针对IL-17A和TNFα的双特异性单域抗体及其用途的制作方法

针对il-17a和tnf
α
的双特异性单域抗体及其用途
技术领域
1.本发明涉及能够分别与il-17a和tnfα 特异性结合的双特异性抗体(以下，其缩写为“il-17a/tnfα 双特异性抗体”)，以及含有该双特异性抗体作为有效成分的药物组合物，及其药物治疗用途。


背景技术：

2.银屑病是一种较为常见的慢性炎症性皮肤病，俗称牛皮癣。该病在冬季易复发或加重，春秋季节多缓解，全球患病率约在2%～3%，其中有1/3的银屑病患者有银屑病关节炎(psoriaticarthritis，psa)，常伴有关节肿痛、僵硬及运动障碍，部分可累及脊柱，严重者可造成残疾，对于患者身心健康产生了严重的影响。银屑病按照其临床特征进行分类，主要有以下几类：寻常型、关节型、脓疱型及红皮病型，90%以上的银屑病属于寻常型，该病的其他类型多由于患者在治疗期间使用外用刺激性药物、过度使用糖皮质激素以及免疫抑制剂过程中突然停药所导致。
3.银屑病发病机制尚不清楚。目前关于psa的治疗方案主要为非甾体抗炎药、糖皮质激素、抗风湿药物、硫唑嘌呤、维a酸类等，以及物理治疗、中医治疗等方法来缓解症状、控制病情。传统疗法由于疗效欠佳及不良反应，如长期使用激素会导致各种各样的副作用（血压升高、血糖升高、骨质疏松、消化道溃疡、皮肤萎缩等），临床上逐渐倾向于生物制剂的研究，肿瘤坏死因子抑制剂经常被选为psa患者的首选生物疗法，此外还有抗il-17类生物制剂。
4.银屑病以角质形成细胞过度增生、炎症细胞浸润、新生血管形成作为其组织病理改变的三要素。患者存在多种免疫细胞、免疫分子、细胞内信号传导系统等功能异常，发病有一定的潜伏期，而在该时期服用抗疟疾、抗精神病锂制剂、抗高血压的β受体阻滞剂以及血管紧张素转换酶抑制剂均会诱发该病的发生。严重影响患者的生活质量甚至身心健康。
5.银屑病的发病机制尚不清楚，目前认为它是多基因遗传背景下的自身免疫紊乱性疾病。其发病与t淋巴细胞，主要是cd4 th1淋巴细胞介导的免疫有关，致病过程包括初始t淋巴细胞活化为记忆-效应t淋巴细胞，记忆-效应t淋巴细胞进入循环移行至皮肤，聚集于病变部位，分泌多种细胞因子发挥多种生物学功能而致病。
6.tnf-α（同tnfα）是一种具有广泛生物学活性的细胞因子，在拥有tnf-α、tnf-β、tnf-γ的tnf家族总活性中tnf-α的活性占70%～95%，在异常情况下，特别是其水平升高时会导致免疫病理反应，如类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病、炎性肠炎、克朗病等。研究发现，银屑病患者皮损、血清、关节腔滑膜或细胞培养上清液中tnf-α的水平较正常对照组明显升高，经治疗后会有不同程度的下降，且银屑病患者病情严重程度与tnf-α的水平呈正相关，提示tnf-α在银屑病发病机制中有重要作用。
7.tnf-α主要由巨噬细胞分泌，其他类型的细胞如淋巴细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞等在一定条件下也可产生和释放tnf-α，当银屑病免疫病理机制的开关被打开后，t淋巴细胞中th1、th2细胞均可产生tnf-α，使其发挥致病的生物学效应。已经知道tnf-α具有杀伤或抑制肿瘤细胞、抗感染的作用，其还能参与炎症反应、促进细胞增殖和分化，而后两者在
银屑病的发病中起重要作用。
8.il-17a是il-17细胞因子家族最早发现的成成员，主要由th17细胞分泌。1986年，mosmann、coffman及相关研究组成员发现辅助性t细胞的两个亚群－th1和th2(mosmannetal.,1986)。除了th17细胞外，还有其他t细胞（包括cd8 t细胞、γδt细胞、nkt细胞）和固有免疫细胞（包括nk细胞、ilc3细胞等）能够分泌il-17a。近年来，大量关于il-17a和th17细胞的研究成果显示il-17a参与了很多自身免疫性疾病（如类风湿性关节炎和脑脊髓炎）的病理进程，同时在抗细菌和抗真菌感染免疫中起着重要的保护作用(iwakuraetal.,2011a)。
9.银屑病是一种表皮细胞过度增生的自身免疫性皮肤疾病，研究表明il-17a缺陷的小鼠表皮增生减轻(rizzoetal.,2011)；临床数据也显示th17细胞和il-17a在银屑病中的重要病理作用(hueberetal.,2010;wilsonetal.,2007)。基于以上关于il-17a在自身免疫性疾病中的研究成果，通过抑制th17细胞的分化和阻断il-17a信号通路来治疗自身免疫性疾病已成为当前热点。
10.银屑病因顽固难治，被列为当今世界皮肤科领域的重要研究课题，是全世界皮肤科重点防治疾病之一。随着一系列新生物药物的上市，银屑病患者有了更多更好的用药选择。在自身免疫领域中，tnfα拮抗剂和白细胞介素（il）类药物是目前研发的热点，il-12家族和il-17最受关注。截至2018年7月，全球已上市的治疗银屑病的il抑制剂有苏金单抗（secukinumab，cosentyx）、优特克单抗、艾克司单抗、布罗达单抗、古塞库单抗、tildrakizumab；尚处于临床试验阶段的有 risankizumab、bimekizumab、mirikizumab、cjm112、cova322、abt-122、alx-0761、cnto-6785 和 ni-1401等。国内尚没有批准上市的品种，江苏恒瑞医药股份有限公司研发的il-17a抑制剂shr-1314目前正处于临床试验阶段，北京诺华制药有限公司的苏金单抗和礼来苏州制药有限公司的艾克司单抗也处于临床试验阶段。
11.虽然双特性抗体的构型与种类越来越多，但是现有双特异性抗体也存在许多相应的问题。首先构型方面，现有的双特异性抗体许多构型与天然存在的抗体构型差别较大，使得抗体的稳定性差，特异性差，容易产生同源二聚体，没有良好的药代动力学特征，甚至产生免疫原性。因此，提供一种稳定性高，效果好的针对tnfα和il-17a双特异性抗体是本领域亟待解决的技术问题之一。


技术实现要素：

12.本专利的发明目的是提供一种能够分别与il-17a和tnfα 特异性结合的双特异性单域抗体及其用途。
13.本发明的第一个方面提供了针对il-17a和tnfα的双特异性单域抗体，所述双特异性单域抗体包括（a）第一抗原结合部分，用于特异性结合il-17a；以及（b）第二抗原结合部分，用于特异性结合tnfα；第一抗原结合部分和第二抗原结合部分相互融合；所述双特异性单域抗体关于il-17a具有小于2*10-12
m的解离常数(kd)，所述双特异性单域抗体关于tnfα具有小于3*10-10
m的解离常数(kd)，所述解离常数采用bli（生物膜干涉法）测量。
14.在一些优选的实施方案中，所述双特异性单域抗体关于il-17a蛋白具有小于1.9*
10-12
m、1.8*10-12
m、1.7*10-12
m、1.6*10-12
m、1.5*10-12
m、1.4*10-12
m、1.3*10-12
m、1.2*10-12
m、1.1*10-12
m、1.0*10-12
m的解离常数(kd)。
15.在另一些优选的实施方案中，所述双特异性单域抗体关于tnfα蛋白具有小于2.4*10-10
m、2.3*10-10
m、2.2*10-10
m、2.1*10-10
m、2.0*10-10
m、1.9*10-10
m、1.8*10-10
m、1.7*10-10
m、1.6*10-10
m、1.5*10-10
m、1.4*10-10
