一种重组人胰高糖素样肽-1及其构建方法和应用

1.本发明属于生物工程技术领域，具体地，涉及一种重组人胰高糖素样肽-1及其构建方法和应用。


背景技术：

2.糖尿病是由于人体血液中葡萄糖长期堆积过多所造成，有很强的遗传性和环境因素影响。随着现代人类饮食结构的变化和生活节奏的加快，全球糖尿病的发病率增长迅猛，已成为继肿瘤、血管疾病之后第三大严重威胁人类健康的慢性代谢性疾病。
3.人胰高糖素样肽-1(glp-1)能刺激胰β细胞增殖，促进胰岛再生，同时抑制胰β细胞的凋亡，并能促进胰β细胞合成胰岛素。动物试验和临床试验均表明ⅱ型糖尿病病人给予glp-1后血糖水平显著降低，且无胰岛素和磺脲类降糖药的低血糖危险。glp-1独特的降血糖作用机制与众不同，是现有抗糖尿病药物无可比拟的，但其非常短的体内半衰期大大限制了其应用。影响glp-1应用的主要因素主要有以下3个方面：(1)glp-1核苷酸序列为tttattgcatggttagttaaaggtcgtggt，氨基酸序列为fiawlvkgrg，分子量非常小，仅为1.15kda，因此大肠杆菌原核表达系统难以表达；(2)因为分子量比较小，在代谢过程中极易被肾小球滤过；(3)体内半衰期短，限制其应用。
4.节肢蛋白(resilin)是一种在昆虫节肢中发现的水溶性弹性蛋白，其由具有高度灵活性和流动性的随机定向卷曲多肽链网络组成，多肽链间通过二酪氨酸和三酪氨酸以共价交联的方式有规律地间隔连接在一起。由于这种稳定的结构，使其具有刚度低、拉伸应变强、持久性强等优异的力学性能，提供低刚度、高应变和高效能源储存，尤其在昆虫飞行、跳蚤和八角虫跳跃起到重要作用。resilin具有耐高温，对众多的变性剂如尿素、盐酸胍都不会降解。resilin蛋白具有的热稳定性和冷却凝集特性，只需经过盐析加热离心等过程就能获得目标蛋白，使蛋白的纯化方法简化，具有良好的应用前景。


技术实现要素：

5.针对现有技术中存在不足，本发明提供了一种重组人胰高糖素样肽-1及其构建方法和应用。本发明中，通过将glp-1和arp连接，构建出重组glp-1的glp-1-linker-arp，所述重组glp-1能够在大肠杆菌原核表达系统表达；自我高效纯化；可提高glp-1稳定性延长药物的半衰期，增加药物在组织内的停留时间，提高降血糖效果。
6.为了实现上述目的，本发明的第一方面提供一种重组人胰高糖素样肽-1glp-1-linker-arp，所述glp-1-linker-arp的氨基酸序列如seq id no:1所示，编码的核苷酸序列如seq id no:2所示。
7.本发明的第二方面提供上述重组人胰高糖素样肽-1的构建方法，所述构建方法为将glp-1与arp通过接头linker连接，得到重组glp-1-linker-arp。
8.具体地，所述glp-1氨基酸序列如seq id no:3所示，编码的核苷酸序列如seq id no:4所示。所述arp为模拟人工节肢蛋白多肽，为27个肽(psssygapgggnggrpsdsygapgggn，
seq id no:9)的10个重复序列组成的模拟树脂蛋白，其氨基酸序列如seq id no:5所示，编码的核苷酸序列如seq id no:6所示。所述接头linker为连接肽，由10个氨基酸组成，氨基酸序列如seq id no:8所示，编码的核苷酸序列如seq id no:7所示。
9.本发明的第三方面提供一种重组表达质粒pet22b-glp-1-linker-arp，所述pet22b-glp-1-linker-arp包括载体pet22b片段和所述的glp-1-linker-arp。所述pet22b可商购获得。
10.本发明的第四方面提供一种含有所述的重组表达质粒的重组菌。所述重组菌优选为大肠杆菌，例如大肠杆菌bl21。
11.本发明的第五方面提供一种制备重组人胰高糖素样肽-1的方法，所述方法为发酵培养所述的重组菌，得到人胰高糖素样肽-1。具体地，所述方法包括lb培养基中于25℃添加0.4mm的iptg诱导培养。
12.根据本发明，该方法还包括对人胰高糖素样肽-1纯化的步骤，具体地，所述纯化方法为冷却凝集纯化，例如采用4℃冷却凝集方法纯化所述人胰高糖素样肽-1。
13.本发明的第六方面提供所述的重组人胰高糖素样肽-1glp-1-linker-arp在制备降血糖药物中的作用。
14.通过对resilin蛋白序列分析，发现所有昆虫的resilin序列都包含tyr-gly-ala-pro(ygap)保守序列。本发明根据保守序列，优化并人工设计了具有树脂蛋白功能的模拟人工节肢蛋白多肽(artificial resilin polypeptide，arp)。arp为psssygapgggnggrpsdsygapgggn的10个重复序列组成，利用该多肽融合表达外源多肽glp-1，解决了(1)glp-1氨基酸太短，无法在大肠杆菌表达系统表达；(2)利用冷却凝集特性，高效纯化融合蛋白；(3)表达的融合蛋白具有提高代谢稳定性，延长药物的半衰期，增加药物在组织内的停留时间，实现长效以减少给药频率。
