类鼻疽菌表达质粒、荧光标记表达质粒及其构建方法和应用

1.本发明属于细菌基因工程技术领域，特别涉及三种用于类鼻疽伯克霍尔德菌活体荧光示踪的表达载体、试剂、制备方法及其应用。


背景技术：

2.类鼻疽伯克霍尔德菌(burkholderia pseudomallei,b.pseudomallei)简称类鼻疽菌，是一种能引起人畜共患类鼻疽病的革兰氏阴性短杆菌，鉴于类鼻疽菌具有对公共卫生安全的潜在威胁，加强该菌诊防治的研究具有重要的意义，而这有赖于阐明其感染与致病的分子机制。开发一种方便、简易的活菌标记工具，有助于在细胞、组织或动物模型中动态观察该菌的感染与致病过程，是研究类鼻疽菌感染与致病分子机制的重要工具。
3.目前已建立了一些常规的标记方法，比如dapi等相关有机荧光染料直接染色、类鼻疽菌特异性抗体免疫荧光染色等传统手段。而有机染料需进入活细胞中与dna结合，不可避免地对生物体本身有毒害作用，影响被标记对象正常的生理活动，而且在使用过程中可能造成环境污染、以及对实验人员可能造成伤害。对于免疫荧光染色则需要预先获得类鼻疽菌的抗体，而抗体的制备过程耗费时间长、成本高，制备的抗体还需要考虑能否区分开同种属的其他细菌，如泰国伯克霍尔德菌、洋葱伯克霍尔德菌，而且该类方法需要固定细胞不能达到实时观测的目的。此外，现有的标记技术主要依赖荧光染料，而荧光染料还存在荧光信号易淬灭的问题，众多问题造成现有的类鼻疽菌示踪技术不便用于动态实时观察其与宿主互作。而荧光蛋白标记系统作为一种区别于荧光染料法的分子标记技术，通过在类鼻疽菌中表达荧光蛋白而不影响细菌正常活性，从而进行活体标记，可达到直观、动态观测病原菌与宿主相互作用的目的，而且具备操作简单，经济等优点。目前该方法尚未运用在类鼻疽菌的研究当中。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于：针对现有研究技术的以上缺陷或改进需求，提供三种不同荧光标记类鼻疽菌的示踪载体、制备方法及应用，其目的在于满足在感染模型中对类鼻疽菌直接实时观察的需求。
5.本发明提供的技术方案如下：
6.为实现上述目的，本发明的一个方面，首先提供了一种类鼻疽菌表达质粒，其以pucp28t为骨架质粒，通过将类鼻疽菌16s核糖体rna内源性启动子 (16s-promoter)将所述骨架质粒的乳糖操纵子替换制备得到。
7.在根据本发明的一个实施方案中，所述类鼻疽菌表达质粒的核苷酸序列为 seq id no:1。
8.本发明的另一方面提供了一种用于类鼻疽菌的荧光标记表达质粒，通过将荧光蛋白的编码基因插入到上述的类鼻疽菌表达质粒的16s-promoter的阅读框中制备得到；所述荧光蛋白选自gfp、cfp、bfp、rfp、egfp、ecfp、ebfp、 yfp、mhoneydew、mbanana、morange、
tdtomato、mtangerine、mstrawberry、 mcherry、mgrape1、mraspberry、mgrape2和mplum中的任一种；优选地，所述荧光蛋白选自gfp、bfp和rfp中的一种。
9.在根据本发明的一个实施方案中，所述16s-promoter的核苷酸序列为seqid no:18。
10.在根据本发明的一个实施方案中，所述16s-promoter是通过以核苷酸序列为seq id no:7、seq id no:8的引物对从含有所述类鼻疽菌16s核糖体rna 内源性启动子的基因载体上扩增获得的；优选地，所述基因载体为类鼻疽菌 bpc006基因组dna。
11.在根据本发明的一个实施方案中，所述bfp的核苷酸序列为seq id no:2、 gfp的核苷酸序列为seq id no:3、rfp的核苷酸序列为seq id no:4。
12.在根据本发明的一个实施方案中，类鼻疽菌的荧光标记表达质粒，核苷酸序列为seq id no:15、seq id no:16或seq id no:17。
13.本发明的再一方面提供了上述的荧光标记表达质粒的制备方法，包括：