m、1.3*10-10
m、1.2*10-10
m的解离常数(kd)。
16.在另一个优选的实施方案中，所述双特异性单域抗体关于tnfα蛋白具有(1.2~2.4)*10-10
m的解离常数(kd)。
17.在另一个优选的实施方案中，所述双特异性单域抗体关于il-17a蛋白具有1*10-12
m的解离常数(kd)，关于tnfα蛋白具有1.2*10-10
m的解离常数(kd)。
18.在另一个优选的实施方案中，所述双特异性单域抗体关于il-17a蛋白具有1*10-12
m的解离常数(kd)，关于tnfα蛋白具有2.4*10-10
m的解离常数(kd)。
19.上述的第一抗原结合部分、第二抗原结合部分分别包含3个cdr区(cdr1至cdr3)和4个铰链区(fr1至fr4)组成的氨基酸序列：fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4 (i)；值得说明的是，cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列可容易地彼此组合以符合式(i)。本领域技术人员知道如何毫不费力地确定这些序列可进行组合的程度，以获得具有所需解离常数(kd)的本发明的单域抗体。
20.为了方便区分，写成：第一抗原结合部分的3个cdr区依次为cdr1、cdr2、cdr3；第二抗原结合部分的3个cdr区依次为cdr1、cdr2、cdr3。第一抗原结合部分即针对il-17a的单域抗体。第二抗原结合部分即针对tnfα的单域抗体。
21.优选地，所述双特异性单域抗体包括（a）第一抗原结合部分，用于特异性结合il-17a；以及（b）第二抗原结合部分，用于特异性结合tnfα；第一抗原结合部分和第二抗原结合部分相互融合；第一抗原结合部分为重链，包括cdr1、cdr2和cdr3：cdr1的氨基酸序列如seq id no:9或seq id no:10所示，或者hcdr1的氨基酸序列为seq id no:9或seq id no:10的变体序列，变体序列相对seq id no:9或seq id no:10具有至多5个氨基酸的突变；cdr2的氨基酸序列如seq id no:12或seq id no:13所示，或者hcdr2的氨基酸序列为seq id no:12或seq id no:13的变体序列，变体序列相对seq id no:12或seq id no:13具有至多5个氨基酸的突变；cdr3的氨基酸序列如seq id no:15或seq id no:16所示，或者hcdr3的氨基酸序列为seq id no:15或seq id no:16的变体序列，变体序列相对seq id no:15或seq id no:16具有至多5个氨基酸的突变；第二抗原结合部分为重链，包括cdr1、cdr2和cdr3：cdr1的氨基酸序列如seq id no:11所示，或者cdr1的氨基酸序列为seq id no:11的变体序列，变体序列相对seq id no:11具有至多5个氨基酸的突变；cdr2的氨基酸序列如seq id no:14所示，或者cdr2的氨基酸序列为seq id no:14的变体序列，变体序列相对seq id no:14具有至多5个氨基酸的突变；cdr3的氨基酸序列如seq id no:17所示，或者cdr3的氨基酸序列为seq id no:17的变体序列，变体序列相对seq id no:17具有至多5个氨基酸的突变。
22.在另一个优选的实施方案中，所述的第一抗原结合部分和第二抗原结合部分还分别包括框架区fr；所述框架区fr包括fr1、fr2、fr3和fr4的氨基酸序列；针对第一抗原结合部分，其fr1序列如seq id no:18所示或与seq id no:18所示的氨基酸序列具有至少80%同源性；其fr2序列如seq id no:20或seq id no:21所示或与seq id no:20或seq id no:21所示的氨基酸序列具有至少80%同源性；其fr3序列如seq id no:23或seq id no:24所示或与seq id no:23或seq id no:24所示的氨基酸序列具有至少80%同源性；其fr4序列如seq id no:26所示或与seq id no:26所示的氨基酸序列具有至少80%同源性；针对第二抗原结合部分，其fr1序列如seq id no:19所示或与seq id no:19所示的氨基酸序列具有至少80%同源性；其fr2序列如seq id no:22所示或与seq id no:22所示的氨基酸序列具有至少80%同源性；其fr3序列如seq id no:25所示或与seq id no:25所示的氨基酸序列具有至少80%同源性；其fr4序列如seq id no:27所示或与seq id no:27所示的氨基酸序列具有至少80%同源性。
23.值得说明的是，fr1、fr2、fr3和fr4的氨基酸序列可容易地彼此组合以符合式(i)。本领域技术人员知道如何毫不费力地确定这些序列可进行组合的程度，以获得具有所需解离常数(kd)的本发明的双特异性单域抗体。
24.优选地，所述的第一抗原结合部分和第二抗原结合部分均为人源化的单域抗体。
25.所述的第一抗原结合部分和第二抗原结合部分通过人igg的fc段相互融合，第一抗原结合部分与人igg的fc段的氨基端偶联，第二抗原结合部分与人igg的fc段的羧基端偶联。人igg的fc段可以为人igg1 fc段、人igg4 fc段或者其他人igg的fc段。更优选地，针对il-17a和tnfα的双特异性单域抗体可采用下述的构成方式：1）第一抗原结合部分的cdr1的氨基酸序列如seq id no:9所示，cdr2的氨基酸序列如seq id no:12所示，cdr3的氨基酸序列如seq id no:15所示；第一抗原结合部分的fr1序列如seq id no:18所示，fr2序列如seq id no:20所示，fr3序列如seq id no:23所示，fr4序列如seq id no:26所示；第二抗原结合部分的cdr1的氨基酸序列如seq id no:11所示，cdr2的氨基酸序列如seq id no:14所示，cdr3的氨基酸序列如seq id no:17所示；第二抗原结合部分的fr1序列如seq id no:19所示，fr2序列如seq id no:22所示，fr3序列如seq id no:25所示，fr4序列如seq id no:27所示；第一抗原结合部分与第二抗原结合部分之间通过人igg1的fc段或人igg4的fc段完成连接。
26.2）第一抗原结合部分的cdr1的氨基酸序列如seq id no:10所示，cdr2的氨基酸序列如seq id no:13所示，cdr3的氨基酸序列如seq id no:16所示；第一抗原结合部分的fr1序列如seq id no:18所示，fr2序列如seq id no:21所示，fr3序列如seq id no:24所示，fr4序列如seq id no:26所示；第二抗原结合部分的cdr1的氨基酸序列如seq id no:11所示，cdr2的氨基酸序列如seq id no:14所示，cdr3的氨基酸序列如seq id no:17所示；第二抗原结合部分的fr1序列如seq id no:19所示，fr2序列如seq id no:22所示，fr3序列如seq id no:25所示，fr4序列如seq id no:27所示；
第一抗原结合部分与第二抗原结合部分之间通过人igg1的fc段（即，hfc1）或人igg4的fc段（即，hfc4）完成连接。
