一种索玛鲁肽主肽链及其制备方法与流程

1.本发明属于多肽合成技术领域，具体涉及一种索玛鲁肽主肽链及其制备方法。


背景技术：

2.索玛鲁肽（semaglutide）是一种新的长效glp-1受体激动剂，临床证明，索玛鲁肽联合不同的口服降糖药可以有效控制血糖，还具有明显的减肥功效。从结构上看，索玛鲁肽是人胰高血糖素样肽-1链上第8位的ala被aib取代，第34位的lys被arg取代，第26位的lys接上短链peg、谷氨酸及十八烷酸脂肪链等侧链所得，亲水性大大提高、与白蛋白的结合力增强。peg修饰后不但可以与白蛋白紧密结合，掩盖dpp-4酶水解位点，还有助于降低肾排泄，延长生物半衰期，达到长循环的效果。
3.目前多肽药物最有效的合成方法是固相合成法，即从多肽的碳端开始，将第一个氨基酸连接到树脂上后脱去n端的fmoc保护基，然后偶联下一个氨基酸，直到最后一个n端氨基酸的偶联完成后，将多肽从树脂上裂解下来同时去除所有的侧链保护基，得到一条完整的多肽。在索玛鲁肽固相合成过程中，第7位的his与第26位的lys之间存在大量疏水性氨基酸，使得肽链之间氢键稳固，产生严重的β折叠，肽链与肽链之间的作用力增强，引起树脂缩聚，增加了氨基酸偶联的难度，使得索玛鲁肽的收率和纯度大大降低。多肽缩合剂是影响索玛鲁肽固相合成收率和纯度的重要因素，目前常用的缩合剂主要包括碳二亚胺类、脲正离子型、膦正离子型三种。碳二亚胺类缩合剂的缩合活性较低，产生的副产物不易去除，会影响合成多肽的纯度；脲正离子型和膦正离子型缩合剂的缩合活性高，但回收率低，无法被回收继续利用。
4.因此，研发新的多肽缩合剂以期获得具有高纯度和高收率的索玛鲁肽主肽链及其制备方法是必要的。


技术实现要素：

5.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种索玛鲁肽主肽链的制备方法，采用多肽缩合偶联体系进行氨基酸的偶联缩合，有助于提升偶联效率，减少杂质的产生，提高索玛鲁肽主肽链粗肽的纯度和收率，降低合成成本，且降低了纯化难度，极大的提高了纯化效率。
6.为了实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：本发明公开一种索玛鲁肽主肽链的制备方法，所述方法包括：步骤一、将树脂固相载体活化，采用缩合偶联体系，将fmoc-gly-oh偶联至树脂固相载体上得到fmoc-gly-树脂；步骤二、通过固相合成法，按索玛鲁肽主肽链的多肽序列，从c端至n端，采用缩合偶联体系进行氨基酸的活化偶联，依次偶联arg、gly、arg、val、leu、trp、ala、ile、phe、glu，得到第一多肽树脂；步骤三、采用缩合偶联体系进行氨基酸的活化偶联，偶联lys，得第二多肽树脂；
步骤四、采用缩合偶联体系进行氨基酸的活化偶联，依次偶联ala，ala，gln，gly，glu，leu，tyr，ser，ser、val，asp，ser，thr，phe，thr、gly，glu，aib，his，得到索玛鲁肽主肽链树脂；步骤五、用裂解剂进行切割，脱去树脂及侧链保护基得到索玛鲁肽主肽链粗肽；步骤六、经反相高效液相色谱纯化、阴离子交换色谱转盐、冷冻干燥得到索玛鲁肽主肽链。
7.作为优选方案，所述步骤一到四中，缩合偶联体系为多肽缩合剂与有机碱的混合物，混合摩尔比为1∶1～1.6，有机碱选自diea或tris。
8.作为优选方案，所述多肽缩合剂的结构式如式(1)所示：(1)。
9.本发明提供具有上式所示结构式的多肽缩合剂，其结构中存在苯并三嗪结构，配合哌啶等基团，使其在常温下即具有较高的缩合活性，在多肽缩合过程中，能够减少副反应的发生，从而减少消旋副产物，提高粗肽的纯度和收率；该多肽缩合剂中还含有醚键、脂肪烃等疏水结构，水溶性低，使其方便从溶液中分离，有助于提高后续纯化效率，缩合剂可重新回收再利用。
