一种脱水四环素诱导的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌通用型诱导表达系统

1.本发明了涉及一种脱水四环素诱导的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌通用型诱导表达系统，属于基因工程学领域。


背景技术：

2.枯草芽孢杆菌作为一类革兰氏阳性菌，由于其良好的生物安全性，较强的分泌能力，无密码子偏好性而被广泛应用与各种蛋白酶制剂和有价值的蛋白质的生产。枯草芽孢杆菌表达异源蛋白存在多种表达系统，以不同启动子特性来分，主要有自诱导表达系统、组成型表达系统、诱导型表达系统。启动子从功能上主要分为组成型启动子和诱导型启动子两类。组成型启动子在菌体的生长各个阶段都可以表达外源基因，而诱导型启动子在没有被诱导时表现无活性或者低活性，在加入诱导剂之后启动子的活性大幅提高进而高效表达外源基因。诱导型启动子由于其活性可控而被广泛应用，人们可以通过调控加入诱导剂的试剂和浓度控制外源基因的表达时间和强度。
3.目前在枯草芽孢杆菌当中应用较为广泛的主要有iptg诱导系统和木糖诱导系统。其中，iptg诱导系统主要基于pht系列载体构建而成，使用的是非天然的杂合启动子和大肠杆菌的laci阻遏蛋白和结合位点；而木糖诱导系统通常使用天然的pxyla启动子和xylr阻遏蛋白。虽然iptg、木糖等诱导系统在枯草芽孢杆菌中被广泛使用，但由于木糖是碳源会被利用、iptg对人体有毒、表达强度有限、在大肠杆菌中是组成型表达无法诱导等缺点，在实际使用中均出现一定的问题；如在表达一些对菌体产生毒性的蛋白时，在大肠杆菌中的泄漏表达经常使基因序列发生突变而提前终止表达，无法构建大肠-枯草通用诱导调控系统。
4.因此，需要开发一种基于新型诱导剂、调控严谨、在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中通用的诱导型表达系统，对后续酶工程、代谢工程等领域打下基础。


技术实现要素：

5.枯草芽孢杆菌中常用的iptg、木糖等诱导系统在大肠杆菌中组成型表达无法诱导，不利于蛋白表达载体的构建与调控系统的构建；通用诱导型表达系统要求阻遏蛋白要在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中表现出足够的亲和强度和表达强度以降低启动子的泄漏使调控更严谨。
6.本发明提供了一种阻遏蛋白tetr表达框，所述表达框由启动子p21、rbs序列和阻遏蛋白tetr构成；所述启动子p21的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述rbs序列的核苷酸序列如seq id no.4或seq id no.9所示，所述阻遏蛋白tetr的氨基酸序列如seq id no.2所示，或阻遏蛋白为，将氨基酸序列如seq id no.2所示的阻遏蛋白tetr的第119位的苯丙氨酸突变为酪氨酸得到的。
7.本发明还提供了一种表达系统，所述表达系统由表达载体、上述表达框及目的基因构成，所述目的基因含有p
tet
启动子。
8.在本发明的一种实施方式中，所述目的基因包括但不限于超级折叠绿色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、β-葡萄糖醛酸苷酶、β-半乳糖苷酶或参与微生物代谢调控的基因。
9.在本发明的一种实施方式中，所述表达载体包括但不限于pht01质粒、pstop1622质粒、pjoe8999质粒或pad123质粒。
10.在本发明的一种实施方式中，所述p
tet
启动子核苷酸序列如seq id no.7所示。
11.本发明还提供了一种重组细胞，所述重组细胞中含有上述阻遏蛋白tetr表达框，或上述表达系统。
12.在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞以大肠杆菌或枯草芽孢杆菌为表达宿主。
13.在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌包括但不限于e.coli jm109、e.coli jm110、e.coli dh5α或e.coli bl21；所述枯草芽孢杆菌但不限于b.subtilis 168、wb600、wb800。
14.本发明还提供了上述阻遏蛋白tetr表达框在采用大肠杆菌或枯草芽孢杆菌进行目的基因表达中的应用，所述目的基因含有p
tet
启动子。