14.1)以荧光蛋白编码基因载体为模板扩增获得荧光蛋白的编码基因；优选地，所述荧光蛋白选自gfp、cfp、bfp、rfp、egfp、ecfp、ebfp、yfp、mhoneydew、 mbanana、morange、tdtomato、mtangerine、mstrawberry、mcherry、mgrape1、 mraspberry、mgrape2和mplum中的任一种；优选地，所述荧光蛋白选自gfp、 bfp和rfp中的一种；
15.2)将所述荧光蛋白编码基因插入到上述的类鼻菌表达质粒的16s-promoter 阅读框中，即得。
16.所述表达质粒是在pucp28t基础上，将乳糖操纵子序列替换为类鼻疽菌16s 核糖体rna内源性启动子16s-promoter序列；其表达区域为5’端加有xbai酶切位点，3’端加有hindiii酶切位点的荧光蛋白基因序列；所述荧光蛋白基因序列处于类鼻疽菌16s核糖体rna内源性启动子16s-promoter的阅读框中。
17.在根据本发明的实施方案中，所述的类鼻疽菌表达质粒pucp28tl和三个荧光蛋白基因的核苷酸序列分别为seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、 seq id no:4。
18.在根据本发明的实施方案中，所述pucp28t质粒扩增片段上下游引物的核苷酸序列分别为seq id no:5、seq id no:6；16s-promoter启动子上下游引物的核苷酸序列分别为seq id no:7、seq id no:8；gfp上下游引物的核苷酸序列分别为seq id no:9、seq id no:10；rfp上下游引物的核苷酸序列为别为 seq id no:11、seq id no:12；bfp上下游引物的核苷酸序列为别为seq idno:13、seq id no:14。
19.在根据本发明的一个实施方案中，所述pucp28tl-gfp质粒的核苷酸序列为seq id no:15，pucp28tl-bfp质粒的核苷酸序列为seq id no:16，质粒 pucp28tl-rfp的核苷酸序列为seq id no:17，其抗性筛选基因为甲氧苄啶抗性基因；表达区分别单独包含一种荧光蛋白；优选地，用限制性核酸内切酶对该质粒表达区进行切割，可替换表达其他目的蛋白；更优选地，用限制性核酸内切酶对该质粒启动子区进行切割，可替换其他原核启动子。
20.在根据本发明的一个实施方案中，所述荧光蛋白选自由seq id no:9和seqid no:10构成的bfp编码基因引物对、由seq id no:11和seq id no:12构成的gfp编码基因引物对以及由seq id no:13和seq id no:14构成的rfp 编码基因引物对中的任一引物对扩增得到的；优选地，通过利用限制性内切酶对所述类鼻疽菌表达质粒和荧光蛋白编码基因分别进行酶切，然后将酶切产物进行连接，将所述荧光蛋白编码基因插入到所述类鼻菌表
达质粒中。
21.本发明进一步提供了一种荧光标记的类鼻疽菌，其包含上述的荧光标记表达质粒。
22.本发明的在一方面还提供了类鼻疽菌电转感受态的制备与电转化方法。
23.本发明还进一步提供了重组质粒荧光表达稳定性的检测。
24.本发明更进一步提供了上述重组质粒在类鼻疽菌与自噬标记分子的免疫荧光检测及动态观察中的应用。
25.本发明的有益效果是：
26.本发明提供的红/绿/蓝三种荧光标记表达质粒，能够安全、稳定地标记类鼻疽菌。按照实施例3获得类鼻疽菌电转感受态后，再根据实施例4将实验所需荧光标记表达质粒电转化到类鼻疽菌中，在甲氧苄啶lb平板上即可得到所需荧光标记的类鼻疽菌，简化了类鼻疽菌传统的双亲本杂交或三亲本杂交转化的方法。同时该质粒也可尝试性用于标记大肠杆菌在内的其他细菌。本发明提供了一组活体荧光标记类鼻疽菌的工具，可以系统、准确地观察活的类鼻疽菌在在感染宿主后行为状态的变化，以及与宿主的互作等，不影响细菌的增殖和活毒力，为类鼻疽菌在生物体内的分布、定殖和存活情况以及其致病机制的研究提供了必要的实用工具，因此具有良好的应用前景和发展空间。
