
13.trem2有效地抑制了单核细胞分泌促炎细胞因子。另外，trem2在肿瘤微环境中，也可以抑制巨噬细胞和树突状细胞的抗原提呈功能，从而抑制t细胞的活化。为进一步优化car设计，克服肿瘤免疫抑制微环境、血液肿瘤易复发的问题，本发明在原来car表达载体上加入trem2 scfv，从而使设计的car-t能够表达分泌trem2 scfv，通过在肿瘤微环境中分泌的trem2 scfv，可以增强树突状细胞和巨噬细胞的抗原提呈能力，促进car-t细胞的活化，减少car-t细胞的衰竭。本发明的嵌合抗原受体t细胞显著提高car-t细胞在体内的抗肿瘤能力。
14.更优选的，所述肿瘤抗原为mlsn。
15.本发明还提供编码所述的自分泌trem2 scfv的嵌合抗原受体的基因序列，如seq id no：1所示。
16.本发明还提供含有所述基因序列的慢病毒载体。
17.本发明还提供表达所述嵌合抗原受体的细胞，所述细胞为t细胞或者含有t细胞的细胞群。
18.本发明还提供上述细胞的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
19.(1)获取特异性可自分泌trem2 scfv且靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体的核酸序列；
20.(2)将特异性可自分泌trem2 scfv且靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体的核酸序列重
组到慢病毒表达载体中，获得慢病毒表达质粒；
21.(3)将表达质粒转染至293t细胞；包装获得病毒颗粒，经离心浓缩后获得慢病毒浓缩液；
22.(4)将慢病毒浓缩液感染t淋巴细胞，从而获得可自分trem2 scfv且靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体修饰的t淋巴细胞。
23.本发明还提供一种靶向治疗肿瘤的药物，所述药物含有所述的嵌合抗原受体，或者能够表达所述嵌合抗原受体。
24.优选的，所述肿瘤为实体瘤或者血液瘤。
25.在本发明提供的该用途的具体实施例中，所述肿瘤为非小细胞肺癌。值得注意的是，本发明的car特征在于它包含分泌trem2 scfv。
26.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
27.本发明的可自分泌trem2 scfv的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，所述的嵌合抗原受体细胞可以特异性识别和杀伤高表达肿瘤相关抗原的肿瘤细胞，同时自分泌trem2 scfv。通过在肿瘤微环境中分泌的trem2 scfv，可以增强树突状细胞和巨噬细胞的抗原提呈能力，促进car-t细胞的活化，减少car-t细胞的衰竭，进而促进car-t分泌颗粒酶、穿孔素等杀伤物质，最终达到提高car-t细胞抗肿瘤能力的目的。
附图说明
28.图1为msln car-trem2-t细胞分子结构的设计；
29.图2显示msln car-trem2-t细胞能大量产生anti-trem2 scfv；
30.图3显示msln car-trem2-t细胞对pc-9细胞的裂解率高于msln car-t细胞；
31.图4显示msln car-trem2-t细胞能提高pc-9荷瘤小鼠的生存率。
具体实施方式
32.下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
33.下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
34.实施例1 car质粒的构建
35.本发明提供的嵌合抗原受体，由cd8α信号肽、msln scfv、cd8铰链区、cd8跨膜区、4-1bb胞内信号区、cd3ζ胞内信号区、t2a自剪切序列、抗体分泌信号肽、trem2 scfv串联形成，结构如图1所示；抗trem2单链抗体(抗trem2 scfv)基因序列来自本实验室构建的单克隆抗体序列，将其进行密码子优化，以保证在编码氨基酸序列不变的情况下更适合t细胞的表达，基因序列信息如序列表seq id no.1所示。设计好序列以后，委托上海捷瑞生物公司合成。
36.在完成msln car-trem2 scfv的合成后，亚克隆至含有cd19-car-t的pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp的质粒中，代替掉cd19 car中的抗cd19 scfv，从而获得含有msln car-trem2 scfv的pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp的质粒。