15.在本发明的一种实施方式中，所述目的基因包括但不限于超级折叠绿色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、β-葡萄糖醛酸苷酶、β-半乳糖苷酶或参与微生物代谢调控的基因。
16.本发明还提供了一种脱水四环素诱导的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌通用型诱导表达质粒pht-p
21-tet-rbs-p
tet-sfgfp及其构建方法。
17.在本发明的一种实施方案中，通用型诱导表达质粒pht-p
21-tet-rbs-p
tet-sfgfp主要由三部分构成：商业化质粒pht01表达载体、阻遏蛋白tetr表达框、超级折叠绿色荧光蛋白(sfgfp)表达框。
18.在本发明的一种实施方案中，阻遏蛋白tetr表达框由枯草芽孢杆菌组成型启动子p21、rbs原始序列和阻遏蛋白基因tetr构成，阻遏蛋白基因tetr的genbank登录号为caa25291，其核苷酸序列和氨基酸序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示，组成型启动子p21的核苷酸序列如seq id no.3所示，rbs序列的核苷酸序列如seq id no.4所示。
19.在本发明的一种实施方案中，超级折叠绿色荧光蛋白(sfgfp)表达框由诱导型启动子p
tet
、rbs-sfgfp
与超级折叠绿色荧光蛋白(sfgfp)组成，超级折叠绿色荧光蛋白(sfgfp)的genbank登录号为bap77013.1，该基因已按照b.subtilis的密码子偏好性进行优化，其核苷酸序列和氨基酸序列分别如seq id no.5和seq id no.6所示，诱导型启动子p
tet
的核苷酸序列如seq id no.7所示，rbs1序列如seq id no.8。
20.本发明还提供了一种脱水四环素诱导的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌通用型诱导表达质粒pht-p
21-f119y-rbs0-p
tet-sfgfp及其构建方法，以上述质粒pht-p
21-tet-rbs-p
tet-sfgfp为模板，将质粒上的阻遏蛋白tetr的119位的苯丙氨酸突变为酪氨酸(f119y)，同时将质粒上阻遏蛋白tetr表达框中的rbs变成rbs0(核苷酸序列如seq id no.9所示)。
21.本发明还提供了一种脱水四环素诱导的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌通用型诱导表达质粒pht-p
21-tet-rbs0-p
tet-sfgfp及其构建方法，以重组质粒pht-p
21-tet-rbs-p
tet-sfgfp为模板，仅将质粒上阻遏蛋白tetr表达框中的rbs变成rbs0(核苷酸序列如seq id no.9所
示)。
22.本发明还提供了一种脱水四环素诱导的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌通用型诱导表达质粒pht-p
21-f119y-rbs-p
tet-sfgfp及其构建方法，以重组质粒pht-p
21-tet-rbs-p
tet-sfgfp为模板，将质粒上的阻遏蛋白tetr的119位的苯丙氨酸突变为酪氨酸(f119y)。
23.本发明还提供了一种重组细胞，所述重组细胞是分别将上述重组质粒pht-p
21-f119y-rbs0-p
tet-sfgfp、pht-p
21-tet-rbs0-p
tet-sfgfp、pht-p
21-f119y-rbs-p
tet-sfgfp转入到宿主细胞中得到的。
24.在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞是以大肠杆菌或者枯草芽孢杆菌为宿主细胞。
25.在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌为e.coli dh5α。
26.在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为b.subtilis g601。
27.在本发明的一种实施方式中，大肠杆菌dh5α为商业化菌株，枯草芽孢杆菌b.subtilis g601菌株(专利申请号cn2021112516567)为胞外蛋白酶敲除菌株，可以增强细胞蛋白的表达。
28.本发明的第四个目的是提供一种表征操纵子p
tet
表达系统表达强度的方法，是应用了上述工程菌株进行96孔板发酵测定。
