一种产γ-亚麻酸的基因工程菌株、其构建方法及其应用

一种产
γ-亚麻酸的基因工程菌株、其构建方法及其应用
技术领域
1.本发明属于生物工程技术领域，涉及解脂耶氏酵母工程菌株，具体地说是一种产γ-亚麻酸的基因工程菌株、其构建方法及其应用。


背景技术：

2.γ-亚麻酸(γ-linolenic acid，gla，c18:3
δ6,δ9,δ12
)，具有广泛的生理活性和明显的药理作用，在医疗、美容、化妆品等领域被广泛应用。目前国内外生产的γ-亚麻酸主要来源于柳叶科月见草(oenothera biennis)，但是从植物中提取γ-亚麻酸受到诸多因素的限制，比如，植物的生长周期长，占地面积大，且受到自然条件的限制，油含量不稳定等，因此难以满足人们日益增长的市场需求。
3.微生物发酵法不受季节限制、可大规模生产、产量稳定、质量可靠、发酵所用的材料来源广泛、价格低廉等优势，目前应用解脂耶氏酵母(yarrowialipolytica)是多不饱和脂肪酸生产的研究热点。鉴于解脂耶氏酵母中天然存在的脂肪酸为十八碳二烯酸(la，c18:2)，故以解脂耶氏酵母发酵生产γ-亚麻酸需要外源引入δ6去饱和酶基因，其机理参见图1。
4.常规解脂耶氏酵母发酵生产多不饱和脂肪酸通常以葡萄糖为碳源，成本高，这限制了其在工业生产中的应用。废弃食用油中包含棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸等长链脂肪酸，目前废弃食用油主流的处理方式通常会对环境以及水质造成负面影响，并且造成资源的浪费。然而解脂耶氏酵母可以利用体内的β-氧化途径可以将长链脂肪酸降解为中链脂肪酸(如己酸、辛酸和癸酸等)，作为发酵碳源进一步被利用。
5.以废弃食用油为唯一碳源的培养基中，酵母生长量较低，发酵产物的产量较低，难以满足工业化生产的需求，因此构建一株可以在废弃食用油为唯一碳源的培养基中生长良好、产γ-亚麻酸量高的工程解脂耶氏酵母，具有良好的应用前景。


技术实现要素：

6.本发明的目的，旨在提供一种产γ-亚麻酸的基因工程菌株，为应用解脂耶氏酵母商业化生产γ-亚麻酸提供有效途径；
7.本发明的另一目的，旨在提供上述产γ-亚麻酸的基因工程菌株的构建方法，以达到对该菌株简便、有效、精准构建的目标；
8.本发明还有一个目的，旨在提供上述生产γ-亚麻酸的基因工程菌株的一种应用，以废弃食用油作为唯一碳源，实现生产不受季节限制、成本相对低廉、更健康地合成γ-亚麻酸的目的；同时减轻市政污水管网的腐蚀、堵塞，防止废弃油脂流入社会造成危害，促进循环经济水平的提高。
9.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
10.一种产γ-亚麻酸的基因工程菌株，它是以解脂耶氏酵母yarrowialipolytica为出发菌株，表达δ6去饱和酶基因同时过表达pex4基因和pex5基因，该菌可以废弃食用油作
为唯一碳源生长。
11.作为对本发明的一种限定，所述δ6去饱和酶基因来源于高山被孢霉mortierella alpina，δ6去饱和酶基因序列如seq id no.1所示，具体为：
12.atggctgctgctcccagtgtgaggacgtttactcgggccgagattttgaatgccgaggccctgaatgagggcaagaaggatgccgaggcaccctttctgatgatcattgacaacaaggtgtacgatgtccgcgagtttgtccctgatcatcccggtggaagtgtgattctcacgcacgttggcaaggacggcactgacgtctttgacactttccaccccgaggctgcttgggagactcttgccaacttttacgttggtgatattgatgagagcgatcgtgccatcaagaatgatgactttgcggccgaggttcgcaagctgcgcaccttgttccagtcccttggctactacgactcgtccaaggcatactatgccttcaaggtctcgttcaacctctgcatctggggcttgtcgactttcattgttgccaagtggggccagacctcgaccctcgccaacgtgctctcggctgcgctcttgggtctcttctggcagcagtgcggatggttggcgcacgactttttgcaccaccaggtcttccaggaccgtttctggggtgatcttttcggcgccttcttgggaggtgtctgccagggtttctcgtcctcctggtggaaggacaagcacaacactcaccacgctgctcccaacgtccacggcgaggatcccgacattgacactcaccctctgttgacctggagtgagcatgctctggagatgttctcggatgttcctgacgaggagctgacccgtatgtggtcgcgcttcatggtcctcaaccagacctggttctacttccccattctctcgtttgcccgtctgtcctggtgcctccagtccattatgtttgttctgcccaacggtcaggcccacaagccctctggagcgcgtgtgcccatttcgttggtcgagcagctgtctctggctatgcactggacctggtacctcgccaccatgttcctgttcattaaggatcccgtcaacatgattgtgtactttttggtgtcgcaggctgtttgcggcaacttgttggcgattgtgttctcgctcaaccacaacggcatgcctgtgatctccaaggaggaagcggtcgatatggacttcttcaccaagcagatcatcacgggtcgtgatgttcaccctggtctgtttgccgactggttcacgggtggattgaactaccagattgagcaccacttgttcccttcgatgccccgccacaacttttcaaagatccagcctgctgtcgagactttgtgcaaaaagtacggtgtccgataccataccactggtatgatcgagggaactgcagaggtctttagccgtttgaacgaggtctccaaggcggcctccaagatgggtaaggcgcagtaa；
13.所述pex4基因和pex5基因来源于解脂耶氏酵母，所述pex4基因序列如seq id no.4所示，具体为：
14.atgatcaccccaaaccccgctaacgacattgtccatgacggcaagctctacgacaccttcactgagccccccaagctgatggctcaggagcgagctcagctggacttcgaccctagagacatcacctactttctggatggctctaaggaggagaccgagctgctggagtcgctcatgctcatgtacgagcgagaccctctcttcaacaaccagaacgagtacgatgaatcgtttgaaacactgcgagagcgatctgtgaagcgaattttccagctgtccaagtccatcgccatggaccccgagcccatgtctttccgaaagattgggttcctgggtattcttgacatgggaacgtatgctcgactgggagtccactacgcgctcttctgtaactccatccggggccagggaacccccgatcagctcatgtactggctggaccagggagccatggtcatcaagggcttctacggctgttttgccatgaccgaaatgggccatggatctaacctgtcgcgtctggaaaccatcgccactttcgacaaagagaccgacgaatttatcattaacacgccccacgttggagccacaaagtggtggattggaggagccgcccacactgctactcacacacttgcctttgcccgtcttcaagtagacggaaaggactacggtgtgaaatcgtttgtcgtacctctccgaaacctggacgaccattcgctgcgtcctggaatcgccacaggtgatattggtaagaagatgggtcgagatgccgttgacaacggctggattcagttcaccaacgtccgagtgccccgaaactacatgctcatgaagcataccaaggttcttcgagacggtaccgtcaagcagccgcctttggcccaactgacttacggatctctcatcactggacgagtccagatgaccactgactctcacaatgtgtccaaaaagttcctcaccattgccctgagatacgccaccatccgacgacagttctcgtcaactccaggagagcccgaaacccgactaattgactacctgtaccaccaaagacgactcctgcctcttatggcttactcttacgccatgaaactagctggagatcacgtccgagagctgttctttg