10.所述多肽缩合剂经由下述方法制备得到：3,4-二氢-3-羟基-4-氧-1,2,3-苯并三嗪与环氧丙烷反应得到产物a，接着与2-氯-1-(2-乙烯基-1-哌啶基)乙酮反应制得多肽缩合剂。
11.在本发明的具体实施例中，所述多肽缩合剂具体经由下述方法制备得到：i)3,4-二氢-3-羟基-4-氧-1,2,3-苯并三嗪加入到thf中搅拌溶解，加入环氧丙烷、四甲基氢氧化铵，50～80℃下搅拌反应2～5 h，产物用甲醇洗涤，得到产物a；ii)2-氯-1-(2-乙烯基-1-哌啶基)乙酮溶于dcm中，加入产物a，搅拌状态下加入三乙胺，滴加完后继续搅拌反应3～5 h，过滤，滤饼用甲醇洗涤，收集滤饼并干燥，即得多肽缩合剂。
12.作为优选方案，所述步骤i)中，3,4-二氢-3-羟基-4-氧-1,2,3-苯并三嗪、环氧丙烷的摩尔比为1∶1.1～1.5。
13.作为优选方案，所述步骤ii)中，产物a、2-氯-1-(2-乙烯基-1-哌啶基)乙酮的摩尔比为1∶1.1～1.3。
14.作为优选方案，所述步骤ii)中，三乙胺的添加量为2-氯-1-(2-乙烯基-1-哌啶基)乙酮摩尔质量的0.1～0.4倍。
15.本发明通过上述方法，以3,4-二氢-3-羟基-4-氧-1,2,3-苯并三嗪为多肽缩合剂的主要活性结构，经过上述步骤，依次与环氧丙烷、2-氯-1-(2-乙烯基-1-哌啶基)乙酮反应制备得到式(1) 所示多肽缩合剂，方法简单，产物得率高，将其用于多肽的缩合偶联，可发挥出较高的缩合活性，目标肽的合成效率高，能够有效增加目标肽粗肽的纯度和收率，多肽缩合剂的疏水性方便缩合后的副产物与溶液的分离，易于进行后续的分离纯化，从而提高
纯化收率，具有广阔的应用前景。
16.作为优选方案，所述步骤一到四中，氨基酸、缩合偶联体系的摩尔比为1∶2.5～3。
17.作为优选方案，所述步骤一中，树脂固相载体为wang树脂、4-methoxytrityl-cl树脂、2-cl-trity-cl树脂中的任一种。
18.作为优选方案，所述步骤一中，fmoc-gly-树脂的取代度为0.2～0.45 mmol/l。
19.作为优选方案，所述步骤一中，fmoc-gly-树脂具体经由下述方法制备得到：树脂在dcm中充分溶胀，抽干溶剂；将fmoc-gly-oh加入到dcm溶液中搅拌溶解，降温到0～10℃后，加入缩合偶联体系，搅拌活化10～30 min，然后加入到树脂中搅拌反应4～6 h；抽干溶剂，加入醋酸酐、4-氨基吡啶、dcm，进行封端1～2.5 h，dcm与甲醇交替洗涤，真空干燥，得到fmoc-gly-树脂；其中，所述fmoc-gly-oh的添加量为树脂摩尔质量的0.9～1.4倍；缩合偶联体系的添加量为树脂摩尔质量的2～3倍；醋酸酐的添加量为树脂摩尔质量的0.5～0.8倍；4-氨基吡啶的添加量为树脂摩尔质量的0.4～0.8倍。
20.作为优选方案，所述步骤二中，偶联的氨基酸依次为：fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-glu(otbu)-oh。
21.作为优选方案，所述步骤三中，lys采用r
1-lys(boc)-ome.hcl为原料，r1选自h或fmoc。
22.作为优选方案，所述步骤四中，偶联的氨基酸依次应用：fmoc-ala-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-aib-oh、fmoc-his(r2)-oh；所述r2选自boc或trt。
23.作为优选方案，所述步骤五中，裂解剂是由90～93 wt%三氟乙酸、2～3 wt%茴香硫醚、1～2 wt%三异丙基硅烷、1～2 wt% 1,2-乙二硫醇、去离子水余量混合而成。