29.在本发明的一种实施方式中，将上述的基因工程菌在lb培养基中培养，培养条件为：35-37℃，200-220rpm，培养10-15h，获得种子液；以2-5％接种量将种子液接种到96孔板lb发酵液中，培养条件为：35-37℃，750rpm，培养14h-96h。
30.在本发明的一种实施方式中，上述lb培养基为本领域常规培养基，每升组分包括：蛋白胨10g，酵母粉5g，nacl 10g。
31.有益效果
32.(1)本发明构建了在大肠杆菌与枯草芽孢杆菌中均可使用脱水四环素诱导表达的操纵子p
tet
表达系统。其包括商业化质粒pht01表达载体；阻遏蛋白tetr表达框；超级折叠绿色荧光蛋白(sfgfp)表达框。其中阻遏蛋白tetr表达框中的阻遏蛋白tetr的基因序列和rbs进行突变改变阻遏蛋白亲和力和表达强度，操纵子p
tet
在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中均表现出低泄漏和高的诱导放大倍数。
33.(2)由本发明构建的表达系统结构简单、活性高、调控严谨，1)适用于构建大肠杆菌和枯草芽孢杆菌通用型诱导表达系统，相比传统的使用两种操纵子构建的表达系统，减少了非必要元件提高整个表达系统的简洁性与实用性；2)操纵子在枯草中完全不泄露，适用于异源蛋白的高效表达；3)操纵子调控严谨，在代谢途径和基因线路的构建研究中有广阔的应用前景。
附图说明
34.图1：阻遏蛋白tetr表达框。
35.图2：通用型诱导表达质粒pht-p
tet-sfgfp结构示意图。
具体实施方式
36.下述实施例中所涉及的质粒的构建在e.coli dh5α中进行，质粒构建完成构转化
到b.subtilis g601中进行sfgfp的表达和发酵。所使用的载体pht-01为商业化质粒。
37.下述实施例中所涉及的b.subtilis g601是以b.subtilis 168为出发菌株，使用crispr/cpf1技术在基因组上整合了木糖诱导型启动子pxyla控制的转录因子comk coms基因，使其转化效率大幅提高；回复突变了trpc基因和gudb基因，使其能够合成色氨酸并有效利用谷氨酸家族氨基酸；此外，将6个胞外蛋白酶基因(胞外蛋白酶丝氨酸蛋白酶基因apre、中性蛋白酶基因npre、杆菌肽酶基因bpr、金属蛋白酶基因mpr与中性蛋白酶基因nprb)进行了敲除制备得到的，具体的制备方法记载于公开号为cn113957028a的中国发明专利申请文本中。
38.下述实施例中所涉及的培养基如下：
39.lb培养基：每升含10g胰蛋白胨、5g酵母粉和10g nacl。
40.下述实施例中所涉及的检测方法如下：
41.荧光强度的测定
42.使用多功能微孔板检测仪cytation 3(美国伯腾仪器有限公司)参照文献yang s,liu q,zhang y,et al.construction and characterization of broad-spectrum promoters for synthetic biology[j].acs synthetic biology,2018,7(1):287
–
291.的方法对sfgfp的相对荧光强度进行测定。
[0043]
实施例1：诱导表达质粒pht-p
21-tet-rbs-p
tet-sfgfp及工程菌株的构建
[0044]
如图2所示，构建的诱导表达质粒pht-p
21-tet-rbs-p
tet-sfgfp主要由三部分构成：(1)商业化质粒pht01表达载体；(2)阻遏蛋白tetr表达框；(3)超级折叠绿色荧光蛋白(sfgfp)表达框。
[0045]
具体步骤如下：
[0046]
(1)pht质粒骨架的构建
[0047]
使用引物pht-lif：5
’‑
ctgcaggtcgacgtcccc-3’和pht-lir：5
’‑
agcgcaacgcaattaatgtga-3’，以商业化质粒pht01为模板扩增得到pht质粒骨架。
[0048]
(2)阻遏蛋白tetr表达框的构建
[0049]
化学合成阻遏蛋白tetr表达框(图1)；所述阻遏蛋白tetr表达框由枯草芽孢杆菌组成型启动子p21、rbs序列和阻遏蛋白基因tetr构成：
[0050]
所述组成型启动子p21的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述rbs序列的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述阻遏蛋白基因tetr核苷酸序列如seq id no.1所示；
[0051]
阻遏蛋白tetr能够在没有诱导剂存在的情况下与启动子p
tet
结合阻遏启动子的表达，在诱导剂存在的情况下脱离启动子使得启动子表达。
[0052]
得到阻遏蛋白tetr表达框p
