一种多甲氧基黄酮及其全水相制备方法与应用

1.本发明涉及农产品加工技术领域，尤其涉及一种多甲氧基黄酮及其全水相制备方法与应用。


背景技术：

2.芸香科柑橘属植物果实富含黄酮类物质，其中多甲氧基黄酮(polymethoxyflavones，pmfs)是该属植物特有，在成熟果实的橘皮和橘油中含量最高。
3.目前，pmfs常用的制备流程为“醇提-树脂富集-快速制备色谱纯化”，其中树脂富集是关键步骤，所用填料多为硅胶、大孔吸附树脂、凝胶和c18等，该方法虽然具有广适性，但是该方法的溶剂消耗大、环境污染严重、工艺复杂、产品损失大限制了工业化应用。现有技术亦有尝试寻找一种环境友好、富集高效、成本低廉的pmfs富集技术代替树脂法。如：cn105712965b中公开了枳实或陈皮经粉碎、醇提、多次回流提取、溶媒萃取、二次溶媒萃取、活性炭脱色、乙醇溶解、结晶制备橘皮素、川陈皮素，含量大于95％。该方法虽然避免了使用树脂，也减少了溶剂消耗量，但并未完全摒弃有机溶剂的使用。
4.因此，开发和建立一种环境友好、成本低廉、工艺简单、经济环保、全水相富集制备pmfs的方法，对pmfs功能挖掘和柑橘产业高质量发展具有重要的研究价值。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种多甲氧基黄酮及其全水相制备方法与应用。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
7.本发明提供了一种全水相制备多甲氧基黄酮的方法，包括如下步骤：
8.(1)将柑橘属植物的带皮全果或果皮与水混合，粉碎，离心，收集液相组分得到中间液；
9.(2)将所述中间液与活性酵母溶液混合，酶解20～28h，得到酶解液；
10.(3)将所述酶解液与盐酸混合，酸解9～11h后，离心取沉淀；
11.(4)将所述沉淀与乙醇溶液混合，浸提2～4次，合并浸提液，浓缩，得到多甲氧基黄酮；
12.所述中间液与活性酵母溶液的体积比为1：1.5～2.5；
13.所述沉淀与乙醇溶液的质量体积比为1g：1～2ml。
14.作为优选，步骤(1)所述柑橘属植物为蜜桔、瓯柑、橙子和柑橘中的一种或几种；
15.所述柑橘属植物的带皮全果或果皮与水混合时的质量体积比为1g：0.5～1ml；
16.所述柑橘属植物的带皮全果或果皮与水混合前，置于80～100℃水中进行浸泡处理；所述浸泡处理的时间为8～12min。
17.作为优选，步骤(1)所述离心的转速为8000～12000rpm；步骤(1)所述离心的时间为9～11min。
18.作为优选，步骤(2)所述活性酵母溶液通过将活性干酵母、葡萄糖与水混合、活化
获得，所述活化的温度为38～42℃，所述活化的时间为50～70min；
19.所述活性干酵母、葡萄糖与水混合的质量体积比为8～10g：5～7g：95～105ml。
20.作为优选，步骤(2)所述酶解的温度为38～42℃。
21.作为优选，步骤(3)所述酸解时盐酸的加入体积与活性酵母溶液加入体积比为1:1～2；
22.所述盐酸的浓度为0.8～1.2mmol/l；
23.所述酸解的温度为60～80℃。
24.作为优选，步骤(4)所述乙醇溶液的浓度为90～100vt％；
25.每次浸提的时间为10～20min。
26.本发明还提供了所述的方法制备得到的多甲氧基黄酮。
27.本发明还提供了所述的多甲氧基黄酮在制备食品、保健品或单体化合物中的应用。
28.本发明还提供了所述的多甲氧基黄酮在制备抑制肿瘤的药物中的应用。
29.本发明提供了一种多甲氧基黄酮及其全水相制备方法与应用。本发明的方法与现有技术的方法相比具有如下优点：
30.(1)本发明提供了一种全水相制备柑橘多甲氧基黄酮的绿色方法，该方法不使用树脂、不使用有机溶剂、环保安全、工艺简单、成本低廉，本方法制备的多甲氧基黄酮富集程度高，便于后续的纯化。
31.(2)本方法制备的多甲氧基黄酮属于药食同源成分，可作为添加成分制备食品、保健品和药物，用于肿瘤相关疾病的防治。
32.(3)按照本发明的方法可以制备得到相对含量为65％以上的多甲氧基黄酮，并且得到的多甲氧基黄酮对人肺癌a549细胞、人结肠癌hct116细胞、人前列腺癌du145细胞、人黑色素瘤sk-mel-1细胞、人肝癌hepg2细胞以及人乳腺癌细胞mcf-7均有抑制作用。
