一种检测h7亚型禽流感病毒的引物对及其引用、检测h7亚型禽流感病毒的方法
1.本申请是申请日为2016年01月29日、申请号为201610063693.8、发明名称为《h7亚型禽流感病毒核酸快速检测方法》的分案申请。
技术领域
2.本发明属于生物技术领域，具体说来，本发明涉及一种检测h7亚型禽流感病毒的引物对及其引用、检测h7亚型禽流感病毒的方法。
背景技术：
3.禽流感根据致病性的不同，可以分为高致病性禽流感、低致病性禽流感和无致病性禽流感。其中，高致病性禽流感是由h5和h7亚型的某些毒株引起的疾病。
4.病毒核酸检测是病毒检测重要方法之一。目前，国内外对h7亚型禽流感病毒的各种核酸检测方法，包括农业行业标准或国家标准，耗费时间都比较长，如农业行业标准(禽流感病毒rt-pcr检测方法，ny/t 772
–
2013)至少需要2h，国家标准(h7亚型禽流感病毒荧光rt-pcr检测方法，gb/t 19438.3
–
2004)至少需要1.2h，目前没有比这些方法效率更高的检测方法。
技术实现要素：
5.本发明针对上述现有h7亚型禽流感病毒检测技术的不足，开展了深入研究和测试，建立了基于重组酶聚合酶扩增技术的h7亚型禽流感病毒核酸快速检测方法，仅需20min即可完成检测。该方法包括以下三个方面内容：
6.(一)确立了核酸检测所需要的引物序列，针对h7亚型禽流感病毒ha 基因中保守区域，设计引物序列，其中上游引物序列含有30个碱基，序列为 5
’‑
ggtattcgctctgattgcgatcattccaac-3’(即序列表中seq id no.1)，下游上游引物序列含有30个碱基，序列为 5
’‑
ttccactgtatgtgaatcccattgcttcct-3’(即序列表中seq id no.2)；
7.(二)确立了基于重组酶聚合酶扩增技术的快速检测方法；
8.(三)确立了检测反应体系和反应条件，在聚合酶链式反应管中依次加入纯水9.2μl、反应缓冲液29.5μl(含有datp、dgtp、dttp、dctp等四种核苷酸)、第一步所合成的上游引物2.4μl(浓度为10μmol/l)、第一步所合成的下游引物2.4μl(浓度为10μmol/l)、酶混合物[逆转录酶、能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链dna结合蛋白(ssb)和链置换dna 聚合酶]1.0μl、rna酶抑制剂1.0μl、需要检测的流感病毒核酸2.0μl(从临床样品或其他样品中用核酸提取试剂盒提取的)、醋酸镁(280mmol/l)2.5μl；然后将反应体系密闭，置于恒温仪(或水浴锅)上进行反应，反应条件为40℃ 20min；反应结束后，在反应产物中加入含有颜色的核酸电泳缓冲液，进行琼脂糖核酸凝胶电泳，如果出现大小约为395bp的核酸电泳条带，则判断为阳性，否则判断为阴性。
[0009]
本发明提供的引物对能够快速检测h7亚型禽流感病毒，在体外诊断、兽医、食品安
全、生物安全等领域有较大的使用价值。
具体实施方式
[0010]
下面通过实施例，说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于这个实施例。
[0011]
本实施例用重组酶聚合酶扩增技术，对h7亚型禽流感病毒进行核酸快速检测，包括如下步骤：
[0012]
第一步(合成引物)：按照本发明指定的核酸序列(即序列表中seq id no.1和seq id no.2)，人工合成重组酶聚合酶扩增反应所需要的上游引物和下游引物；
[0013]
第二步(配置反应体系)：在聚合酶链式反应管中依次加入纯水9.2μl、反应缓冲液29.5μl(含有datp、dgtp、dttp、dctp等四种核苷酸)、第一步所合成的上游引物2.4μl(浓度为10μmol/l)、第一步所合成的下游引物 2.4μl(浓度为10μmol/l)、酶混合物[逆转录酶、能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链dna结合蛋白(ssb)和链置换dna聚合酶]1.0μl、 rna酶抑制剂1.0μl、需要检测的流感病毒核酸2.0μl(从临床样品或其他样品中用核酸提取试剂盒提取的)、醋酸镁(280mmol/l)2.5μl；
[0014]
第三步(反应)：将第二步配置好的反应体系密闭后，置于恒温仪(或水浴锅)上进行反应，反应条件为40℃20min；
[0015]
第四步(结果检测)：在第三步的反应产物中加入含有颜色的核酸电泳缓冲液，进行琼脂糖核酸凝胶电泳，如果出现大小约为395bp的核酸电泳条带，则判断为阳性，否则判断为阴性。
[0016]
实际应用结果：对96份h7亚型禽流感病毒标准阳性临床样品进行检测，以及300份标准阴性样品，用上述h7亚型禽流感病毒快速核酸检测技术进行检测，结果显示该技术的灵敏度为100.0％，特异性为100.0％。
技术特征：