附图说明
27.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
28.图1为本发明实施例1中类鼻疽菌内源性启动子16s-promoter的扩增结果；其中，m为dl-5000marker；1为pucp28t载体扩增产物；2为16s-promoter 基因扩增产物；3为xbai/kpni双酶切鉴定pucp28tl；
29.图2为本发明实施例2中gfp/bfp/rfp基因的pcr扩增结果；其中，m为 dl-2000marker；1为gfp扩增产物；2为bfp扩增产物；3为rfp扩增产物；4 为阴性对照；
30.图3为本发明实施例2中重组质粒酶切鉴定结果；其中，m为dl-2000 marker；1为pucp28tl；2为pucp28tl-gfp；3为pucp28tl-rfp；4为 pucp28tl-bfp；5-8分别为xbai/hindiii分别双酶切鉴定pucp28tl、 pucp28tl-gfp、pucp28tl-rfp、pucp28tl-bfp载体；
31.图4为本发明制备得到的分别含有bfp、gfp或rfp类鼻疽菌荧光标记表达质粒的质粒图谱；
32.图5为本发明实施例4中电转化的重组类鼻疽菌涂片荧光显微图；
33.图6为本发明实施例5中重组荧光类鼻疽菌传30代后的荧光菌落图；
34.图7为本发明实施例6中重组红色荧光类鼻疽菌感染raw264.7细胞的免疫荧光图；
35.图8为本发明实施例6中红色荧光标记的类鼻疽菌感染后lc3包裹病原菌的动态过程。
具体实施方式
36.下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易被本领域人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
37.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
38.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
39.实施例1类鼻疽菌表达载体pucp28tl的构建
40.以类鼻疽菌bpc006基因组dna(fang y,huang y,li q,chen h,yao z,panj,gu j,tang b,wang hg,yu b,tong yg,zou qm,mao xh.first genome sequenceof a burkholderia pseudomallei isolate in china,strain bpc006,obtained from amelioidosis patient in hainan.j bacteriol.2012dec；194(23):6604-5.)为模板，用华大基因科技有限公司合成的引物seq id no:7和seq id no:8，扩增启动子16s
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promoter基因，得到的16s-promoter基因的核苷酸序列为seq id no:18。同理，以质粒pucp28t(购于biovector ntcc)为模板，用华大基因科技有限公司合成的引物seq id no:5和seq id no:6，扩增pucp28t载体基因片段，引物序列见表1。
41.pcr反应体系(50μl)：2
×
primegc buffer 25μl，dntp mixture 4 μl,上下游引物(10μmol/l)各1μl，模板dna 1μl，primehs dnapolymerase(2.5u/μl)0.5μl，dmso 2μl，ddh2o 16.5ml，其中primehsdna polymerase，dntp mixture和2
×