27.上述所有序列，可以替换为与该序列具有“至少80%同源性”的序列或仅一个或少数几个氨基酸替换的序列；优选为“至少85%同源性”，更优选为“至少90%同源性”，更优选为“至少95%同源性”，最优选为“至少98%同源性”。
28.本发明的“针对il-17a和tnfα的双特异性单域抗体”，不仅包括完整的双特异性单域抗体，还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”含义相同，均是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(i ii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与fc标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
29.本发明的第三方面是提供针对il-17a和tnfα的双特异性单域抗体的氨基酸序列，所述双特异性单域抗体的氨基酸序列分别如seq id no.1-4所示，或者所述双特异性单域抗体与seq id no.1-4的氨基酸序列具有至少80%序列同源性。
30.在一些实施方案中，所述针对il-17a和tnfα的双特异性单域抗体与选自seq id no：1-4 的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%序列同源性，并且能够特异性结合il-17a及tnfα蛋白。
31.在另一些优选实施例中，所述针对il-17a和tnfα的双特异性单域抗体与选自seq id no：1-4的氨基酸序列具有至少95％序列同源性，并且能够特异性结合il-17a及tnfα蛋白。
32.本发明的第四方面是提供所述针对 il-17a和tnfα的双特异性单域抗体的fc融合抗体或人源化抗体。
33.本发明的第五个方面是提供编码前述的针对il-17a和tnfα的双特异性单域抗体或前述的fc融合抗体或前述的人源化抗体的核苷酸分子，其核苷酸序列分别如seq id no：5-8所示，或者与seq id no：5-8 具有至少80％序列同源性。
34.在一个实施方案中，编码所述针对il-17a和tnfα的双特异性单域抗体的核酸分子与选自seq id no：5-8 的核苷酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%序列同源性，并且其编码的针对il-17a和tnfα单域抗体能够特异性结合il-17a及tnfα蛋白。
35.本发明的第六个方面是提供一种表达载体，其包含编码针对il-17a和tnfα的双特异性单域抗体或其fc融合抗体或人源化抗体的核苷酸分子，其核苷酸序列分别如seq id no：5-8 所示。
36.在一个优选的实施方案中，所使用的表达载体为rjk-v4-3（通过基因工程手段将编码针对il-17a和tnfα的双特异性单域抗体的核苷酸分子整合入rjk-v4-3中），根据需要还可以选择其他的通用型表达载体。
37.本发明的第七个方面是提供一种能够表达前述的il-17a和tnfα的双特异性单域抗体的宿主细胞，或其包含前述的表达载体。优选宿主细胞为细菌细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。
38.另一个优选的实施方案中，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞，包括细菌，真菌。
39.另一个优选的实施方案中，所述的宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞、噬菌体、或其组合。
40.在另一个优选的实施方案中，所述原核细胞选自下组：大肠杆菌、枯草杆菌、乳酸菌、链霉菌、奇异变形菌、或其组合。
41.在另一个优选的实施方案中，所述真核细胞选自下组：巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母、木霉或其组合。
42.在另一个优选的实施方案中，所示真核细胞选自下组：草地粘虫等昆虫细胞、烟草等植物细胞、bhk细胞、cho细胞、cos细胞、骨髓瘤细胞、或其组合。
43.在另一优选例中，所述宿主细胞优选为哺乳动物细胞，更优选hek293细胞、cho细胞、bhk细胞、nso细胞或cos细胞。
44.在另一个优选的实施方案中，所述宿主细胞为悬浮expicho-s细胞。
45.在另一个优选的实施方案中，所述宿主细胞为悬浮293f细胞。
46.本发明的第八个方面是提供一种重组蛋白，包含前述的针对il-17a和tnfα的双特异性单域抗体。
47.本发明的第九个方面是提供一种药物组合物，其包含前述的针对il-17a和tnfα的双特异性单域抗体和药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中ph通常根据抗体的等电点确定（水性载体介质的ph需偏离该抗体的等电点，且与该抗体的等电点相差大约2）。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：静脉内、透皮（在患处直接涂抹或贴敷膏药）。
48.本发明的药物组合物可直接用于结合il-17a/tnfα蛋白分子，因而可用于治疗与il-17a和/或tnfα异常表达相关病症如银屑病。此外，还可同时使用其他治疗剂。本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％，较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的双特异性单域抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。此外，本发明的药物组合物还可与其他治疗剂一起使用。
49.本发明的第十个方面是提供一种用于治疗与tnfα和/或il-17a异常表达相关病症或自身免疫性疾病的药剂，其以前述的il-17a和tnfα双特异性单域抗体作为活性成分。例如，可以为自身免疫性疾病（包括但不限于银屑病、类风湿性关节炎、骨关节炎、炎性肠炎、克朗病）。优选地，tnfα和/或il-17a异常表达相关病症可以为银屑病。
50.本发明的第十一个方面是提供一种检测tnfα和/或il-17a水平的试剂盒，其含有前述的针对 il-17a和tnfα的双特异性单域抗体。在本发明的一个优选的实施方案中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。
51.在一个优选的实施方案中，该试剂盒包括识别il-17a和/或tnfα蛋白的抗体，用于溶解样本的裂解介质，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。
52.在一个优选的实施方案中，所述的试剂盒还含有第二抗体和用于检测的酶或荧光或放射标记物，以及缓冲液。
53.在一个优选的实施方案中，所述试剂盒的第二抗体为前述的双特异性单域抗体的抗体（即作为抗抗体），可以为单域抗体、单克隆抗体、多克隆抗体或抗体的其它任意形式。
54.本发明的第十二个方面，提供了一种产生针对il-17a和tnfα的双特异性抗体的方法，包括步骤：(a)在适合产生双特异性单域抗体的条件下，培养本发明的第七个方面所述的宿主细胞，从而获得含所述il-17a和tnfα的双特异性单域的培养物；以及(b)从所述培养物中分离或回收所述的il-17a和tnfα的双特异性单域抗体；以及(c)任选地，纯化和/或修饰步骤(b)中获得的il-17a和tnfα的双特异性单域抗体。