24.作为优选方案，所述步骤六中，反相高效液相色谱法纯化条件为：色谱填料：改性硅胶色谱填料，装填体积为20～100 ml；流动相：a相为0.05～0.5 vol%三氟乙酸的水溶液，b相为乙腈；检测波长：210～230 nm；流速：50～100 ml/min；洗脱条件：a相和b相的混合液，其中b相的体积百分比在40 min内由20%升至50%。
25.作为优选方案，改性硅胶色谱填料是由盐酸溶液活化后的多孔硅胶与环氧硅烷偶联剂反应，然后再与1-吡啶-2-基-1,4-丁二胺反应制得。
26.作为优选方案，所述改性硅胶色谱填料的制备方法具体包括下述步骤：1)c18硅胶用盐酸水溶液浸泡活化2～5 h，随后用去离子水洗涤至中性，最后用丙酮洗涤并干燥，得到活化硅胶；使表面的硅羟基暴露；2)将活化硅胶溶于甲苯中，加入环氧基硅氧烷，80～100
°
c下反应过夜，用热水清洗，干燥得到环氧化改性硅胶；3)环氧化改性硅胶溶于甲苯中，80～100
°
c下加入1-吡啶-2-基-1,4-丁二胺，搅拌反应过夜，产物用热水清洗，干燥得到改性硅胶色谱填料。
27.作为优选方案，所述步骤2) 中，环氧基硅氧烷为2-(3,4-环氧环己烷基)甲基二乙氧基硅烷、2-(3,4-环氧环己烷基)甲基二乙氧基硅烷或(3-环氧丙氧基丙基)二甲基乙氧基硅烷；所述环氧基硅氧烷的添加量为活性硅胶质量的0.8～2倍。
28.作为优选方案，所述步骤3) 中，1-吡啶-2-基-1,4-丁二胺的添加量为环氧化改性硅胶质量的0.2～0.35倍。
29.本发明通过上述方法，以c18硅胶为原料，通过硅胶表面硅羟基与环氧基硅氧烷反应，将环氧基团键合到多孔硅胶表面，然后利用1-吡啶-2-基-1,4-丁二胺与环氧化改性硅胶反应制得改性硅胶色谱填料，减少了硅胶微球表面硅羟基的数量，通过环氧硅氧烷、1-吡啶-2-基-1,4-丁二胺两步改性处理，引入了亲水性硅氧基团等，减少了多肽在填料表面的非特异性吸附，且引入了疏水性的脂肪烃链，电荷排斥作用力配合疏水性，使其具有良好的分离效果，有助于非目标物质的洗脱，从而提高多肽的纯化效率。
30.作为优选方案，所述步骤六中，阴离子交换色谱脱盐条件为：色谱填料：deae高流速琼脂糖微球，装填体积为20～100 ml；流动相：0.1～2 vol%的醋酸、0.05～0.5 vol%醋酸铵的混合溶液；测波长：210～230 nm；流速：50～100 ml/min；洗脱条件：100%的醋酸/醋酸铵的混合溶液。
31.本发明还公开了多肽缩合剂在提高制备索玛鲁肽主肽链时粗肽纯度和收率的应用。
32.本发明还公开了改性硅胶色谱填料在提高索玛鲁肽主肽链粗肽分离纯化效率的应用。
33.本发明以自制的多肽缩合剂与有机碱混合作为缩合偶联体系，根据索玛鲁肽主肽链的多肽序列，对氨基酸进行缩合偶联，因此具有以下有益效果：1) 缩合偶联lys时，使用h-his(boc)-oh或fmoc-his(boc)-oh作原料，弥补了lys(alloc)、lys(mmt) 价格昂贵，且侧链去除工艺难的缺陷；2) 缩合偶联氨基酸时，使用多肽缩合剂与有机碱为缩合偶联体系，提升偶联效率，减少了杂质的产生，提高了粗肽的纯度和收率，降低了合成成本；3) 应用1-吡啶-2-基-1,4-丁二胺、环氧硅氧烷改性的硅胶作为色谱填料对索玛鲁肽主肽链粗肽进行反相高效液相色谱纯化，改性硅胶的亲水性作用减少了多肽的吸附，电荷排斥作用力配合疏水性提高了多肽的纯化效率。
附图说明
34.图1是实施例1中多肽缩合剂的合成路线图；图2是实施例3中索玛鲁肽主肽链的hplc谱图；图3是实施例2中改性硅胶色谱填料的ftir图；图中a代表c18硅胶色谱填料，b代表改性硅胶色谱填料；图4是索玛鲁肽主肽链粗肽的纯度和收率；图中b代表收率，c代表纯度；图5是索玛鲁肽主肽链的纯化收率。
具体实施方式
35.以下用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，应当指出的是，这些实施例仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