21-tet-rbs。
[0053]
(3)超级折叠绿色荧光蛋白(sfgfp)表达框的构建
[0054]
化学合成超级折叠绿色荧光蛋白(sfgfp)表达框；所述超级折叠绿色荧光蛋白(sfgfp)表达框由诱导型启动子p
tet
、rbs1序列、超级折叠绿色荧光蛋白(sfgfp)组成：
[0055]
所述sfgfp的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述诱导型启动子p
tet
的核苷酸序列如seq id no.7所示，rbs1序列如seq id no.8，该蛋白通过荧光强度来表征表达系统的性能。得到超级折叠绿色荧光蛋白(sfgfp)表达框，命名为p
tet-sfgfp。
[0056]
(4)质粒pht-p
21-tet-rbs-p
tet-sfgfp的构建
[0057]
分别将两个表达框一起连接到步骤(1)制备得到的载体pht01骨架上之后，得到质粒pht-p
21-tet-rbs-p
tet-sfgfp，其核苷酸序列如seq id no.10所示。
[0058]
(5)工程菌株的构建
[0059]
分别将上述质粒pht-p
21-tet-rbs-p
tet-sfgfp转化到e.coli dh5α与b.subtilis g601菌株中之后，分别制备得到工程菌株e.coli dh5α/pht-p
21-tet-rbs-p
tet-sfgfp和b.subtilis g601/pht-p
21-tet-rbs-p
tet-sfgfp。
[0060]
实施例2：通用型诱导表达质粒pht-p
21-f119y-rbs0-p
tet-sfgfp及工程菌株的构建
[0061]
具体步骤如下：
[0062]
(1)突变质粒的制备pht-p
21-f119y-rbs0-p
tet-sfgfp制备
[0063]
以实施例1制备得到的质粒pht-p
21-tet-rbs-p
tet-sfgfp为模板，将质粒上的阻遏蛋白tetr的119位的苯丙氨酸突变为酪氨酸(f119y)，同时将质粒上阻遏蛋白tetr表达框中的rbs变成rbs0(核苷酸序列如seq id no.9所示)。
[0064]
所涉及的引物序列如下：
[0065]
使用引物
[0066]
rbs0-f：5
’‑
attcctccttatttatgtagttactatataaaagcattagtgtatcaattccacga-3’；
[0067]
rbs0-r：5
’‑
ctacataaataaggaggaatcacatgtccagattagataaaagtaaagtgattaac-3’。
[0068]
f119y-f：5
’‑
agtgaaaaaccttgttggcataaataggctaattgattttcgagagttt-3’，
[0069]
f119y-r：5
’‑
aaactctcgaaaatcaattagcctatttatgccaacaaggtttttcact-3’。
[0070]
所涉及的pcr反应条件为：98℃预变性2min，98℃变性10s，60℃退火35s，72℃延伸15s，反应10个循环，最后72℃延伸5min。
[0071]
进行pcr得到的片段通过seamless cloning kit(beyotime biotechnology)构建重组质粒pht-p
21-f119y-rbs0-p
tet-sfgfp，测序验证，确认重组质粒构建成功。
[0072]
(2)工程菌的构建
[0073]
将制备得到的重组质粒pht-p
21-f119y-rbs0-p
tet-sfgfp转入e.coli dh5α与b.subtilis g601菌株得到工程菌株e.coli dh5α/pht-p
21-f119y-rbs0-p
tet-sfgfp和b.subtilis g601/pht-p
21-f119y-rbs0-p
tet-sfgfp。
[0074]
实施例3：诱导表达质粒pht-p
21-tet-rbs0-p
tet-sfgfp及工程菌株的构建
[0075]
具体步骤如下：
[0076]
(1)pht-p
21-tet-rbs0-p
tet-sfgfp的构建
[0077]
以实施例1制备得到的重组质粒pht-p
21-tet-rbs-p
tet-sfgfp为模板，仅将质粒上阻遏蛋白tetr表达框中的rbs变成rbs0(核苷酸序列如seq id no.9所示)，所使用引物序列如下：rbs0-f：5
’‑
attcctccttatttatgtagttactatataaaagcattagtgtatcaattccacga-3’；
[0078]
rbs0-r：5
’‑
ctacataaataaggaggaatcacatgtccagattagataaaagtaaagtgattaac-3’。
[0079]
进行pcr(反应条件同实施例2)得到的片段通过seamless cloning kit(beyotime biotechnology)构建重组质粒pht-p
21-tet-rbs0-p
tet-sfgfp，测序验证，确认重组质粒构建成功。
[0080]
制备得到重组质粒pht-p
21-tet-rbs0-p
tet-sfgfp。
[0081]
(2)工程菌的构建
[0082]
分别将制备得到的重组质粒pht-p
21-tet-rbs0-p
tet-sfgfp转入e.coli dh5α和b.subtilis g601中，分别得到工程菌株b.subtilis g601/pht-p
21-tet-rbs0-p
tet-sfgfp和e.coli dh5α/pht-p
21-tet-rbs0-p
tet-sfgfp。
[0083]
实施例4：诱导表达质粒pht-p
21-f119y
‑‑
rbs-p
tet-sfgfp及工程菌株的构建
[0084]
具体步骤如下：
[0085]
(1)pht-p
21-f119y-rbs-p
tet-sfgfp的构建
[0086]
以实施例1制备得到的重组质粒pht-p
21-tet-rbs-p
tet-sfgfp为模板，将质粒上的阻遏蛋白tetr的119位的苯丙氨酸突变为酪氨酸(f119y)，所使用引物序列如下：
[0087]
f119y-f：5
’‑
agtgaaaaaccttgttggcataaataggctaattgattttcgagagttt-3’，
[0088]
f119y-r：5
’‑
aaactctcgaaaatcaattagcctatttatgccaacaaggtttttcact-3’；
[0089]
进行pcr(反应条件同实施例2)得到的片段通过seamless cloning kit(beyotime biotechnology)构建重组质粒pht-p
21-f119y-rbs-p
tet-sfgfp，测序验证，确认重组质粒构建成功。
[0090]
制备得到重组质粒pht-p
21-f119y-rbs-p
tet-sfgfp。
[0091]
(2)工程菌的构建
[0092]
分别将制备得到的重组质粒pht-p
21-f119y-rbs-p
tet-sfgfp转入e.coli dh5α和b.subtilis g601中，分别得到工程菌株b.subtilis g601/pht-p
21-f119y-rbs-p
tet-sfgfp和e.coli dh5α/pht-p
21-f119y-rbs-p
tet-sfgfp。
[0093]
实施例5：操纵子p
tet
表达系统在e.coli与b.subtilis中诱导验证
[0094]
具体步骤如下：
[0095]
(1)将实施例1～4中所得到的工程菌株分别接种到含氨苄青霉素(100mg/l)、氯霉素(5mg/l)的lb培养基中，在37℃，220rpm震荡培养12h，制备得到种子液。
[0096]
(2)分别将上述种子液按4％(v/v)的接种量转接到含lb培养基(含氨苄青霉素100mg/l、氯霉素5mg/l)的96孔板中，分别向96孔板中添加脱水四环素，浓度分别为0nm、200nm的脱水四环素；
[0097]
分别将上述体系置于37℃，750rpm条件下震荡培养在24h，分别制备得到发酵液；分别测量96孔板中发酵液的荧光表达强度，结果如表1所示。
[0098]
表1：不同工程菌株对于荧光蛋白的表达量
[0099]
[0100][0101]
结果显示，突变后的表达系统在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的泄露均很低，并且，操纵子pht-p
f119y-rbs0-sfgfp表达系统在大肠杆菌泄漏很低，枯草芽孢杆菌中无泄漏(荧光表达量为0)；
[0102]
在200nm脱水四环素的诱导下，操纵子pht-p
f119y-rbs0-sfgfp在大肠杆菌中表达增强，枯草芽孢杆菌中略微减弱。
[0103]
通过对两个突变位置的单独突变可知，rbs0是通过增强tetr的表达强度以减少启动子的泄漏，但这同时也减弱了整个操纵子的表达强度。119位点的氨基酸突变略微增强了tetr与阻遏蛋白结合位点的亲和力，使操纵子在的泄漏略微降低，操纵子表达强度也略微降低。但当两种突变结合在一起时，操纵子的性能达到最优，在大肠杆菌中泄漏低诱导表达高，在枯草芽孢杆菌中没有泄漏。
[0104]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。