55.本发明的第十三个方面是提供前述的针对il-17a和tnfα的双特异性单域抗体在制备抑制il-17a或tnfα基因表达的药物或抗银屑病药物中的用途。
56.本发明的第十四个方面是提供前述的针对il-17a和tnfα的双特异性单域抗体在阻断il-17a与il-17r结合作用的药物中的用途。
57.本发明的第十五个方面是提供前述的针对il-17a和tnfα的双特异性单域抗体或前述药物组合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途。
58.在一个优选的实施方案中，所述疾病为与il-17a和/或tnfα异常表达相关的病症。
59.在一个优选的实施方案中，所述疾病为自身免疫性疾病。
60.在一个优选的实施方案中，所述疾病为银屑病或关节炎。
61.相对于现有技术，本发明的有益效果是：（1）本发明的针对il-17a和tnfα双特异性单域抗体，关于il-17a具有小于2*10-12
m的解离常数(kd)，所述双特异性单域抗体关于tnfα具有小于3*10-10
m的解离常数(kd)，代表其较强的亲和力。且该单域抗体能够同时特异性结合具有正确空间结构的il-17a及tnfα蛋白。
62.（2）本发明的针对il-17a和tnfα双特异性单域抗体，能够阻断il-17a与il-17r结合作用的相互作用，且具有高于苏金单抗（阳性药）的阻断活性，因此其在制备治疗自身免疫性疾病的药物，尤其是制备治疗银屑病的药物中具有很大的应用前景。
63.（3）本发明的针对il-17a和tnfα双特异性单域抗体，在稳定性方面具有较大的优势。在加速稳定性实验中以及低ph挑战中，本发明的双特异性单域抗体均体现出优异的稳定性能。
64.（4）本发明的针对il-17a和tnfα双特异性单域抗体不仅具有很好的成药性，且在imq诱导的小鼠银屑样疾病的药效实验中展示出显著效果，其中2g3-hfc1-1b2 （受试品1）和1a10-hfc1-1b2 （受试品2）能够抑制小鼠体重的下降；能够显著减弱小鼠皮肤红疹和脱屑的发生程度；能够明显减轻imq引发的病理变化。
附图说明
65.为了更清楚地说明本技术的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
66.图1为实施例3中靶向il-17a筛选的文库富集情况；图2为实施例3中靶向tnfα筛选的文库富集情况；图3为实施例12中的抗体阻断il-17a与il-17r结合的测定结果示意图；图4为实施例13中抗体样品tab，higg，1a10-hfc1-1b2，2g3-hfc1-1b2诱导hela细胞释放il-6实验结果图谱；图5为实施例13中抗体样品1a10-hfc4-1b2，2g3-hfc4-1b2诱导hela细胞释放il-6实验结果图谱；图6为实施例14中抗体样品1a10-hfc1-1b2，2g3-hfc1-1b2诱导hs27细胞释放cxcl1实验结果图谱；图7为实施例15中抗体样品1a10-hfc1-1b2，2g3-hfc1-1b2，1a10-hfc4-1b2，2g3-hfc4-1b2诱导l929细胞凋亡的实验结果图谱；图8为实施例15中抗体样品tab，higg，诱导l929细胞凋亡的实验结果图谱；图9为实施例21中试验期间小鼠体重变化图谱；图10为实施例21中动物病理检测结果；图11为实施例21中试验期间动物临床评分变化。
具体实施方式
67.下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
68.单域抗体(sdab，也被研发者ablynx称为纳米抗体或vhh)是本领域技术人员公知的。单域抗体为其互补决定区是单域多肽的一部分的抗体。因此，单域抗体包含单个互补决定区（单个cdr1、单个cdr2和单个cdr3）。单域抗体的实例为仅有重链的抗体(该抗体天然不包含轻链)、衍生自常规抗体的单域抗体和工程化抗体。
69.单域抗体可以衍生自任何物种，包括小鼠、人、骆驼、美洲驼、山羊、兔和牛。例如，天然存在的vhh分子可以衍生自骆驼科物种(例如骆驼、单峰骆驼、美洲驼和原驼)提供的抗体。像完整的抗体一样，单域抗体能够选择性地结合特定抗原。单域抗体可以仅含有免疫球蛋白链的可变结构域，该结构域具有cdr1、cdr2和cdr3以及框架区。
70.如本文所用，术语“序列同源性”表示两个(核苷酸或氨基酸)序列在比对中在相同位置处具有相同残基的程度，并且通常表示为百分数。优选地，同源性在被比较的序列的整体长度上确定。因此，具有完全相同序列的两个拷贝具有100％同源性。
71.本发明中，与本发明公开的cdr1-3的序列同源性高的序列，也可以得到针对il-17a和tnfα 的单域抗体。在一些实施例中，与seq id no：1-4中的序列具有“至少80%同源性”的序列，或者“至少85%同源性”、“至少90%同源性”、“至少95%同源性”、“至少98%同源性”的序列都可以实现发明目的。
72.在一些实施例中，与前述序列相比仅仅替换一个或少数几个氨基酸的序列，例如，
17a、tnfα重组胞外结构域蛋白制备过程如下所述。
79.人源il-17a重组胞外结构域蛋白制备过程：（1）在ncbi中检索获得il-17a的编码序列，其收录号为 nm_002190.2，该序列编码产生的氨基酸序列登录号为np_002181.1，uniprot id为q16552。
80.（2）分别通过tmhmm和smart网站对np_002181.1对应的氨基酸序列进行蛋白跨膜区和胞外端的分析。
81.（3）il-17a为分泌型蛋白，1
ꢀ‑ꢀ
23位为该蛋白的信号肽。
82.（4）利用基因合成的方式将编码il-17a蛋白的24-155位氨基酸的核苷酸序列克隆到载体pcdna3.4中；（5）将构建好的载体进行sanger测序，比对原始序列，确认无误后，将该重组质粒进行批量抽提，去除内毒素，转染悬浮293f进行目的蛋白的表达、纯化，纯化后的蛋白纯度高达90%，满足动物免疫的需求。
83.人源tnfα重组胞外结构域蛋白制备过程：（1）在ncbi中检索获得tnfα的编码序列，其收录号为nm_000594.3，该序列编码产生的氨基酸序列登录号为np_000585.2，uniprot id为p01375。
84.（2）分别通过tmhmm和smart网站对np_000585.2对应的氨基酸序列进行蛋白跨膜区和胞外端的分析。
85.（3）tnfα蛋白的胞外端为57
‑ꢀ
233位氨基酸。
86.（4）利用基因合成的方式将编码tnfα蛋白的57
‑ꢀ
233位氨基酸的核苷酸序列克隆到载体pcdna3.4中。
87.（5）将构建好的载体进行sanger测序，比对原始序列，确认无误后，将该重组质粒进行批量抽提，去除内毒素，转染悬浮293f进行目的蛋白的表达、纯化，纯化后的蛋白纯度高达90%，满足动物免疫的需求。
88.实施例2：分别针对il-17a、tnfα蛋白的单域抗体进行文库的构建：将1mg实施例1中纯化获得的人源重组il-17a蛋白，tnfα蛋白分别与等体积的弗氏完全佐剂混合，分别用来免疫内蒙古阿拉善双峰驼，每周免疫一次，共连续免疫7次，除首次免疫外，其余六次均是分别用1mg 上述重组蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混合进行动物免疫，该免疫过程是为了集中刺激骆驼使其产生针对上述重组蛋白的抗体。