附图说明
33.图1为高效液相分析不同方法制备得到的多甲氧基黄酮样品中的主要成分(其中，从上到下分别代表多甲氧基黄酮标准品、蜜桔整果粉碎离心后上清液的组分、对比例1的样品、对比例2的样品、实施例1的样品)。
34.图2为高效液相分析实施例1制备多甲氧基黄酮单体化合物(其中，从上到下分别代表实施例1的样品、制得橘皮素样品、制得川陈皮素样品)
具体实施方式
35.本发明提供了一种全水相制备多甲氧基黄酮的方法，包括如下步骤：
36.(1)将柑橘属植物的带皮全果或果皮与水混合，粉碎，离心，收集液相组分得到中间液；
37.(2)将所述中间液与活性酵母溶液混合，酶解20～28h，得到酶解液；
38.(3)将所述酶解液与盐酸混合，酸解9～11h后，离心取沉淀；
39.(4)将所述沉淀与乙醇溶液混合，浸提2～4次，合并浸提液，浓缩，得到多甲氧基黄酮；
40.所述中间液与活性酵母溶液的体积比为1：1.5～2.5；
41.所述沉淀与乙醇溶液的质量体积比为1g：1～2ml。
42.在本发明中，步骤(1)所述柑橘属植物为蜜桔、瓯柑、橙子和柑橘中的一种或几种；所述柑橘属植物的带皮全果或果皮与水混合时的质量体积比为1g：0.5～1ml，优选为1g：0.75ml；所述柑橘属植物的带皮全果或果皮与水混合前，置于80～100℃水中进行浸泡处理；所述浸泡处理的时间为8～12min；所述浸泡的水温优选为90℃，所述浸泡的时间优选为9min。在本发明中，步骤(1)所述离心的转速为8000～12000rpm，优选为10000rpm；步骤(1)所述离心的时间为9～11min，优选10min。
43.在本发明中，步骤(2)所述活性酵母溶液通过将活性干酵母、葡萄糖与水混合、活化获得，所述活化的温度为38～42℃，所述活化的时间为50～70min；所述活化的温度优选为40℃，所述活化的时间优选为60min；所述活性干酵母、葡萄糖与水混合的质量体积比为8～10g：5～7g：95～105ml，优选为9g：6g：100ml。在本发明中，所述中间液与活性酵母溶液的体积比优选为1：2。在本发明中，步骤(2)所述酶解的温度为38～42℃，优选为40℃，所述酶解的时间优选为24h。
44.在本发明中，步骤(3)所述酸解时盐酸的加入体积与活性酵母溶液加入体积比为1:1～2；优选为1:1.5；所述盐酸的浓度为0.8～1.2mmol/l，优选为1.0mmol/l；所述酸解的温度为60～80℃，优选为70℃；所述酸解的时间优选为10h。在本发明中，步骤(3)所述离心的转速为8000～12000rpm，优选为10000rpm；步骤(3)所述离心的时间为9～11min，优选10min。在本发明中，步骤(3)还包括对所述沉淀进行水洗、离心、干燥步骤。
45.在本发明中，步骤(4)所述乙醇溶液的浓度为90～100vt％，优选为95vt％；每次浸提的时间为10～20min，优选为15min。在本发明中，所述沉淀与乙醇的质量体积比优选为1g：1.5ml。
46.本发明还提供了所述的方法制备得到的多甲氧基黄酮。
47.本发明还提供了所述的多甲氧基黄酮在制备食品、保健品或单体化合物中的应用。
48.本发明还提供了所述的多甲氧基黄酮在制备抑制肿瘤的药物中的应用。
49.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
50.实施例1
51.取新鲜成熟蜜桔76.0g，放置500ml 80℃水中浸泡10min，捞出加入100ml自来水粉碎，12000rpm，离心9min去渣，得85ml中间液，在所述中间液中加入170ml活性酵母溶液，40℃酶解24h，静置冷却至室温后，加入170ml浓度为0.8mmol/l的盐酸溶液，80℃，酸解10h，静置冷却至室温，在10000rpm条件下，离心15min，收集沉淀，将所述沉淀用水洗涤3次，离心，干燥后，在所述沉淀中加入按1g：2ml的量加入浓度为90vt％的乙醇30ml，浸提3次，每次浸提20min，合并浸提液，减压浓缩，干燥，称重得到多甲氧基黄酮0.1582g。