36.本发明相关名词解释：thf：四氢呋喃；dcm：二氯甲烷；fmoc：9-芴甲氧羰基；gly：甘氨酸；arg：精氨酸；val：缬氨酸；leu：亮氨酸；trp：色氨酸；ala：丙氨酸；ile：异亮氨酸；phe：苯丙氨酸；glu：谷氨酸；gln：谷氨酰胺；tyr：酪氨酸；ser：丝氨酸；asp：天冬氨酸；thr：苏氨酸；aib：2-甲基丙氨酸；his：组氨酸；diea：n,n-二异丙基乙胺；tris：三(2-氨基乙基)胺；pbf：2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基；boc：叔丁氧羰基；otbu：叔丁氧基；trt：三苯甲基；tbu：叔丁基；hbtu：苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸盐；depbt：3-(二乙氧基磷酰氧基)-1,2,3-苯并三嗪-4-酮。
37.实施例1：本实施例提供一种多肽缩合剂的制备方法（合成路线图如图1所示），所述方法包括：i)16.3 g 3,4-二氢-3-羟基-4-氧-1,2,3-苯并三嗪加入到100 ml thf中搅拌溶解，加入7.5 g环氧丙烷、0.8 g四甲基氢氧化铵，60℃下搅拌反应4 h，产物用甲醇洗涤，得到产物a；ii)24.3 g 2-氯-1-(2-乙烯基-1-哌啶基)乙酮溶于100 ml dcm中，加入产物a，搅
拌状态下加入2 g三乙胺，滴加完后继续搅拌反应4 h，过滤，滤饼用甲醇洗涤，收集滤饼并干燥，即得多肽缩合剂。
38.将所得多肽缩合剂进行核磁氢谱测试，测试后观察核磁氢谱看出，7.40～8.05 ppm为苯环上氢的化学位移，3.40 ppm、3.65 ppm分别为环氧丙烷开环后亚甲基氢、次甲基氢的化学位移，1.28 ppm为环氧丙烷开环后甲基氢的化学位移，3.35～1.60 ppm为哌啶环上氢的化学位移，说明多肽缩合剂成功制备。
39.实施例2：本实施例提供一种改性硅胶色谱填料的制备方法，所述方法包括：将c18硅胶用0.1 mol/l的盐酸水溶液浸泡活化3.5 h，随后用去离子水洗涤至中性，最后用丙酮洗涤并干燥，得到活化硅胶；将1 g活化硅胶溶于10 ml甲苯中，加入1.4 g 2-(3,4-环氧环己烷基)甲基二乙氧基硅烷，90
°
c下反应过夜，用热水清洗，干燥得到环氧化改性硅胶；将1 g环氧化改性硅胶溶于10 ml甲苯中，90
°
c下加入0.3 g 1-吡啶-2-基-1,4-丁二胺，搅拌反应过夜，产物用热水清洗，干燥得到改性硅胶色谱填料。
40.实施例3：本实施例提供一种索玛鲁肽主肽链的制备方法，所述方法包括：步骤一、制备fmoc-gly-树脂：将10 g wang树脂（0.5mmol/g）加入到50 ml dcm中溶胀1 h，抽干溶剂；将15 g fmoc-gly-oh加入到200 ml dcm中搅拌溶解，降温到10℃以下，加入11.6 g缩合偶联体系，搅拌活化20 min，然后将其加入到树脂中搅拌反应5 h；反应完后抽干溶剂，加入1.2 g醋酸酐、1.13 ml 4-氨基吡啶、100 ml dcm，进行封端1.5 h，产物dcm与甲醇交替洗涤，真空干燥，得到fmoc-gly-树脂；经紫外分光光度计法检测其取代度为0.38 mmol/g；步骤二、制备第一多肽树脂：将步骤一所得fmoc-gly-树脂加入到100 ml dcm中溶胀40 min，抽干溶液，加入100 ml、20 vol%哌啶/dcm溶液，室温反应20 min，抽干溶液；再次加入100 ml、20 vol%哌啶/dcm溶液，室温下反应20 min，抽干溶液，用dcm进行清洗，即fmoc脱除完成；将17.7 g fmoc-arg(pbf)-oh加入到500 ml dcm中溶解，0℃下加入11.6 g缩合偶联体系活化10 