catcccaggagaaggctgagagcctcaaggaggacgacaaagccggagttgagtcttacgtccaggatatcaaggagctcttctctgtttctgctggtctcaaggctgccactacatgggcttgtgctgacatcattgacaaggcccgacaggcgtgtggaggccacggatactctgcctacaacggctttggacaggccttccaggactgggttgtccagtgcacttgggagggtgacaatactgttctgactctatctgccggccgagctctgatccaatctgctctcgtctaccgaaaggagggcaaactaggtaacgccacgaagtacctctctcggtccaaggagcttgccaacgccaagagaaacggacgatccctggaagaccccaagctgctcgtggaggcatgggaggctgtctctgccggtgctatcaacgctgctactgacgcttacgaggagctctccaagcagggagtttctgttgacgagtgctttgagcaggtgtcccaggagcgattccaggctgcccgaatccacactcgacgagctcttatcgaggccttctactcacgaatcgccactgctgatgagaaggtgaagcctcatctgatccctctggccaacctgtttgccctgtggtccattgaggaggactctgctctgttcctggctgagggctactttgagcctgaggatatcattgaggtgacttctcttgtcaacaagtactgcggaattgttcgaaagaacgttattggatacaccgatgccttcaacctgtccgactacttcatcaacgctgccattggacgatacgacggagacgtgtacaagaactactttgagaaggtcaaacagcagtaccctcctgagggtggcaagcctcactactacgaggatgtcatgaagcc；
15.所述pex5基因序列如seq id no.5所示，具体为：
16.atgaacaacaaccccaccaacgtgatccttggaggcaaggagtacgacaccttcaccgagcctccggcccagatggagctggagcgagccaagacacaattcaaggtccgagacgtgaccaacttcctcacaggcagcgagcaggagacactgctgaccgagcgaatcatgcgggagattgagcgagatcccgttctcaacgtcgccggcgactacgacgccgatcttcccaccaagcgacgacaagctgttgagcgaatcggggctctggcccgatacctgcccaaggattccgagaaggaggccattttgcgaggccagctgcatggtattgtggacatgggtacccgaacccgaatcgccgttcactacggtctgtttatgggcgccattcgtggctcaggaaccaaggagcagtacgattactgggtcgccaagggcgccgctactctgcacaaattctatggctgctttgccatgactgagctgggtcacggatctaacgtggccggtctcgagaccaccgccacccttgataaggacaccgacgagttcatcatcaacacccccaactcgggagccacaaagtggtggattggaggagctgcccactctgctacccacacggcttgtcttgcccgactcattgttgatggcaaggactatggtgttaagatcttcattgttcagctgcgagacctcaactcccactctctactcaacggtattgccattggagatatcggcaagaagatgggccgagatgccattgataatggttggatccagttcacagacgtccgaattccccgacagaacatgctcatgcgatacgaccgggtgtctcgagacggcgaggttaccacctccgagcttgcccagctcacctacggagcacttctgtctggccgagtgaccatgattgccgagtctcacctcctgtctgctcggttcctcaccattgctcttcggtacgcctgtatccgtcgacagttcggagctgtgcctgacaagcccgagactaagctcatcgactacccctaccaccaacgacgtctgctgcctcttctggcctacacctacgccatgaagatgggcgccgacgaggcccagcagcagtacaactcctcctttggcgctcttctcaagctcaaccccgtcaaggacgctgagaagtttgctgtcgccactgccgacctcaaggctctgtttgcctcttctgccggaatgaaggccttcaccacctgggctgccgccaagatcattgacgagtgccgacaggcctgtggtggccatggctactccggctacaacggtttcggtcaggcttacgccgactgggtcgtccaatgcacttgggagggtgacaacaacgtgctgtgtctgtccatgggtcgatcgctcatccagtcgtgcattgccatgagaaagaagaagggccatgtcggcaagtcggtcgagtacctgcagcgacgagacgagctgcagaatgcccgagttgacaacaagcctctcactgaccctgctgtgctcatcactgcatgggagaaggttgcctgcgaggccatcaacagagccactgactccttcatcaagctcacccaggagggtctgtctcctgaccaggcctttgaggagctgtctcaacagagatttgagtgtgcgcgaatccacacccgaaagcatctgatcacctcgttctacgctcgaatctccaaggccaaggcccgagtcaagccccaccttactgttcttgccaacctctttgccgtctggtccatcgaggaggactctggtctcttccttcgggagggctgcttcgagcctgccgagatggacgagatcaccgctctggtcgacgagctgtgctgcgaggctcgagagcaggtcat
tggattcaccgacgccttcaacctgtccgacttcttcattaacgcccccattggccgattcgacggagacgcctacaagcactacatggacgaggtcaaggctgccaacaaccctcgtaacacccatgctccttactacgagaccaagctgcgacc。
17.本发明还提供了上述菌株的一种构建方法，该方法包括以下步骤：
18.(1)解脂耶氏酵母工程菌株polf-001的构建
19.分别构建尿嘧啶营养缺陷型解脂耶氏酵母polf和重组质粒puc-intf3-δ6des，将重组质粒puc-intf3-δ6des转入尿嘧啶营养缺陷型的解脂耶氏酵母polf中，即得解脂耶氏酵母工程菌株polf-001；
20.(2)解脂耶氏酵母工程菌株polf-002的制备
21.将解脂耶氏酵母工程菌株polf-001接种于ypd-5foa固体培养基，待长出单菌落后，在ypd固体培养基中再次划线活化，得到解脂耶氏酵母工程菌株polf-002；
22.(3)重组质粒puc-scp2-pex4-5的构建
23.以puc-57-scp2质粒为骨架，在该质粒骨架上插入pex4基因表达盒和pex5基因表达盒，即得重组质粒puc-scp2-pex4-5；
24.(4)产γ-亚麻酸的基因工程菌株的构建
25.将重组质粒puc-scp2-pex4-5转入解脂耶氏酵母工程菌株polf-002，即得所述的产γ-亚麻酸的基因工程菌株。
26.作为一种限定，步骤(1)所述尿嘧啶营养缺陷型解脂耶氏酵母polf的构建方法为，通过crispr/cas9技术敲除解脂耶氏酵母po1f中的编码尿嘧啶基因；
27.步骤(1)所述重组质粒puc-intf3-δ6des的构建方法为，以带有尿嘧啶遗传标记的puc-57-intf3质粒为骨架，在该质粒骨架上插入δ6去饱和酶基因表达盒。
28.作为进一步限定，步骤(1)中，所述δ6去饱和酶基因表达盒启动子为来源于解脂耶氏酵母的p
yat
启动子、p
tef
启动子或p
fbain
启动子中的一种，终止子为来源于解脂耶氏酵母的t
xpr2t
终止子、t
lip2t
终止子和t
cyc1t
终止子中的一种。
29.步骤(3)中，所述pex4基因表达盒启动子为来源于解脂耶氏酵母的p
yat
启动子、p
tef
启动子和p
fbain
启动子中的一种，终止子为来源于解脂耶氏酵母的t
xpr2t
终止子、t
lip2t
终止子和t
cyc1t
终止子中的一种；