1.一种检测h7亚型禽流感病毒的引物对，其特征在于，包括序列为seq id no.1所示的上游引物和序列为seq id no.2所示的下游引物。2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述上游引物和下游引物扩增片段的大小为395bp。3.权利要求1或2所述引物对制备检测h7亚型禽流感病毒的试剂盒中的应用。4.一种以非疾病诊断目的检测h7亚型禽流感病毒的方法，其特征在于，利用权利要求1或2所述的引物对对待检测样品进行rpa反应，如扩增出大小为395bp的条带说明检测到h7亚型禽流感病毒。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，进行所述rpa反应时，以50μl的总体系计，由纯水9.2μl、反应缓冲液29.5μl、权利要求1或2所述上游引物2.4μl、权利要求1或2所述下游引物2.4μl、酶混合物1.0μl、rna酶抑制剂1.0μl、待检测样品2.0μl和醋酸镁2.5μl组成。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述酶混合物包括逆转录酶、能结合单链核酸的重组酶、单链dna结合蛋白和链置换dna聚合酶；所述反应缓冲液包括datp、dgtp、dttp和dctp。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述上游引物和下游引物的浓度均独立的为10μmol/l；所述醋酸镁的浓度为280mmol/l。8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述rpa反应的温度为40℃，时间为20min。
技术总结
本发明属于生物技术领域，提供了一种检测H7亚型禽流感病毒的引物对及其引用、检测H7亚型禽流感病毒的方法。本发明提供的引物对包括序列为SEQ ID NO.1所示的上游引物和序列为SEQ ID NO.2所示的下游引物，能够快速检测H7亚型禽流感病毒，可以用于H7亚型禽流感病毒的科学研究，也可以用于动物或人的临床诊断检测。测。
技术研发人员：蒋文明
受保护的技术使用者：中国动物卫生与流行病学中心
技术研发日：2016.01.29
技术公布日：2022/6/21
1.本申请是申请日为2016年01月29日、申请号为201610063693.8、发明名称为《h7亚型禽流感病毒核酸快速检测方法》的分案申请。
技术领域
2.本发明属于生物技术领域，具体说来，本发明涉及一种检测h7亚型禽流感病毒的引物对及其引用、检测h7亚型禽流感病毒的方法。
背景技术：
3.禽流感根据致病性的不同，可以分为高致病性禽流感、低致病性禽流感和无致病性禽流感。其中，高致病性禽流感是由h5和h7亚型的某些毒株引起的疾病。
4.病毒核酸检测是病毒检测重要方法之一。目前，国内外对h7亚型禽流感病毒的各种核酸检测方法，包括农业行业标准或国家标准，耗费时间都比较长，如农业行业标准(禽流感病毒rt-pcr检测方法，ny/t 772
–
2013)至少需要2h，国家标准(h7亚型禽流感病毒荧光rt-pcr检测方法，gb/t 19438.3
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2004)至少需要1.2h，目前没有比这些方法效率更高的检测方法。
技术实现要素：
5.本发明针对上述现有h7亚型禽流感病毒检测技术的不足，开展了深入研究和测试，建立了基于重组酶聚合酶扩增技术的h7亚型禽流感病毒核酸快速检测方法，仅需20min即可完成检测。该方法包括以下三个方面内容：
6.(一)确立了核酸检测所需要的引物序列，针对h7亚型禽流感病毒ha 基因中保守区域，设计引物序列，其中上游引物序列含有30个碱基，序列为 5
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ggtattcgctctgattgcgatcattccaac-3’(即序列表中seq id no.1)，下游上游引物序列含有30个碱基，序列为 5
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ttccactgtatgtgaatcccattgcttcct-3’(即序列表中seq id no.2)；
7.(二)确立了基于重组酶聚合酶扩增技术的快速检测方法；
8.(三)确立了检测反应体系和反应条件，在聚合酶链式反应管中依次加入纯水9.2μl、反应缓冲液29.5μl(含有datp、dgtp、dttp、dctp等四种核苷酸)、第一步所合成的上游引物2.4μl(浓度为10μmol/l)、第一步所合成的下游引物2.4μl(浓度为10μmol/l)、酶混合物[逆转录酶、能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链dna结合蛋白(ssb)和链置换dna 聚合酶]1.0μl、rna酶抑制剂1.0μl、需要检测的流感病毒核酸2.0μl(从临床样品或其他样品中用核酸提取试剂盒提取的)、醋酸镁(280mmol/l)2.5μl；然后将反应体系密闭，置于恒温仪(或水浴锅)上进行反应，反应条件为40℃ 20min；反应结束后，在反应产物中加入含有颜色的核酸电泳缓冲液，进行琼脂糖核酸凝胶电泳，如果出现大小约为395bp的核酸电泳条带，则判断为阳性，否则判断为阴性。