min，将活化后的反应液加入到树脂中，25℃下反应2 h，抽干溶液，树脂用dcm洗涤5次，即得fmoc-arg(pbf)-gly-树脂；重复上述脱除fmoc和氨基酸偶联步骤，依次偶联fmoc-gly-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-glu(otbu)-oh，得到第一树脂；步骤三、制备第二多肽树脂：按照步骤二中脱除fmoc和氨基酸偶联步骤，偶联h-lys(boc)-ome.hcl，得到第二树脂；步骤四、制备索玛鲁肽主肽链树脂：按照步骤二中脱除fmoc和氨基酸偶联步骤，依次偶联fmoc-ala-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu
(otbu)-oh、fmoc-aib-oh、fmoc-his(trt)-oh，制得索玛鲁肽主肽链树脂；步骤五、制备索玛鲁肽主肽链粗肽：向索玛鲁肽主肽链树脂中加入2000 ml裂解液，室温下裂解3 h，抽滤，滤液加入到甲基叔丁基醚中沉淀，离心所得固体，并用甲基叔丁基醚洗涤至中性，干燥得到索玛鲁肽主肽链粗肽；所述裂解剂由92.5 wt%三氟乙酸、2.5 wt%茴香硫醚，1.5 wt%三异丙基硅烷，1.5 wt% 1,2-乙二硫醇、2 wt%去离子水混合而成；步骤六、纯化索玛鲁肽主肽链：样品处理：将索玛鲁肽主肽链粗肽溶于0.5 vol%乙腈水溶液中，完全溶解后用0.25 μm滤膜过滤，收集过滤后的索玛鲁肽粗肽水溶液备用；反相高效液相色谱法纯化：色谱填料为实施例2所得改性硅胶色谱填料，装填体积为60 ml，流动相为a相为0.1 vol%三氟乙酸的水溶液，b相为乙腈；检测波长为220 nm；流速为80 ml/min；将改性硅胶色谱填料上柱，以流动相a平衡柱子，上样进行洗脱，洗脱剂为a相与b相的混合液，其中b相的体积百分比在45 min内由10%上升至35%，之后保持35%的比例不变，在65 min时开始收集纯化液；阴离子交换色谱脱盐：色谱填料为deae高流速琼脂糖微球，装填体积为60 ml，流动相为包含0.5 vol%的醋酸、0.2 vol%醋酸铵的混合溶液，测波长为220 nm，流速为80 ml/min，将deae高流速琼脂糖微球上柱，以流动相平衡柱子，上样进行洗脱，洗脱剂为100%的醋酸/醋酸铵的混合溶液，浓缩冻干得到索玛鲁肽主肽链纯品，hplc色谱图如图2所示。
41.本实施例中，缩合偶联体系是摩尔比为1∶1.4的实施例1所得多肽缩合剂、diea。
42.实施例4：本实施例提供另一种索玛鲁肽主肽链的制备方法，所述方法与实施例3基本相同，不同之处在于，本实施例中的缩合偶联体系是摩尔比为1∶0.5的实施例1制备得到的多肽缩合剂、diea。
43.实施例5：本实施例提供另一种索玛鲁肽主肽链的制备方法，所述方法与实施例3基本相同，不同之处在于，本实施例中的缩合偶联体系是质量比为1∶1的实施例1制备得到的多肽缩合剂、diea。
44.实施例6：本实施例提供另一种索玛鲁肽主肽链的制备方法，所述方法与实施例3基本相同，不同之处在于，本实施例中的缩合偶联体系是质量比为1∶1.6的实施例1制备得到的多肽缩合剂、diea。
45.实施例7：本实施例提供另一种索玛鲁肽主肽链的制备方法，所述方法与实施例3基本相同，不同之处在于，本实施例中的缩合偶联体系是质量比为1∶2的实施例1制备得到的多肽缩合剂、diea。
46.实施例8：本实施例提供另一种索玛鲁肽主肽链的制备方法，所述方法与实施例3基本相同，不同之处在于，本实施例中的缩合偶联体系是质量比为1∶1.4的hbtu、diea。
47.实施例9：
本实施例提供另一种索玛鲁肽主肽链的制备方法，所述方法与实施例3基本相同，不同之处在于，反相高效液相色谱法纯化过程中的色谱填料为环氧化改性硅胶，环氧化改性硅胶的制备方法与实施例2中的步骤相同。