15.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
16.本发明中，在glp-1连接arp，使glp-1具有的热稳定性和冷却凝集性，这种特性使蛋白只需经过冷却凝集简单的纯化过程就能获得目标蛋白，避免了亲和色谱层析法繁琐的实验过程。通过该特性可以实现glp-1的纯化，得到更高的纯化倍数，此外增加glp-1稳定性。
17.本发明通过基因修饰技术使glp-1连接arp，构建了glp-1-linker-arp重组人胰高糖素样肽-1，具有以下优势：(1)使只有30个核苷酸序列的glp-1可以在大肠杆菌表达系统中表达；(2)具有热稳定性和冷却凝集的特性，使蛋白的纯化简化，只需经过盐析冷却离心等简单的过程就能获得目标蛋白，进而使重组glp-1可以简单、快速、高效地自我纯化，纯化方式在效率上优于传统的镍柱亲和层析纯化方式。(3)提高glp-1代谢稳定性，延长glp-1的半衰期，增加药物在组织内的停留时间，实现长效，减少给药频率。
18.本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
19.通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。
20.图1为重组表达质粒pet22b-glp-1-linker-arp构建示意图。
21.图2为glp-1-linker-arp诱导表达sds-page图。lane 1，2：对照(pet22b)质粒的bl21用1mm iptg诱导0和5h后的总蛋白；lane 3、4：对照(pet22b)质粒的bl21用1mm iptg诱导5h沉淀和上清。lane 5、6：pet22b-glp-1-linker-arp用1mm iptg诱导0和5h总蛋白；lane 7、8：pet22b-glp-1-linker-arp用1mm iptg诱导5h沉淀和上清。
22.图3为4℃下静置不同时间后的glp-1-linker-arp的sds-page图。lane 1：pet22b质粒诱导表达的全菌；lane 2：pet22b-glp-1-linker-arp用1mm iptg诱导5h后的上清；lane 3-6为沉淀重悬tris-hcl缓冲液置于0℃分别放置12h、6h、1h、24h出现的凝聚。
23.图4示出了4℃下静置不同时间后glp-1-linker-arp回收率与纯化倍数。
24.图5示出了注射glp-1-linker-arp后大鼠降血糖效果。
25.图6示出了注射glp-1-linker-arp后大鼠胰岛素浓度的变化。
具体实施方式
26.下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
27.实施例1：重组表达质粒pet22b-glp-1-linker-arp的构建
28.苏州泓迅生物科技股份公司全基因合成glp-1-linker-arp，其氨基酸序列如seq id no:1所示，编码的核苷酸序列如seq id no:2所示。将上述glp-1-linker-arp序列的5’和3’分别带上xba i和sal i酶切位点，然后将带有xba i和sal i酶切位点的glp-1-linker-arp核苷酸序列构建到puc18质粒上，记为puc18-glp-1-linker-arp。重组表达质粒pet22b-glp-1-linker-arp构建示意图如图1所示。
29.其中，所述glp-1为人胰高糖素样肽-1，其氨基酸序列如seq id no:3所示，其核苷酸序列如seq id no:4所示；所述arp是一种模拟人工节肢蛋白，其氨基酸序列如seq id no:5所示，编码所述arp的核苷酸序列如seq id no:6所示；接头linker为连接肽gggkrkrsrv(seq id no:8)，其核苷酸序列如seq id no:7所示。
30.seq id no:3：
31.fiawlvkgrg
32.seq id no:4：
[0033]5’‑
tttattgcatggttagttaaaggtcgtggt-3’[0034]
seq id no:5：
[0035]
(psssygapgggnggrpsdsygapgggn)
10
[0036]
seq id no:6：
[0037]5’‑