52.所述活性酵母溶液的配置方法为：取27g活性干酵母、18g葡萄糖与300ml水混合，在40℃条件下活化60min，得到活性酵母溶液。
53.实施例2
54.取新鲜成熟橙子92.2g，放置500ml100℃水中浸泡8min，捞出加入50ml自来水粉
碎，8000rpm条件下离心11min，去渣，得100ml中间液，在所述中间液中加入150ml活性酵母溶液，38℃酶解28h，静置冷却至室温后，加入150ml浓度为1mmol/l的盐酸溶液，60℃，酸解11h，静置冷却至室温，8000rpm条件下离心11min，收集沉淀，将所述沉淀用水洗涤3次，离心，干燥后，在所述沉淀中加入按1g：1ml的量加入浓度为99vt％的乙醇17ml，浸提3次，每次浸提10min，合并浸提液，减压浓缩，干燥，称重得到多甲氧基黄酮0.1614g。
55.所述活性酵母溶液的配置方法为：取30g活性干酵母、15g葡萄糖与315ml水混合，在38℃条件下活化70min，得到活性酵母溶液。
56.实施例3
57.取新鲜成熟橙子96.7g，放置500ml90℃水中浸泡9min，捞出取皮20g，加入20ml自来水粉碎，10000rpm离心10min去渣，得16ml中间液，在所述中间液中加入32ml活性酵母溶液，42℃酶解20h，静置冷却至室温后，加入32ml浓度为1.2mmol/l的盐酸溶液，70℃，酸解10h，静置冷却至室温，在10000rpm条件下离心10min，收集沉淀，将所述沉淀用水洗涤3次，离心，干燥后，在所述沉淀中加入按1g：2ml的量加入浓度为99vt％的乙醇5ml，浸提4次，每次浸提15min，合并浸提液，减压浓缩，干燥，称重得到多甲氧基黄酮0.0858g。
58.所述活性酵母溶液的配置方法为：取24g活性干酵母、21g葡萄糖与285ml水混合，在42℃条件下活化50min，得到活性酵母溶液。
59.对比例1
60.按照实施例1的方法设置本对比例1的方法，与实施例1不同的是，本对比例1的方法中不包括酸解步骤，最终得到的多甲氧基黄酮的质量为0.0717g。
61.对比例2
62.按照实施例1的方法设置本对比例2的方法，与实施例1不同的是，本对比例2的方法中不包括酶解步骤，最终得到的多甲氧基黄酮的质量为0.0113g。
63.实验例1
64.将实施例1和对比例1～2所制得的多甲氧基黄酮样品进行高效液相色谱分析，以多甲氧基黄酮标准品和蜜桔整果粉碎离心后得到的上清液中的成分为对照。分析条件为：流动相为甲醇/水，从10％甲醇10min梯度洗脱到75％甲醇，20min梯度洗脱到100％甲醇；检测波长254nm；流速1ml/min；进样量10μl；色谱柱为inertsustainaq-c18，5μm，4.6
×
250mm(up)；色谱仪为岛津lc-2030c 3d plus。高效液相色谱仪分析图谱如图1所示。所述多甲氧基黄酮标准品来源于上海源叶生物科技有限公司。
65.图1显示，蜜桔整果粉碎、离心后的上清，主要成分为黄酮和黄酮苷；经过实施例1酶解和酸解联合富集，可以得到相对含量为67％的多甲氧基黄酮；对比例1不经过酸解处理，得到的多甲氧基黄酮的相对含量为53％；对比例2不经过酶解处理，得到的主要成分为黄酮和黄酮苷。
66.应用实施例1
67.将实施例1～3，对比例1～2制备得到的多甲氧基黄酮与人乳腺癌mcf-7细胞进行共孵育，具体方法为：将人乳腺癌mcf-7细胞接种在含有10％胎牛血清的dmem培养基中，在培养基中加入100units/ml青霉素和100mg/ml链霉素，置于37℃、5％co2培养箱中培养。以每孔5000个细胞接种到96孔板过夜，然后加入浓度为0.25mg/ml多甲氧基黄酮共孵育72h。采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法，检测人乳腺癌细胞mcf-7增殖曲线。具体方法为：
取对数生长期的细胞，经0.25％胰蛋白酶消化，用含10％胎牛血清的rpmi 1640培养基配制细胞悬液，接种于96孔板，培养24h。将待测样品用dmso溶解后，用培养基稀释成不同浓度梯度。阴性对照组为等体积的培养基，培养72h后，加10μlmtt溶液，37℃、5％co2培养4h。取出96孔板，吸掉培养基上清液。加入dmso，振荡10min，使dmso完全溶解mtt反应的产物。用酶标仪读取490nm波长下的od值，结果重复三次，取平均值。计算细胞增殖抑制率(％)＝(a