48.实施例10：本实施例提供另一种索玛鲁肽主肽链的制备方法，所述方法与实施例3基本相同，不同之处在于，反相高效液相色谱法纯化过程中的色谱填料为c18硅胶。
49.试验例1：多肽缩合剂的缩合活性测试：将25.2 g boc-d-苯甘氨酸加入到500 ml dcm中，加入14 g l-丙氨酸甲酯盐酸盐、15 g tris，然后加入60.5 g实施例1制备得到的多肽缩合剂，室温搅拌5 h进行缩合，取样用hplc检测boc-d-苯甘氨酸的剩余量，并分别应用hbtu与depbt测试缩合活性，结果如表1所示。
50.表1多肽缩合剂的缩合活性从表1可以看出，与hbtu、depbt相比较，利用本发明制得的多肽缩合剂对氨基酸进行缩合偶联，原料剩余量少，说明本发明制得的多肽缩合剂的缩合活性高于hbtu、depbt。
51.试验例2：改性硅胶色谱填料的红外光谱表征：将实施例2中的c18硅胶、改性硅胶色谱填料利用德国bruker公司的yensor-27型红外光谱仪进行红外光谱分析，测得结果如图3所示。
52.观察图3可知，曲线a代表未改性的c18硅胶色谱填料，曲线b代表改性硅胶色谱填料，如图所示，曲线a在3420 cm-1
附近为硅羟基的强吸收峰，1128 cm-1
、810 cm-1
附近为硅氧基的振动峰；对比曲线a，曲线b在3420 cm-1
附近的硅羟基吸收峰减弱，说明部分硅羟基被反应消耗，850 cm-1
附近出现环氧基团的特征吸收峰，说明2-(3,4-环氧环己烷基)甲基二乙氧基硅烷成功接枝到硅胶上，1600～1420 cm-1
附近出现吡啶的特征振动峰，说明1-吡啶-2-基-1,4-丁二胺成功对环氧化改性后的硅胶进行改性。
53.试验例3：索玛鲁肽主肽链的粗肽的收率和纯度：以实施例3～8制得的索玛鲁肽主肽链粗肽为样品，利用高效液相色谱测试其纯度，并根据反应物与产物的摩尔量计算其摩尔收率，测试结果如图4所示。
54.图4是索玛鲁肽主肽链粗肽的收率和纯度测试结果，其中b代表收率，c代表纯度，如图所示，多肽合成过程中以特定质量比的多肽缩合剂与diea共混作为缩合偶联体系，可使索玛鲁肽主肽链粗肽的收率和纯度最高可达97.4%、85.7%；对比实施例3～7可知，缩合偶联体系中多肽缩合剂与diea的质量比对多肽的合成收率和纯度影响较大，当多肽缩合剂与
diea的质量比在1∶1～1.6范围时，具有较高的缩合活性，能减少副反应的发生，从而减少消旋副产物，提高粗肽的纯度和收率；对比实施例3和8可知，相比现有的缩合偶联体系hbtu和diea，本发明提供的多肽缩合剂与diea组成的缩合偶联体系具有更高的缩合活性。
55.试验例4：纯化索玛鲁肽主肽链的收率：以实施例3～10所得纯化索玛鲁肽主肽链为样品，利用高效液相色谱测试其纯度，并利用纯化前后的质量计算纯化收率，测试结果如图5所示。
56.图5是索玛鲁肽主肽链粗肽经纯化后的收率，经本发明所述纯化方法对索玛鲁肽主肽链粗肽进行纯化，得到的索玛鲁肽主肽链的纯度均高于99.7%，实施例3、5和6的纯化收率高于76.5%，纯化收率高，实施例4、7和8的纯化收率低于实施例3，说明利用本发明制备得到的多肽缩合剂与diea共混作为缩合偶联体系比hbtu和diea具有更好的缩合偶联活性，能够减少副反应的发生，从而减少消旋副产物，有助于目标肽与副产物、杂质之间的分离纯化，从而可以在一定程度上提高纯化收率；实施例9和10的纯化收率明显低于实施例3，实施例10的纯化收率最低，说明在高效液相色谱法纯化过程中，相比以环氧化改性硅胶或c18硅胶为色谱填料，以改性硅胶为色谱填料更有助于非目标物质的洗脱，从而提高多肽的纯化效率。
57.本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
58.以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。