37.实施例2 car慢病毒的包装和滴定
38.利用上述构建的含有msln car-trem2 scfv的pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp的质粒，即可进一步制备包含msln car-trem2 scfv序列的慢病毒。
39.利用三质粒系统包装慢病毒用于后续的实验。三质粒系统分别是含有msln car-trem2 scfv的pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp的质粒、pspax2质粒和pmd2.g质粒。本发明中是利用293t细胞包装慢病毒。收集293t培养基上清中的病毒，然后通过超高速离心、重悬，以及后续的慢病毒滴度滴定，即可用于靶细胞的感染。感染的靶细胞是293t细胞：将293t细胞铺于微孔板中，待其长至70％-80％的密度。
40.本实施例中慢病毒的包装具体操作如下：
41.(1)将293t包装细胞以1.3-1.5x105细胞/ml的浓度接种到培养板中的接种培养基中。孵育细胞过夜。约24小时后，细胞应约70％汇合。
42.(2)转染包装细胞：准备3种转染质粒的混合物：pmd2.g质粒、pspax2质粒、重组质粒，以及optimem培养基。
43.(3)用optimem稀释lipofectamine 2,000：10μl lipofectamine 90μl optimem。滴加lipofectamine试剂，并通过旋转尖端或轻拂试管进行混合(勿通过移液或涡旋混合)；在室温下孵育5分钟。
44.(4)将3种质粒混合物逐滴添加到稀释的lipofectamine试剂中，并通过旋转尖端或轻弹试管进行混合。
45.(5)在室温下将转染混合物孵育5-40分钟。
46.(6)小心地将转染混合物转移到接种培养基中的包装细胞中，包装细胞可能对扰动敏感；注意不要将细胞从培养皿中移出。
47.(7)孵育细胞过夜，更换培养基以除去转染试剂。
48.(8)孵育细胞过夜。
49.(9)转染后约40小时收获含有慢病毒的培养基。将介质转移到存储管中。
50.(10)每12-24小时重复一次病毒收获，并用6ml收获培养基替换，以后的收获期病毒滴度趋于降低；最后一次收获后，丢弃包装细胞；病毒收获物可以根据需要合并。
51.(11)以1,250rpm的转速将含有病毒的培养基旋转5分钟，以沉淀收获期间收集的所有包装细胞。
52.(12)病毒可以在4℃下短时间(数小时至数天)存储，但应在-20℃或-80℃下冷冻以进行长期存储。为了减少冷冻/解冻循环的次数，请在长期储存之前将大规模病毒制剂分装到较小的储存管中。
53.通过上述的慢病毒包装，我们获得了含有目的基因的慢病毒。由于不同的细胞器感染复数不同，因此有必要进一步确定慢病毒载体的滴度。由于慢病毒带有荧光标记可以使用显微镜来确定荧光细胞的百分比，进而确定慢病毒滴度。本实施例中慢病毒滴度滴定的具体操作如下：
54.(1)将293t细胞接种到6孔培养皿的每个孔中。
55.(2)将细胞孵育过夜。
56.(3)如果使用新鲜收集的病毒，可通过0.45μm聚醚砜过滤器进行过滤，以除去细胞和碎片。
57.(4)在冻融循环中，慢病毒滴度会降低。如果要冷冻并分装病毒，必须从冷冻原种确定滴度，以解决与冻融相关的滴度损失。
58.(5)如果使用冷冻病毒，须在温水中搅拌，在37℃下快速融化慢病毒等分试样。
59.(6)将慢病毒稀释液制备到含有10μg/ml聚乙烯的dmem中。充分混合稀释液。
60.(7)从细胞中轻轻吸出培养基。
61.(8)向每孔中加入1.5ml病毒稀释液(每孔稀释一孔，剩余一孔)。
62.(9)计数剩余孔中的细胞，计算滴度需要细胞计数。
63.(10)孵育48-72小时。
64.(11)轻轻吸出培养基，并用1ml pbs代替。
65.(12)计算每个孔中荧光阳性细胞的百分比。
66.计算滴度时，仅考虑荧光阳性细胞少于40％的孔。滴定方法假设每个单元有1个积分事件。当百分比超过40％时，可能会对带有多个整合事件的细胞进行计数，这会导致低估真正的效价。
67.实施例3 car免疫细胞的制备
68.通过上述步骤确定好慢病毒的滴度后，即可使用慢病毒感染免疫细胞，进而获得稳定表达嵌合抗原受体的免疫细胞；本实例中，优选t细胞作为感染的细胞。慢病毒感染细胞的具体步骤如下：
69.(1)48孔板的包被：为了让慢病毒更加容易地感染t细胞，本实验中使用retronection将微孔板预包被。使用pbs将retronection稀释至15μg/ml，然后吸取150μl加至48孔板中，并在4℃下孵育过夜。第二天，吸去retronection溶液，并使用pbs洗涤2遍，备用。