primegc buffer(上海宝生生物)； pcr反应条件：95℃预变性5min；98℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸1.5min；4℃保持。
42.配置1％琼脂糖凝胶，6
×
loading buffer与pcr反应产物充分混匀上样，凝胶成像仪确认条带位置，如图1所示，紫外仪上切取目的基因片段；凝胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司)回收目的片段；纯化后的片段经xbai和kpni双酶切后，用t4 dna连接酶(宝日医生物技术)于16℃过夜连接，连接产物热击转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，然后涂布于含250μg/ml甲氧苄啶的lb平板进行筛选，挑取阳性单克隆菌落，于250μg/ml甲氧苄啶的lb液体培养基振荡培养，取少量菌液送华大基因科技有限公司测序验证，其余菌液离心后提质粒，用xbai和kpni双酶切验证。构建的载体酶切电泳条带大小正确，且测序结果与理论序列一致，类鼻疽菌表达质粒pucp28tl构建成功，其碱基序列为seqid no:1。
43.实施例2重组表达质粒pucp28tl-gfp/bfp/rfp的构建
44.根据gfp-rfp-lc3质粒(购于biovector ntcc)的gfp和rfp基因序列设计引物gfp-f/r和rfp-f/r，并在gfp-f/r引物5’端分别插入xbai和hindiii 酶位点，在rfp-f/r引物5’端分别插入xbai和spei酶位点；同理根据pcmv
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n-bfp质粒(购于上海碧云天生物技术有限公司)的bfp基因设计引物bfp-f/r，并在上下游引物5’端插入xbai和hindiii酶位点。引物均由华大基因科技有限公司合成。三种荧光蛋白的基因序列见文末序列表，引物序列详见表1。扩增结果如图2所示。
45.将胶回收的gfp/bfp基因和类鼻疽菌表达质粒pucp28tl经xbai和hindiii 双酶切后，用t4 dna连接酶(宝日医生物技术)于16℃过夜连接，连接产物热击转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，然后涂布于含250μg/ml甲氧苄啶的lb 平板进行筛选，挑取阳性单克隆菌落，于250μg/ml甲氧苄啶的lb液体培养基振荡培养，取少量菌液送华大基因科技有限公司测序验证，其余菌液离心后提质粒，用xbai和hindiii双酶切验证。由于rfp基因上存在两个hindiii酶切位点，故需将构建成功的pucp28tl-bfp质粒和rfp基因经xbai和spei双酶切后连接，同上，获得pucp28tl-rfp质粒，后续用xbai和spei双酶切验证。电泳结果显示，三种重组质粒经双酶切后在gfp/bfp/rfp基因对应分子量处出现对应的条带(图3)，对应质粒的测序结果也都正确。得到的表达质粒图谱如图4所示。
46.表1荧光质粒的构建及验证引物
47.a
restriction sites are underlined.
[0048][0049]
实施例3类鼻疽菌bpc006电转感受态的制备
[0050]
从lb固体平板挑bpc006单菌落于5ml sob培养基(每1l培养基中含胰蛋白胨20g，酵母提取物5g，nacl 0.5g，250mm kcl 10ml，121℃灭菌后加入5ml无菌2m mgcl2)摇瓶过夜，再按1:10比例取250μl过夜培养菌液接种到25ml sob培养基中，扩大培养到od600为0.6-0.8(由美国bio-rad公司的酶标仪检测)。将菌液置于冰上放置20min，再于4℃，2000g，离心10min，取 50ml预冷的无菌ddh2o洗涤一遍后离心，菌沉淀再用25ml预冷的10％无菌甘油洗涤2遍，离心留菌沉淀，加10％甘油500μl重悬，每100μl每管分装于