89.动物免疫结束后，抽取骆驼外周血淋巴细胞150ml，并提取细胞的rna。利用提取的总rna合成cdna，并通过套式pcr反应以cdna为模板扩增vhh(抗体重链可变区)。
90.然后利用限制性内切酶分别酶切pmecs载体和vhh片段，然后将酶切后的片段和载体连接。将连接后的片段电转化至感受态细胞tg1中，分别构建il-17a及tnfα蛋白的噬菌体展示文库并测定库容，文库的库容大小约为1
×
109，同时，通过菌落pcr鉴定检测文库在目的片段的正确插入率。经计算得，针对构建的il-17a文库，正确插入率为95%。针对构建的tnfα的文库，正确插入率为97%。
91.实施例3：针对il-17a，tnfα蛋白的单域抗体筛选：il-17a蛋白的单域抗体筛选：取200μl实施例2中的il-17a的重组tg1细胞至2
×
ty培养基中培养，期间加入40μl辅助噬菌体vcsm13侵染tg1细胞，并培养过夜以扩增噬菌体，次日利用peg/nacl沉淀噬菌
id no.28所示，未人源化的2g3单域抗体的氨基酸序列如seq id no.29所示；未人源化的1b2单域抗体的氨基酸序列如seq id no.30所示。下文中，将在未人源化的的1a10单域抗体基础上人源化得到的人源化抗体命名为人源化后的抗体1a10。将在未人源化的2g3单域抗体基础上人源化得到的人源化抗体命名为人源化后的抗体2g3。将在未人源化的的1b2单域抗体基础上人源化得到的人源化抗体命名为人源化后的抗体1b2。
101.单域抗体的氨基酸序列为fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4结构，构成整个vhh。
102.实施例5：分别针对il-17a和tnfα的单域抗体的人源化人源化方法采用对基于大数据分析结果而构建的抗体框架区域突变文库进行高通量筛选的方法完成。详细步骤为：（1）人源/驼源抗体数据的序列分析：对从ncbi网站批量下载的13873例nb（human）序列进行氨基酸偏好性分析，同时对本公司2000例单域抗体序列进行氨基酸偏好性分析，得到框架区各个位点氨基端比例数据；（2）人源驼源综合加权分析：将上述源/驼源抗体序列统一按照imgt编号规则进行编号并一一对应，结合上述两个物种中氨基酸比例分析结果，按照人源90%驼源10%的权重进行加权分析，统计出各个位点氨基酸加权后的比例，并由高到低排序；根据最终的加权结果，框架区单个位点仅保留所占比例 》10% 的氨基酸种类，并根据保留后比例综合为1的标准进行所占比例 》10% 氨基酸最终权重的计算，作为后续胺基酸定制文库的设计依据；（3）氨基酸定制文库的方案设计：对待进行突变的单独位点，规定其 》10% 的氨基酸数目为n, 规定其 》10% 中所占比例最高值与最低值的比值为v，对待进行突变的位点进行性质判断：若v≥3且n≤2 则认为该位点属于“高集中度位点”，否则认为该位点属于“中低集中度位点”。依据此方法将定制氨基酸文库分为“高/中低集中度文库”两个分别进行氨基酸定制文库的构建，上述（2）中的最终权重即为文库中位点氨基酸种类及比例的参考依据。
103.（4）氨基酸定制文库的高通量筛选：对抗体株，未人源化的1a10、2g3、1b2分别构建人源化抗体文库，针对构建好的文库，分别用对应抗原进行淘选，并最终获得亲和力较高且人源化程度较高的抗体序列，得到的人源化抗体的cdr序列如表1所示。人源化抗体序列fr1-fr4序列如表2所示，人源化抗体的氨基酸序列如表3所示。
104.表1 人源化抗体cdr1-cdr3序列表2 人源化抗体序列fr1-fr4序列
表31a10、2g3、1b2人源化抗体的各部分序列组成表4seqidno.1-4序列
表4中的 seq id no.1中由三个部分依次构成：即人源化1a10部分-hfc1部分-人源化1b2部分，其中各部分序列具体构成如下：人源化1a10部分：qvqlvesggglvkpggslrlscaaseyafrlnrmgwvrqapgkeregvaaigtrggstyyadsvkgrftisrdnakntlylqmnslraedtavyycaaglggdtrtpiydisywgqgtlvtvss（人源化1a10部分：位于seq id no.1序列的1-124）hfc1部分：epkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvlhealhshytqeslslspgkepkscdkthtcppcp（hfc1部分：位于seq id no.1序列的125-371）人源化1b2部分：qvqlvesgggsvqaggslrlscaasgytyysdacmawfrqapgkeregvavidrdhitqhadsvkgrftiskdnakntltlqmnslepedtamyycaaghppsprfgcglgyqyynywgqgtqvtvss(人源化1b2部分：位于seq id no.1序列的372-499)表4中的 seq id no.2序列由三个部分依次构成：即人源化2g3部分-hfc1部分-人源化1b2部分，其中各部分序列具体构成如下：人源化2g3部分：qvqlvesggglvkpggslrlscaasgytyssycmgwfrqapgkgregvatidnrgstsyadsvkgrftisrdnakntlylqmnslrpedtavyycatggggycsarlgeadfefwgqgtlvtvss（人源化2g3部分：位于seq id no.2序列的1-125）hfc1部分位于seq id no.2序列的126-372，人源化1b2部分位于seq id no.2序列
的373-500。
105.表4中的seq id no.3序列由三个部分依次构成：即人源化1a10部分（该序列1-124位）-hfc4部分（该序列125-364位）-人源化1b2部分（365-492位），与seq id no.1相比，不同之处在于将hfc1序列部分替换成了hfc4序列，hfc4序列如下：eskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvlhealhshytqeslslslgeskygppcppcp；表4中的seq id no.4序列由三个部分依次构成：即人源化2g3部分（该序列1-125位）-hfc4部分（该序列126-365位）-人源化1b2部分（366-493）。
106.实施例6：针对il-17a和tnfα蛋白的双特异性单域抗体的fc融合抗体真核表达载体的构建（1）通过序列合成的方式将实施例5所得的抗il-17a或抗tnfα的人源化单域抗体的核苷酸序列合成至本公司设计改造的含有人igg片段的载体中，再经过一系列下述步骤最终表达出不同类型组合的人源化双特异性抗体，本实施例中的载体类型有两种：载体1（hfc4载体）及载体2（hfc1载体），该载体1和载体2的改造方法如实施例10所述；（2）将公司构建好的重组真核表达载体转化至dh5α大肠杆菌中，培养进行质粒抽提，去除内毒素；（3）将抽提后的质粒再进行序列测序鉴定；（4）鉴定无误后，再将抗il-17a单域抗体序列亚克隆至含抗tnfα的单域抗体序列的真核表达载体中：具体操作是使用限制性内切酶xbaⅰ和bamhⅰ将抗il-17a单域抗体序列从其所在的真核表达载体上酶切下来并与具有相同限制性内切酶粘性末端的含抗tnfα的单域抗体序列的真核表达载体连接、转化、测序鉴定；测序正确的克隆进行质粒抽提，去除内毒素；将抽提后的质粒再进行序列测序鉴定；将确定无误后的重组载体准备后续真核细胞转染表达。