空白-a
实验
)/a
空白
×
100％，以各化合物浓度与其对应的系列细胞增殖抑制率为变量，分别进行回归分析，计算半抑制浓度，以ic
50
值表示。结果如表1所示。
68.所述人乳腺癌mcf-7细胞的来源为购自武汉普诺赛生命科技有限公司。
69.表1本发明的方法制备得到的多甲氧基黄酮对人乳腺癌mcf-7细胞增殖活性的影响
70.样品名称ic
50
(mg/ml)实施例1样品0.21实施例2样品0.056实施例3样品0.060对比例1样品0.45对比例2样品17.81
71.表1显示，实施例1～3得到的多甲氧基黄酮对人乳腺癌细胞mcf-7的半数抑制浓度ic
50
值分别为0.21、0.056、0.060mg/ml，而对比例1～2得到的多甲氧基黄酮对人乳腺癌细胞mcf-7的半数抑制浓度ic
50
值分别为0.45、17.81mg/ml。实施例1与对比例1的区别在于，实施例1获得的多甲氧基黄酮的含量高于对比例1，能增加对癌细胞的抑制活性。实施例1与实施例2的区别在于，不同柑橘品种中，多甲氧基黄酮组成和含量也不一致，经分析，橙子中多甲氧基黄酮含量和组分明显高于蜜桔。实施例2和实施例3的实验材料均为橙子，因此得到的抑制效果抑制。
72.应用实施例2
73.按照应用实施例1的方法，将实施例1得到的多甲氧基黄酮与人肺癌a549细胞、人结肠癌hct116细胞、人前列腺癌du145细胞、人黑色素瘤sk-mel-1细胞、人肝癌hepg2细胞共孵育，检测实施例1的多甲氧基黄酮对人肺癌a549细胞、人结肠癌hct116细胞、人前列腺癌du145细胞、人黑色素瘤sk-mel-1细胞、人肝癌hepg2细胞抑制活性的影响。结果得到多甲氧基黄酮对人肺癌a549细胞、人结肠癌hct116细胞、人前列腺癌du145细胞、人黑色素瘤sk-mel-1细胞、人肝癌hepg2细胞的半数抑制浓度ic
50
值为0.06～0.44mg/ml。结果如表2所示。
74.所述人肺癌a549细胞、人结肠癌hct116细胞、人前列腺癌du145细胞、人黑色素瘤sk-mel-1细胞、人肝癌hepg2细胞均购自武汉普诺赛生命科技有限公司。
75.表2本发明的方法制备得到的多甲氧基黄酮对多种癌细胞增殖活性的影响
76.细胞株ic
50
(mg/ml)人肺癌a549细胞0.11人结肠癌hct116细胞0.06人前列腺癌du145细胞0.18人黑色素瘤sk-mel-1细胞0.44人肝癌hepg2细胞0.24
77.表2所示，本发明的方法制备得到的多甲氧基黄酮对人肺癌a549细胞、人结肠癌hct116细胞、人前列腺癌du145细胞、人黑色素瘤sk-mel-1细胞、人肝癌hepg2细胞均具有抑制作用。
78.应用实施例3
79.将实施例1得到的多甲氧基黄酮中加入5倍浓度为90vt％的乙醇，80℃下充分溶解，过滤，滤液放置4℃下结晶，过滤得单体化合物，hplc分析单体化合物及其含量；结晶后的母液浓缩至2倍体积，加热至80℃下充分溶解，放置4℃下结晶，过滤得单体化合物，hplc分析单体化合物及其含量。结果如图2所示。
80.图2显示，实施例1得到的多甲氧基黄酮，乙醇溶解经重结晶操作，制得橘皮素，其含量为89.4％，结晶后的母液经二次结晶操作，制得川陈皮素，其含量为90.6％。
81.由以上实施例可知，本发明提供了一种多甲氧基黄酮及其全水相制备方法与应用。本发明提供了一种多甲氧基黄酮及其全水相制备方法与应用。本发明的方法不使用树脂、不使用有机溶剂、环保安全、工艺简单、成本低廉，本方法制备的多甲氧基黄酮富集程度高，便于后续针对单体化合物的纯化。按照本发明的方法可以制备得到相对含量为65％以上的多甲氧基黄酮，并且得到的多甲氧基黄酮对人肺癌a549细胞、人结肠癌hct116细胞、人前列腺癌du145细胞、人黑色素瘤sk-mel-1细胞、人肝癌hepg2细胞以及人乳腺癌细胞mcf-7均有抑制作用。
82.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。