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80℃暂存。
[0051]
实施例4重组质粒电转化bpc006感受态细胞并筛选出荧光菌株
[0052]
将50μl类鼻疽菌感受态细胞bpc006与5μl重组质粒(500-1000ng)于冰上混匀，加入到冰上预冷的0.2cm电击杯中，冰上放置10min。微生物电穿孔仪 micropulser(美国bio-rad公司)的反应条件为3kv，200ω，25μf电击后(时间常数为4.5-5ms)，立即加入1ml 37℃
预热的soc培养基(每100ml sob培养基中加入无菌的1m glucose溶液2ml)，转入1.5ml离心管中，37℃振荡孵育2小时，取200μl菌液涂布含250μg/ml甲氧苄啶的lb平板，37℃孵箱培养 36小时，挑单菌落重悬于适量的4％多聚甲醛中固定，取10μl滴于载玻片，在荧光显微镜下观察，成功筛选到了表达三种荧光蛋白的类鼻疽菌(图5)。
[0053]
实施例5荧光载体在bpc006内表达稳定性检测
[0054]
将荧光类鼻疽菌株bpc006接种于无抗性的lb培养基中，37℃培养，每隔 16～18h按0.1％的比例转接到新鲜的无抗lb培养基中，连续传代30次，取样适量稀释后，涂布于无抗lb平板(3个重复)，置于孵箱37℃培养36小时，于多功能智能成像系统ibright
tm cl1500(美国thermo公司)下拍照观察荧光菌落，并计算荧光菌落数/总菌落数，即为荧光载体的稳定表达率。结果显示，经连续稀释传代30次后，在无抗lb平板上仍能培养出带有荧光的菌落(图6)，且荧光菌落占总菌落数百分比为92
±
5％(绿色荧光菌)和95
±
13％(红色荧光菌)，表明重组荧光类鼻疽菌在传代至30代时仍能表达荧光蛋白，被标记上荧光。
[0055]
实施例6荧光类鼻疽菌与lc3的免疫荧光检测及动态观察
[0056]
自噬是宿主细胞通过自噬小体包裹胞内病原菌经自噬-溶酶体途径对病原体进行免疫清除的一种方式。其中lc3是一种自噬相关蛋白轻链3，是自噬过程的标志蛋白，主要参与自噬小体的形成。
[0057]
将稳定表达gfp-lc3的小鼠巨噬细胞raw264.7(汉恒生物科技)以1.5
×
105接种于激光共聚焦皿(φ20mm)中，于细胞培养箱中(5％co2，37℃)过夜培养。选取红色荧光类鼻疽菌以感染复数moi为10感染raw264.7细胞，感染 1.5小时后，共聚焦皿用pbs清洗3遍，然后加卡那霉素到250μg/ml，杀胞外细菌0.5小时后，pbs洗3遍，更换含卡那霉素25μg/ml的新鲜培养基，于荧光显微镜上进行免疫荧光检测。荧光显微镜下显示，红色荧光标记的类鼻疽菌能够与gfp-lc3的绿色荧光很好的区分(见图7)，无需对类鼻疽菌进行荧光抗体标记，可直接观察类鼻疽菌与宿主自噬的动态发展过程。
[0058]
在高分辨率活细胞成像系统(deltavision，美国ge公司)上培养稳定表达 gfp-lc3的raw264.7细胞，观察其被红色荧光标记的类鼻疽菌感染后lc3包裹病原菌的动态过程。巨噬细胞在类鼻疽菌感染后会形成触手主动捕获类鼻疽菌，并通过吞噬作用将细菌摄入胞内，类鼻疽菌进入宿主细胞后触发lc3的聚集，迅速形成包裹类鼻疽菌的自噬小体(见图8)。
[0059]
综上所述，本发明提供的三种荧光表达质粒的组成元件、酶切位点和基因序列，以及其在类鼻疽伯克霍尔德菌中活体荧光标记的方法，而且该质粒转化到类鼻疽伯克霍尔德菌后可以稳定表达。红色荧光标记类鼻疽伯克霍尔德菌在其感染致病研究中的应用结果证明此方法对类鼻疽伯克霍尔德菌进行荧光示踪，具有安全系数高，操作方便简单的特点。上述发明内容及具体实施方式意在证明本发明所提供技术方案的实际应用，不应解释为对本发明保护范围的限定。本领域技术人员在本发明的精神和原理内，当可作各种修改、等同替换或改进。本发明的保护范围以所附权利要求书为准。
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