[0009]
本发明提供的引物对能够快速检测h7亚型禽流感病毒，在体外诊断、兽医、食品安
全、生物安全等领域有较大的使用价值。
具体实施方式
[0010]
下面通过实施例，说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于这个实施例。
[0011]
本实施例用重组酶聚合酶扩增技术，对h7亚型禽流感病毒进行核酸快速检测，包括如下步骤：
[0012]
第一步(合成引物)：按照本发明指定的核酸序列(即序列表中seq id no.1和seq id no.2)，人工合成重组酶聚合酶扩增反应所需要的上游引物和下游引物；
[0013]
第二步(配置反应体系)：在聚合酶链式反应管中依次加入纯水9.2μl、反应缓冲液29.5μl(含有datp、dgtp、dttp、dctp等四种核苷酸)、第一步所合成的上游引物2.4μl(浓度为10μmol/l)、第一步所合成的下游引物 2.4μl(浓度为10μmol/l)、酶混合物[逆转录酶、能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链dna结合蛋白(ssb)和链置换dna聚合酶]1.0μl、 rna酶抑制剂1.0μl、需要检测的流感病毒核酸2.0μl(从临床样品或其他样品中用核酸提取试剂盒提取的)、醋酸镁(280mmol/l)2.5μl；
[0014]
第三步(反应)：将第二步配置好的反应体系密闭后，置于恒温仪(或水浴锅)上进行反应，反应条件为40℃20min；
[0015]
第四步(结果检测)：在第三步的反应产物中加入含有颜色的核酸电泳缓冲液，进行琼脂糖核酸凝胶电泳，如果出现大小约为395bp的核酸电泳条带，则判断为阳性，否则判断为阴性。
[0016]
实际应用结果：对96份h7亚型禽流感病毒标准阳性临床样品进行检测，以及300份标准阴性样品，用上述h7亚型禽流感病毒快速核酸检测技术进行检测，结果显示该技术的灵敏度为100.0％，特异性为100.0％。
技术特征：
1.一种检测h7亚型禽流感病毒的引物对，其特征在于，包括序列为seq id no.1所示的上游引物和序列为seq id no.2所示的下游引物。2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述上游引物和下游引物扩增片段的大小为395bp。3.权利要求1或2所述引物对制备检测h7亚型禽流感病毒的试剂盒中的应用。4.一种以非疾病诊断目的检测h7亚型禽流感病毒的方法，其特征在于，利用权利要求1或2所述的引物对对待检测样品进行rpa反应，如扩增出大小为395bp的条带说明检测到h7亚型禽流感病毒。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，进行所述rpa反应时，以50μl的总体系计，由纯水9.2μl、反应缓冲液29.5μl、权利要求1或2所述上游引物2.4μl、权利要求1或2所述下游引物2.4μl、酶混合物1.0μl、rna酶抑制剂1.0μl、待检测样品2.0μl和醋酸镁2.5μl组成。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述酶混合物包括逆转录酶、能结合单链核酸的重组酶、单链dna结合蛋白和链置换dna聚合酶；所述反应缓冲液包括datp、dgtp、dttp和dctp。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述上游引物和下游引物的浓度均独立的为10μmol/l；所述醋酸镁的浓度为280mmol/l。8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述rpa反应的温度为40℃，时间为20min。
技术总结
本发明属于生物技术领域，提供了一种检测H7亚型禽流感病毒的引物对及其引用、检测H7亚型禽流感病毒的方法。本发明提供的引物对包括序列为SEQ ID NO.1所示的上游引物和序列为SEQ ID NO.2所示的下游引物，能够快速检测H7亚型禽流感病毒，可以用于H7亚型禽流感病毒的科学研究，也可以用于动物或人的临床诊断检测。测。
技术研发人员：蒋文明
受保护的技术使用者：中国动物卫生与流行病学中心
技术研发日：2016.01.29
技术公布日：2022/6/21
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