ccgagcagcagctatggcgcgccgggcggcggcaacggcggccgcccgagcgatagctatggcgcgccgggcggcggcaacccgagcagcagctatggcgcgccgggcggcggcaacggcggccgcccgagcgatagctatggcgcgccgggcggcggcaacccgagcagcagctatggcgcgccgggcggcggcaacggcggccgcccgagcgatagctatggcgcgccgggcggcggcaacccgagcagcagctatggcgcgccgggcggcggcaacggcggccgcccgagcgatagctatggcgcgccgggcggcggcaacccgagcagcagctatggcgcgccgggcggcggcaacggcggccgcccgagcgatagctatggcgcgccgggcggcggcaacccgagcagcagctatggcgcgccgggcggcggcaacggcggccgcccgagcgatagctatggcgcgccgggcggcggcaacccgagcagcagctatggcgcgccgggcggcggcaacggcggccgcccgagcgatagctatggcgcgccgggcggcggcaacccgagcagcagctatggcgcgccgggcggc
ggcaacggcggccgcccgagcgatagctatggcgcgccgggcggcggcaacccgagcagcagctatggcgcgccgggcggcggcaacggcggccgcccgagcgatagctatggcgcgccgggcggcggcaacccgagcagcagctatggcgcgccgggcggcggcaacggcggccgcccgagcgatagctatggcgcgccgggcggcggcaac-3’[0038]
seq id no:7：
[0039]5’‑
ggcggtgggaaacgcaagcgcagccgcgtg-3’[0040]
seq id no:8：
[0041]
gggkrkrsrv
[0042]
使用xba i和sal i双酶切pet22b和puc-glp-1-linker-arp，所述双酶切体系为：
[0043]
xba i：1μl；
[0044]
sal i：1μl；
[0045]
10
×
buffer：2μl；
[0046]
puc18-glp-1-linker-arp或pet22b：5μl；
[0047]
无菌水：补齐至20μl；
[0048]
将上述双酶切体系加入离心管中并混合均匀，在37℃下酶切2-3h，然后按照胶回收试剂盒(宝生物工程有限公司，大连)回收glp-1-linker-arp基因片段和线性化的pet22b( )，接着把胶回收得到的glp-1-linker-arp基因片段和pet22b( )通过t4连接酶(宝生物工程有限公司，大连)连接。所述连接体系为：
[0049]
10
×
t4 ligase buffer：2μl；
[0050]
pet22b：依回收浓度而定；
[0051]
glp-1-linker-arp：依回收浓度而定；
[0052]
t4 dna ligase(10u/μl)：1μl；
[0053]
无菌水：补齐至20μl；
[0054]
反应在在16℃的培养箱中进行，反应18h左右，连接后得到重组质粒pet22b-glp-1-linker-arp，命名glp-1-linker-arp，所述glp-1-linker-arp的氨基酸序列如seq id no:1所示，核苷酸序列如seq id no:2所示。
[0055]
seq id no:1：
[0056]
mfiawlvkgrggggkrkrsrv(psssygapgggnggrpsdsygapgggn)
10
[0057]
seq id no:2：
[0058]5’‑
atgtttattgcatggttagttaaaggtcgtggtggcggtgggaaacgcaagcgcagccgcgtgccgagcagcagctatggcgcgccgggcggcggcaacggcggccgcccgagcgatagctatggcgcgccgggcggcggcaacccgagcagcagctatggcgcgccgggcggcggcaacggcggccgcccgagcgatagctatggcgcgccgggcggcggcaacccgagcagcagctatggcgcgccgggcggcggcaacggcggccgcccgagcgatagctatggcgcgccgggcggcggcaacccgagcagcagctatggcgcgccgggcggcggcaacggcggccgcccgagcgatagctatggcgcgccgggcggcggcaacccgagcagcagctatggcgcgccgggcggcggcaacggcggccgcccgagcgatagctatggcgcgccgggcggcggcaacccgagcagcagctatggcgcgccgggcggcggcaacggcggccgcccgagcgatagctatggcgcgccgggcggcggcaacccgagcagcagctatggcgcgccgggcggcggcaacggcggccgcccgagcgatagctatggcgcgccgggcggcggcaacccgagcagcagctatggcgcgccgggcggcggcaacggcggccgcccgagcgatagctatggcgcgccgggcggcggcaacccgagcagcagctatggcgcgccgggcggcggcaacggcggccgcccgagcgatagctatggcgcgccgggcggcggcaacccgagcagcagctatggcgcgccgggcggcggc
aacggcggccgcccgagcgatagctatggcgcgccgggcggcggcaac-3’[0059]
实施例2：扩大培养表达glp-1-linker-arp的大肠杆菌
[0060]
(1)将新鲜转化的重组大肠杆菌bl21转移至补充有50μg/ml卡那霉素的固体lb培养基(琼脂粉15g/l，胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，ph7.4)中，并在37℃下培养过夜，然后将过夜培养后的单个菌落转移至5ml含有50μg/ml卡那霉素的液体lb培养基(胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，ph7.4)中，并在37℃，200rpm的轨道振荡器中培养过夜，接着将3ml过夜培养的大肠杆菌bl21接种在300ml含50μg/ml卡那霉素的液体lb培养基在37℃，200rpm下生长3小时或细菌的od
600
达到0.4-0.6之间。
[0061]
(2)将步骤(1)中最终得到的液体培养基置于冰上20分钟，向其中添加异丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(iptg)至终浓度0.4mm，然后分别在25℃和37℃以180rpm摇动培养16-20h(过夜)诱导重组glp-1-linker-arp表达。最后将液体培养基在3000rpm，4℃下离心20分钟弃上清，得到不同温度下培养的细胞沉淀物。
[0062]
(3)将步骤(2)中两种培养温度下得到的细胞沉淀物解冻，分别重悬于10ml tris-hcl(50mm，ph 8.0)中，并在3000rpm，4℃下离心20分钟后弃上清，收集菌体，菌体用50mm ph值为8.0的tris-hcl洗涤两次。然后将细胞重悬于含1mm苯甲基磺酰氟(pmsf)(200μl)的20ml tris-hcl缓冲液中，并使用超声细胞破碎仪在冰上超声裂解30分钟，接着6s交替超声处理，并间歇冷却6s，整个反应保证在冰水浴下进行，得到裂解液。超声结束后，裂解液于4℃，14,000rpm离心30min，得到上清和沉淀，上清移至新的ep管中，保存上清和沉淀。
[0063]
本实施例中，为了确定表达的glp-1-linker-arp以可溶形式或包涵体形式存在，将上述得到的裂解液、上清液和沉淀用于sds-page分析。图2为glp-1-linker-arp诱导表达sds-page图，从图2第8泳道中可以看出，在25℃诱导条件下，glp-1-linker-arp上清中目标大小25-26kda位置处明显增加一条条带，表明诱导成功，获得可溶性重组glp-1-linker-arp。
[0064]
实施例3：冷却凝集纯化glp-1-linker-arp
[0065]
本实施例中利用冷却凝集来纯化glp-1-linker-arp，以此验证实施例2中制备的glp-1的自纯化性能及其纯化效率。将0.4-1.0m的(nh4)2so4加到500μl澄清的样品裂解物中，混匀后置于冰上30-60min，然后4℃，12000rmp离心15min，分离上清和沉淀，沉淀重悬于tris-hcl(50mm，ph 8.0)缓冲液。将重悬的tris-hcl缓冲液置于4℃放置1h、6h、12h、24h，观察出现凝聚层，吸取凝聚层即目标蛋白。将凝聚层转移到新的ep管中。保存一部分纯化的样品用于sds-page分析。
[0066]