107.后续真核细胞转染表达中，得到的抗体包括四种，依次编号：1a10-hfc1-1b2，2g3-hfc1-1b2，1a10-hfc4-1b2，2g3-hfc4-1b2。
108.1a10-hfc1-1b2编号含义是人源化后的抗体1a10与hfc1的氨基端连接，人源化后的抗体1b2与hfc1的羧基端连接；2g3-hfc1-1b2的含义是：人源化后的抗体2g3与hfc1的氨基端连接，人源化后的抗体1b2与hfc1的羧基端连接；1a10-hfc4-1b2的含义是：人源化后的抗体1a10与hfc4的氨基端连接，人源化后的抗体1b2与hfc4的羧基端连接；2g3-hfc4-1b2的含义是：人源化后的抗体2g3与hfc4的氨基端连接，人源化后的抗体1b2与hfc4的羧基端连接。hfc1的氨基酸序列如seq id no.1中的第125-371位氨基酸所示或seq id no.2中的第126-372位氨基酸所示；hfc4的氨基酸序列如seq id no.3中的第125-364位氨基酸所示或seq id no.4中的第126-365位氨基酸所示。
109.1a10-hfc1-1b2全称为1a10-v14 ft-hfc1-1b2-vf；2g3-hfc1-1b2全称为2g3-v34 r-hfc1
‑ꢀ
1b2-vf；1a10-hfc4-1b2全称为1a10-v14 ft-hfc4
‑ꢀ
1b2-vf；2g3-hfc4-1b2全称为2g3-v34 r-hfc4
ꢀ‑
1b2-vf。
110.实施例7：针对il-17a和tnfα蛋白的双特异性单域抗体在悬浮expicho-s细胞中表
达（1）转染前3天以2.5
×
105/ml细胞传代和扩大培养expicho-s
™
细胞，计算出的所需的细胞体积转移至装有新鲜的已预热的120ml（终体积）的expicho
™
表达培养基的500ml摇瓶中；使细胞浓度达到约4
×
106ꢀ‑6×
106活细胞/ml；（2）在转染前一天，将expicho-s
™
细胞稀释浓度至3.5
×
106活细胞/ml，使细胞过夜培养；（3）转染当天，测定细胞密度和活细胞百分比。转染之前细胞密度应达到约7
×
10
6 ‑
10
×
106活细胞/ml；（4）用预热至37℃新鲜的expicho
™
表达培养基将细胞稀释至6
×
106个活细胞/ ml。计算出的所需的细胞体积转移至装有新鲜的已预热的100ml（终体积）的expicho
™
表达培养基的500ml摇瓶中；（5）使轻轻颠倒混匀expifectamine
™
cho试剂，用3.7ml optipro
™
培养基稀释expifectamine
™
cho试剂，回荡或混匀；（6）用冷藏的4ml optipro
™
培养基稀释质粒dna，回荡混匀；（7）将expifectamine cho/质粒dna（质粒dna为实施例6的步骤（4）制得的针对il-17a和tnfα蛋白的双特异性单域抗体的fc融合抗体真核表达载体）复合物室温孵育1-5分钟，然后轻轻加入制备的细胞悬液中，加入过程中轻轻回荡摇瓶；（8）将细胞在37
°
c、 8％co2、加湿的空气中震荡培养；（9）转染后第1天（18-22小时后）添加600ul expifectamine
™
cho enhancer和24ml expicho feed。
111.（10）在转染后约8天（细胞活率低于70%）收集上清。
112.实施例8：针对il-17a和tnfα蛋白的双特异性单域抗体在悬浮293f细胞中的表达重组单域抗体表达实验流程(以500ml摇瓶为例)：（1）转染前3天以2.5
×
105/ml细胞传代和扩大培养293f细胞，计算出的所需的细胞体积转移至装有新鲜的已预热的120ml（终体积）的opm-293 cd05 medium培养基的500ml摇瓶中。使细胞浓度达到约2
×
10
6-3
×
106活细胞/ ml。
113.（2）转染当天，测定细胞密度和活细胞百分比。转染之前细胞密度应达到约2
×
10
6-3
×
106活细胞/ ml。
114.（3）用预热的opm-293 cd05 medium将细胞稀释至1
×
106个活细胞/ ml。计算出所需的细胞体积转移至装有新鲜的已预热的100ml（终体积）的培养基的500ml摇瓶中。
115.（4）用4ml opti-mem培养基稀释pei（1mg/ml）试剂，回荡或吹打混匀；用4ml opt-mem培养基稀释质粒dna（质粒dna为实施例6的步骤（4）制得的针对il-17a和tnfα蛋白的双特异性单域抗体的fc融合抗体真核表达载体），回荡混匀，并用0.22um的滤头过滤。室温孵育5min。
116.（5）将稀释的pei试剂加入稀释的dna中，颠倒混匀。将pei/质粒dna复合物室温孵育15-20分钟，然后轻轻加入制备的细胞悬液中，加入过程中轻轻回荡摇瓶。
117.（6）将细胞在37
°
c、 5％co2、120rpm震荡培养。
118.（7）转染后第24h、72h添加5ml opm-cho pff05补料。
119.（8）在转染后约7天（细胞活率低于70%）收集上清。
120.实施例9：针对il-17a和tnfα蛋白的双特异性单域抗体的纯化（1）将实施例7或8中获得蛋白表达上清用0.45μm的一次性滤头过滤除掉不可溶杂质；（2）将上述滤液使用蛋白纯化仪进行亲和层析纯化，利用人源fc与protein a结合的能力，使用偶联protein a的琼脂糖填料进行纯化；（3）将滤液通过1ml/分钟的流速流穿protein a预装柱，该步骤中滤液中的目标蛋白会与填料结合；（4）通过低盐和高盐缓冲液将柱上结合的杂质蛋白洗涤；（5）用低ph缓冲液将柱上结合的目标蛋白进行洗脱；（6）将洗脱液迅速加入ph9.0的tris-hcl溶液，进行中和；（7）将上述中和后的蛋白溶液透析后，进行sds-page分析，确定蛋白纯度在95%以上，且浓度在0.5mg/ml以上后，低温保存备用。
121.实施例10：抗il-17a/tnfα蛋白的双特异性单域抗体真核表达载体的构建前述实施例中所提及单域抗体通用的目标载体包括两种，载体1和载体2。
122.载体1为本公司在invitrogen商业化载体pcdna3.4（载体资料链接：https://assets.thermofisher.com/tfs-assets/lsg/manuals/pcdna3_4_topo_ta_cloning_kit_man.pdf）的基础上融合了人源igg4的重链编码序列中的fc区段（即hfc4）后改造而来的，即该载体包含了igg4重链的铰链区（hinge）ch2和ch3区。载体2为本公司在invitrogen商业化载体pcdna3.4（载体资料链接：https://assets.thermofisher.com/tfs-assets/lsg/manuals/pcdna3_4_topo_ta_cloning_kit_man.pdf）的基础上融合了人源igg1的重链编码序列中的fc区段（即hfc1）后改造而来的，即该载体包含了igg1重链的铰链区（hinge）ch2和ch3区。
123.载体1具体改造方案如下：（1）选取pcdna3.4上的限制性酶切位点xbai和agei；（2）在fc片段编码序列的5’端和3’端通过重叠pcr的方式分别引入多克隆位点（mcs，multiple cloning site）和6
×