70.(2)将使用cd3和cd28活化48小时后的t细胞，收集至15ml的离心管中，然后使用无血清培养基重悬。将重悬后的t细胞加至上述包被的48孔板中，调整t细胞的密度至1-5x106个细胞/ml。
71.(3)将包装好的car-t慢病毒，以moi为5的量加至微孔板中，轻轻混匀；然后使用离心机，以300xg的速度将微孔板离心60分钟。离心完成后，将微孔板放回培养箱中培养。
72.(4)t细胞继续培养大约2天后，将旧培养基换成新的，并在t细胞后续培养的不同时间点，检测car-t细胞的阳性率。
73.实施例4 car-t细胞分泌trem2 scfv的检测
74.为比较t、msln car-t、msln car-trem2-t细胞的trem2 scfv分泌情况，将实施例制备的t、msln car-t、msln car-trem2-t培养3天，回收上清液，通过elisa法测定trem2 scfv。检测结果显示对照组t、msln car-t均未检测到trem2 scfv，msln car-trem2-t检测到trem2细胞因子为300ng/ml以上(图2)。也进一步验证msln car-trem2-t可以分泌trem2 scfv。
75.实施例5 car-t细胞肿瘤杀伤能力的检测
76.为比较t、msln car-t、msln car-trem2-t细胞对肿瘤细胞杀伤能力的差异，我们采用cytotox非放射性细胞毒性检测法检测car-t细胞和肿瘤洗白共孵育后上清中ldh的释放量。cytotox非放射性细胞毒性检测是一种基于比色法的检测方法，可定量测量乳酸脱氢酶(ldh)。ldh是一种稳定的胞质酶，在细胞裂解时会释放出来。释放到上清中的
ldh越多，说明裂解的细胞越多。此外，本实例中，优选pc-9细胞作为被杀伤的细胞。具体操作步骤如下：
77.(1)对照：实验对照包括：效应细胞自发ldh释放：校正效应细胞自发释放出来的ldh；靶细胞自发ldh释放：校正靶细胞自发释放出来的ldh；靶细胞最大ldh释放：计算时需要该对照以确定100％的ldh释放；体积校正对照：校正由于加入裂解液(10x)引起的体积变化；培养基背景对照：校正由培养基中血清产生的ldh活性以及酚红造成的背景吸收；ldh阳性对照：2ul阳性对照加入到10mlpbs 1％bsa中。
78.(2)实验孔：加入固定数量的肿瘤细胞细胞至96孔板中，然后加入不同数量的效应细胞或外泌体。终体积不少于100ul/孔；然后在250g转速下离心4min，使效靶细胞充分接触。
79.(3)将上述培养系统培养4-8小时；在收集前45min，在靶细胞最大ldh对照孔中添加10ul裂解液。
80.(4)4小时后，在250g转速下离心4min。
81.(5)然后，吸取50ul上清，加至新的96孔板中。
82.(6)加入配好的50ul底物，使用锡箔纸包裹避光，室温孵育30min。
83.(7)加入50ul终止液。
84.(8)戳破大气泡，1h内在492nm中检测。
85.(9)计算：细胞毒性＝(实验-效应细胞自发-靶细胞白发)/(靶细胞最大一靶细胞自发)x 100％。结果显示，msln car-trem2-t细胞对pc-9细胞的裂解能力最强(图3)。
86.实施例6 car-t细胞体内的抗肿瘤效果
87.为比较t、msln car-t、msln car-trem2-t细胞在体内抗肿瘤效果的差异，我们将pc-9细胞种植到小鼠后，分别给不同组的小鼠输注不同的细胞，然后观察小鼠的生存率差异。具体操作如下：
88.(1)细胞准备：将pc-9肺癌细胞培养至对数生长期，待肺癌细胞生长至90％融合度的时候，使用胰酶消化、收集细胞，然后使用pbs洗涤3次，并使用pbs将细胞密度调整至1x107个/ml，备用。
89.(2)动物准备：将5-6周龄的balb/c小鼠，分组：t细胞组、msln car-t细胞组、msln car-trem2-t细胞组。
90.(3)使用1ml的注射针，将100μl的肺癌细胞接种于小鼠左下侧腹股沟中。每天测量小鼠肿瘤的体积大小。待肿瘤体积大小达到50至100mm3后，开始给予小鼠注射药物。肿瘤体积＝1/2x长(mm)x宽(mm)2。
91.(4)使用胰岛素针，分别给予t细胞组、msln car-t细胞组、msln car-trem2-t细胞组注射200μl相应的细胞。
92.(5)将注射药物当天记为0天，每天观察小鼠体重等变化，记录其死亡情况。
93.结果显示，注射msln car-trem2-t细胞的小鼠死亡率最低(图4)。
94.以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
再多了解一些
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