图3为将重悬的tris-hcl缓冲液置于不同温度放置不同时间的sds-page图，结果表明静置1-24h可以纯化glp-1-linker-arp蛋白，且12-24h效果比较好。图4是4℃放置不同时间后glp-1-linker-arp回收率与纯化倍数图，结果表明静置6h、12h、24h后的glp-1-linker-arp纯化倍数和回收率分别可达到6.07、9.39、9.51倍和55.54％、81.12％、79.23％，综上所述4℃放置12h纯化效果最佳。
[0067]
实施例4：降血糖效果和胰岛素检测：
[0068]
雄性sd大鼠(江苏大学实验动物中心提供)适应性喂养1周，12h光照周期且自由进食。选取体重为25-30g的大鼠，随机分为正常组和模型组。禁食12h后，模型组大鼠腹腔注射150mg/kg的链脈佐菌素(stz)溶液，各组大鼠试验期间自由进食、饮水。造模组注射后和连
续两次采尾血测定空腹血糖，血糖浓度大于16.7mmol/l、尿糖≧ 时为糖尿病模型复制成功。
[0069]
糖尿病大鼠，自由饮水取食，每天保持12h明暗环境.适应环境1周后，按体重随机分组，每组40只，称重、编号。在实验前一天晚上禁食，仅给予饮水，次日早进行实验。以12nmol/kg的剂量注射。实验分为对照组(腹腔注射生理盐水)；glp-1-linker-arp组(腹腔注射)和glp-1组(腹腔注射glp-1，glp-1由多肽合成而得)。分别在0、6h、12h、24h、36h、48h对大鼠进行尾静脉取血。photometer生化自动测定仪测定血糖浓度(葡萄糖氧化酶法)。
[0070]
血浆胰岛素测定使用大鼠(mouse)胰岛素elisa检测试剂盒(上海岚派生物科技有限公司)。试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(elisa)。往预先包被胰岛素(ins)抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、hrp标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物tmb显色，tmb在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的胰岛素呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(od值)，计算样品浓度。具体如下：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μl。待测样本孔先加样本(血浆)10μl，再加样本稀释液40μl(即样本稀释5倍)；空白孔不加。除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(hrp)标记的检测抗体100μl，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次。每孔加入底物a、b各50μl，37℃避光孵育15min。每孔加入终止液50μl，15min内，在450nm波长处测定各孔的od值。在excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应od值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。
[0071]
图5示出了注射glp-1-linker-arp后大鼠降血糖效果。与对照组相比，注射重组glp-1和glp-1-linker-arp都可明显降低血浆葡萄糖浓度，随着时间的推移，24h后，glp-1-linker-arp组的血浆葡萄糖浓度低于glp-1，表明glp-1-linker-arp可以增加glp-1在组血浆中的停留时间，提高降血糖效果。
[0072]
体内外研究证实，glp-1具有葡萄糖依赖性促胰岛素分泌特征，在高糖介质中刺激胰岛素分泌。为此测定了对照组和注射glp-1-linker-arp组和glp-1大鼠血浆胰岛素浓度的变化。图6表明，与对照组相比，glp-1和glp-1-linker-arp都可以增加血浆胰岛素浓度。随着时间的推移，24h后glp-1-linker-arp组的胰岛素浓度高于glp-1组，表明glp-1-linker-arp可以更持久地刺激胰岛素分泌。
[0073]
综上，glp-1-linker-arp增加glp-1-linker-arp在血浆中的停留时间，持久刺激胰岛素分泌，具有长效降血糖效果，同时可以简单、快速、高效地自我分离纯化。
[0074]
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。