his标签；（3）使用分别带有xbai和agei酶切位点的一对引物通过pcr的方式将上述fc片段（hfc4）扩增；（4）使用限制性内切酶xbai和agei分别酶切pcdna3.4和步骤（3）中的重组dna片段；（5）将酶切后的载体和插入片段在t4连接酶的作用下连接，然后将连接产物转化至大肠杆菌，扩增，测序核实，获得重组质粒1。
124.载体2具体改造方案如下：（1）选取pcdna3.4上的限制性酶切位点xbai和agei；（2）在fc片段编码序列的5’端和3’端通过重叠pcr的方式分别引入多克隆位点（mcs，multiple cloning site）和6
×
his标签；（3）使用分别带有xbai和agei酶切位点的一对引物通过pcr的方式将上述fc片段（hfc1）扩增；（4）使用限制性内切酶xbai和agei分别酶切pcdna3.4和步骤（3）中的重组dna片
段；（5）将酶切后的载体和插入片段在t4连接酶的作用下连接，然后将连接产物转化至大肠杆菌，扩增，测序核实，获得重组质粒2。
125.实施例11：靶向人源il-17a的工具抗体（tool antibody, tab）和靶向人源tnfα蛋白（tool antibody, tab）的工具抗体的表达和纯化il-17a的工具抗体tab（secukinumab）为苏金单抗，序列来自imgt。tnfα的工具抗体tab为adalimumab(humira)，即阿达木单抗，序列来自imgt。
126.将搜索到的上述序列分别委托通用生物系统（安徽）有限公司进行哺乳动物细胞表达系统密码子优化，并克隆至pcdna3.1载体。经过抗性筛选，选择质粒阳性菌扩增，使用质粒中提试剂盒（macherey nagel, cat#740412.50）抽提质粒。按照每100ml细胞加入100μg质粒（40μg重链 60μg轻链），使用pei在293f细胞（培养基：freestyle 293 expression medium, thermo, cat#12338026 f-68, thermo, cat#24040032）中瞬转表达；转染6~24h后加入5%体积的10% peptone（sigma,cat#p0521-100g），8% co
2 130rpm培养约7~8天；细胞活率降至50%时收取表达上清，使用proteina（ge，cat#17-5438-02）重力柱纯化；pbs透析后，使用nanodrop测定浓度，sec鉴定纯度，间接elisa验证结合能力；通过本方法获得的il-17a的工具抗体和tnfα的工具抗体，浓度不小于2 mg/ml，纯度大于95%。
127.实施例12：针对il-17a和tnfα蛋白的双特异性单域抗体阻断il-17a与il-17r结合的测定（1）包被50μl 1μg/ml il-17ra & il-17rc（acro,cat#ilc-h5257,lot#g173a-2085f1-te），4℃过夜。
128.（2）洗板；加入200μl5%牛奶，37℃封闭2h。
129.（3）将biotin-il-17a（acro,cat#ila-h82q1,lot#cbv296p1-97rf1-qj)）与梯度稀释的vhh-hfc混合得到混合液(biotin-il-17a在混合液中的浓度为3.8ng/ml)。这里的vhh-hfc指实施例8制得的双特异性单域抗体（在293f细胞中表达，融合了fc）经实施例9纯化而得。此外，还设置higg；其中higg指同型对照，不与任何靶标结合的免疫球蛋白分子，通过商品化购买得到；（4）洗板；加入50μl上述混合物，两复孔，37℃孵育1h。
130.（5）洗板；加入50μl streptavidin-hrp，37℃孵育30min。
131.（6）洗板（多洗几次）；加入50μl预先恢复常温的tmb，避光常温反应15min。
132.（7）加入50μl终止液（1n hcl），酶标仪读数保存。
133.（8）绘制曲线，计算ec50，结果如图3所示。图3中横坐标表示梯度稀释的vhh-hfc的具体浓度。其中1a10-hfc1-1b2、2g3-hfc1-1b2、1a10-hfc4-1b2、2g3-hfc4-1b2依次对应seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4。
134.实施例13：针对il-17a和tnfα蛋白的双特异性单域抗体中和人源il-17a诱导hela细胞释放il-6实验。本实施例按照本领域的常规方法操作，具体步骤如下：（1）将复苏后传代3次及以上的hela细胞按10000个，50μl每孔铺入96孔板；（2）将梯度稀释的抗体与4*55ng/ml human il-17a等体积混合，将此混合物按每孔50μl加入细胞培养孔；这里的抗体为实施例8制得的双特异性单域抗体（在293f细胞中表
达）经实施例9纯化而得；此外，还分别设置higg、tab对照；这里的tab由实施例11制得，为靶向il-17a的工具抗体；（3）细胞培养箱37℃孵育24h后，用human il-6 elisa 试剂盒检测上清中il-6浓度；（4）根据检测结果计算抗体中和il-17a诱导hela细胞释放il-6的ec50, 结果如图4，图5所示。
135.其中横坐标表示前述的梯度稀释的抗体的具体浓度；从图4-5可知，针对il-17a和tnfα蛋白的双特异性单域抗体能有效中和il-17a并诱导hela细胞释放il-6。
136.实施例14：针对抗il-17a和tnfα的双特异性单域抗体中和人源il-17a诱导hs27细胞释放cxcl1实验，本实施例按照本领域的常规方法操作，具体步骤如下：（1）将复苏后传代3次及以上的hs27细胞按10000个，50μl每孔铺入96孔板；（2）将梯度稀释的抗体与4*47.7 ng/ml human il-17a等体积混合，将此混合物按每孔50μl加入细胞培养孔；这里的抗体为实施例8制得的双特异性单域抗体（在293f细胞中表达）经实施例9纯化而得；此外，还分别设置higg、tab对照；这里的tab由实施例11制得，为靶向il-17a的工具抗体；（3）细胞培养箱37℃孵育17h后，用human cxcl1 htrf试剂盒检测上清中cxcl1浓度；（4）根据检测结果计算抗体中和il-17a诱导hs27细胞释放cxcl1的ec50，结果如图6所示。
137.其中横坐标表示前述的梯度稀释的抗体的具体浓度；纵坐标表示上清中cxcl1浓度（单位pg/ml）；从图6可知，针对抗il-17a和tnfα的双特异性单域抗体能有效中和人源il-17a并诱导hs27细胞释放cxcl1。
138.实施例15：针对il-17a和tnfα的双特异性单域抗体中和人源tnfα诱导l929细胞凋亡实验，本实施例按照本领域的常规方法操作，具体步骤如下：（1）将复苏后传代3次及以上的l929细胞按10000个每孔铺入96孔板；（2）将梯度稀释的抗体与4*11.82 ng/ml的tnfα溶液等体积混合后，加入细胞孔；这里的抗体为实施例8制得的双特异性单域抗体（在293f细胞中表达）经实施例9纯化而得；此外，还分别设置higg、tab对照；tab由实施例11制得，为靶向tnfα的工具抗体；（3）细胞培养箱37℃孵育24h后，用cell titer glo检测细胞活力，读取luminescence值；（4）根据检测结果计算抗体中和tnfα诱导l929细胞凋亡的ec50浓度，结果如图7，图8所示。
139.其中横坐标表示前述的梯度稀释的抗体的具体浓度；从图7，8可知，针对抗il-17a和tnfα的双特异性单域抗体能有效诱导l929细胞凋亡。
140.实施例16：抗il-17a/tnfα的双特异性单域抗体的亲和动力学检测，检测步骤如下：（1） sd缓冲液配制：取适量吐温20以1
×
pbs(ph7.4)溶解，使得吐温20质量为0.02%。
141.（2）抗体工作液配制：抗体（实施例8制得的双特异性单域抗体（在293f细胞中表
达，融合了fc）经实施例9纯化而得）以sd缓冲液配制成10 μg/ml。
142.（3）抗原工作液配制：抗原（人源tnfα或il-17a）先以sd缓冲液配制成200 nm，再按2倍梯度稀释，共设置5个浓度梯度，除此之外再设置一个零浓度。
143.（4）甘氨酸储备液（0.1 m，ph2.0）配制：取7.5 g甘氨酸固体，适量去离子水溶解后，盐酸调节ph至2.0，再用去离子水定容到100 ml。
144.（5）甘氨酸工作液（0.01 m，ph2.0）配制：取适量甘氨酸储备液，用去离子水稀释10倍，混匀。
145.（6）系统：开启octet 96及其配套电脑中data acquisiton软件，用擦镜纸取适量75%的乙醇清洁采集探头的底面和侧面，仪器预热15 min以上。
146.（7）sensor预湿：sensor在实验开始前置于sd缓冲液中浸泡10分钟以上，待用。
147.（8）待测样品排布：在96孔黑板中按下表排布，200 μl/孔，可根据实际情况调整。
148.（9）分析程序：如下表5，可根据具体实验情况调整时间。
149.表5 分析程序（10）分析结束，关闭仪器和电脑。
150.（11）数据分析：data analysis软件中计算kd，kon，koff，x2，full r2等相关常数。结果如表6和表7所示。
151.表6 双特异性抗体关于抗il-17a的亲和力数据表7 双特异性抗体关于抗tnfa的亲和力数据实施例17：针对il-17a和tnfa蛋白的双特异性单域抗体的热稳定性测定（dsf）tm值的测定：用1
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pbs稀释样品浓度至0.2mg/ml，加入sypro orange染料至稀释后的样品中，染料终浓度为5
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，上机检测，仪器型号：q3，品牌：thermo scientific，结果如表8所示。
152.表8热稳定性测试结果实施例18：抗il-17a/tnfa蛋白的双特异性单域抗体纯化工艺方法的开发针对抗体，需开发适用其的纯化工艺方法，从而提高抗体产品的纯度，达到后续实验要求。具体步骤见下表9-10，纯化结果如表11所示。对真核表达的il-17a和tnfα蛋白的双特异性单域抗体先后进行亲和层析和离子交换层析。
153.表9 亲和层析表10离子交换层析表11 两步层析后样品经过sec纯度分析结果
实施例19：针对il-17a和tnfa蛋白的双特异性单域抗体初步表征分析初步表征检测结果及分子量结果分别如表12、表13所示。其中，a样品为1a10-hfc1-1b2，b样品为2g3-hfc1-1b2。
154.表12 初步表征检测结果表13 完整分子量实施例20：抗il-17a和tnfa蛋白的双特异性单域抗体稳定性实验加速稳定性将浓度为10mg/ml的按照实施例18得到的层析纯化完成的样品按照下表的实验方案以及对应的时间点进行对应检项的检测。加速稳定性样品处理条件及检测项目如表14所示。
155.表14加速稳定性条件及检测项目
40℃加速稳定性实验方法：候选分子将避光置于40℃恒温恒湿箱中，静置0、7、14天后取样待检；缓冲体系：成药性平台处方；判断标准：在高温条件下的理化性质变化是否在可接受范围内：icief主峰变化小于15%；sec主峰变化小于10%，ce主峰变化小于5%；40℃加速稳定性实验结果如表15所示。
156.表1540℃加速稳定性实验结果25℃加速稳定性
实验方法：候选分子将避光置于25℃恒温恒湿箱中，静置0、7、14天后取样待检；缓冲体系：成药性平台处方a；判断标准：在高温条件下的理化性质变化是否在可接受范围内：icief主峰变化小于15%；sec主峰变化小于10%，ce主峰变化小于5%；25℃加速稳定性实验结果如表16所示。
157.表1625℃加速稳定性实验结果氧化加速稳定性实验方法：候选分子将避光置于含有0.1%tbhp的缓冲液中，25℃静置3天，7天后取样待检；缓冲体系：成药性平台处方；判断标准：在氧化条件下的理化性质变化是否在可接受范围内：icief主峰变化小于15%；sec主峰变化小于10%；ce主峰变化小于5%；氧化加速稳定性实验结果如表17所示。
158.表17氧化加速稳定性实验结果冻融稳定性实验方法：候选分子保存在-80℃冰箱中冷冻24小时，25℃解冻后混匀再次冷冻，重复2次和4次；
缓冲体系：成药性平台处方a；判断标准：在冻融条件下的理化性质变化是否在可接受范围内：sec主峰变化小于10%； ce主峰变化小于5%；冻融稳定性实验结果如表18所示。
159.表18 冻融稳定性实验结果低ph挑战实验方法：候选分子将避光置于ph 3.0的缓冲液中，室温静置2、4小时后取样待检；缓冲体系：100 mm醋酸缓冲液，ph 3.0；判断标准：在低ph条件下的理化性质变化是否在可接受范围内： sec主峰变化小于10%；ce主峰变化小于5%；低ph挑战实验结果如表19所示。
[0160] 表19 低ph挑战实验结果实施例21：抗体在人源化小鼠体内初步药效的检测利用人源化小鼠建立银屑病模型，用于测试受试品1和受试品2药物药效作用。18只小鼠按照体重随机分为3组，每组6只小鼠，分别标记为g1~g3。从day0开始，各组小鼠于背部裸露皮肤处均匀涂抹imq乳膏，每天1次，连续5天，构建银屑病样小鼠模型。g1~g3组小鼠分别皮下注射给予igg isotype、2g3-hfc1-1b2（受试品1）和1a10-hfc1-1b2（受试品2）。整个体内实验过程中，每日对小鼠造模区域皮肤的红疹和脱屑情况进行评分。体内实验结束，
采集小鼠背部皮肤组织进行病理检测。
[0161]
图9为实验期间小鼠体重变化图谱，图10为动物病理检测结果；图11为试验期间动物临床评分变化。其中，临床评分参照临床评分标准pasi。
[0162]
图9中，a示出了实验期间g1~g3组小鼠的具体体重，b示出了实验期间g1~g3组小鼠的体重百分比，c示出了d0时各组小鼠的体重柱状图，d示出了d5时各组小鼠的体重柱状图，e示出了实验期间各组小鼠体重变化；图10中，a示出了实验期间小鼠的病理评分，b示出了小鼠背部皮肤组织的表皮厚度；图11中，a示出了对小鼠造模区域皮肤的红疹的评分，b示出了小鼠造模区域皮肤的脱屑情况的评分，c示出了小鼠造模区域皮肤的临床总评分；结果如下：实验期间各组小鼠的体重都呈现出先下降后上升的趋势，给予2g3-hfc1-1b2（受试品1）和1a10-hfc1-1b2（受试品2）干预的小鼠体重恢复速度显著快于阴性对照小鼠。与g1组小鼠相比，g2、g3组小鼠红疹发生程度、脱屑程度也明显减轻（p《0.01），临床总评分相降低也具有显著差异（p《0.001）。同样，相比于g1组小鼠的银屑病相关病理变化程度，g2、g3组的病变明显减弱。
[0163]
在本次imq诱导的小鼠银屑样疾病的药效实验中，2g3-hfc1-1b2（受试品1）和1a10-hfc1-1b2（受试品2）能够抑制小鼠体重的下降；能够显著减弱小鼠皮肤红疹和脱屑的发生程度；能够明显减轻imq引发的病理变化。
[0164]
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。