30.步骤(3)中，所述pex5基因表达盒启动子为来源于解脂耶氏酵母的p
yat
启动子、p
tef
启动子和p
fbain
启动子中的一种，终止子为来源于解脂耶氏酵母的t
xpr2t
终止子、t
lip2t
终止子和t
cyc1t
终止子中的一种。
31.本发明还提供了上述产γ-亚麻酸的基因工程菌株的一种应用，所述的产γ-亚麻酸的基因工程菌株可在以废弃食用油作为唯一碳源的培养基上发酵生产γ-亚麻酸。
32.作为对产γ-亚麻酸的基因工程菌株应用的一种限定，所述发酵包括以下步骤：
33.(1)’废弃食用油的预处理
34.废弃食用油经过滤，除去固体杂质，用蒸馏水洗涤3～4次，分层，取上层油液，进行灭菌；
35.(2)’种子液的制备
36.将所述产γ-亚麻酸的基因工程菌株进行活化，接种到ypd液体培养基，培养至对数生长期，获得种子液；
37.(3)’发酵生产γ-亚麻酸
38.按照体积比为5％～10％的比例将种子液接种到废弃油为唯一碳源的ynb发酵培养基中，在25～30℃、200～240rpm条件下，通风培养92～100h，获得发酵产物γ-亚麻酸。
39.作为对上述发酵的进一步限定，
40.步骤(1)’中，所述灭菌温度为105～115℃，灭菌时间为25～30min；
41.步骤(2)’中，所述种子液中活菌数为1.2
×
108～2.4
×
108cfu/ml；
42.步骤(3)’中，所述发酵培养中废弃油添加量为20～30g/l，ynb添加量为1.0～2.5g/l。
43.由于采用了上述技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
44.①
本发明通过分别构建含有尿嘧啶遗传标记的puc-intf3-δ6des和puc-scp2-pex4-5两个重组质粒再导入尿嘧啶营养缺陷型解脂耶氏酵母菌株中，以提高外源基因在插入过程的稳定性，进而提高工程菌株的稳定性；
45.②
本发明通过将工程菌株中间体接种于含5foa的固体培养基进行筛选，细胞丢除尿嘧啶，工程菌株中间体又变成尿嘧啶缺陷型菌株，实现尿嘧啶筛选标记的循环使用；
46.③
本发明构建的解脂耶氏酵母工程菌株可以在以废弃油作为唯一碳源的培养基中合成γ-亚麻酸，提供了一种具有不受季节限制、可大规模生产、产量稳定、质量可靠、发酵底物来源广泛、成本低廉等优势的γ-亚麻酸合成途径；
47.④
应用本发明构建的工程菌株进行发酵时以废弃食用油为发酵底物，不仅可提高微生物油脂的生产效率、显著降低油脂生产成本；还可变废为宝，减轻废弃食用油对市政污水管网的腐蚀、堵塞，防止废弃油脂流入社会造成危害，实现废弃食用油的资源化利用，促进循环经济水平的提高。
48.综上所述，本发明提供的一种产γ-亚麻酸的基因工程菌株、其构建方法和应用，在解脂耶氏酵母中表达来源于高山被孢霉的δ6去饱和酶基因，过表达β-氧化途径pex4基因和pex5基因，能够在以废弃食用油为唯一碳源的培养基上合成γ-亚麻酸，工程菌稳定性好、胞内油脂γ-亚麻酸含量高，合成途径不受季节限制、产量稳定、发酵底物成本低廉，并且可资源化利用废弃食用油。
49.本发明适用于构建产γ-亚麻酸的基因工程菌株，构建的工程菌株进一步应用于生产γ-亚麻酸。
附图说明
50.下面结合附图及具体实施例对本发明作更进一步详细说明。
51.图1为本发明背景技术中生产γ-亚麻酸的机理图；
52.图2为本发明实施例1中重组质粒puc-intf3-δ6des骨架图；
53.图3为本发明实施例1中重组质粒puc-scp2-pex4-5骨架图；
54.图4为本发明实施例2中工程菌株polf-001和工程菌株polf-003的生长情况图；
55.图5为本发明实施例3中γ-亚麻酸甲酯标准曲线图；
56.图6为本发明实施例3中工程菌株polf-003发酵后油脂的气相色谱图；
57.图7为本发明实施例3中工程菌株polf-001和工程菌株polf-003两菌株发酵后发酵液中油脂含量图；
58.图8为本发明实施例3工程菌株polf-001和工程菌株polf-003两菌株发酵后发酵液中γ-亚麻酸含量图。
具体实施方式
59.下面通过具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解所描述的实施例仅用于解释本发明，并不限定本发明。
60.本发明实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。
61.本实施例尽管采用解脂耶氏酵母作为出发菌株，但是常规的尿嘧啶营养缺陷型解脂耶氏酵母均能够作为出发菌株，用以转化，以进行实施例中的试验。
62.本技术所用的解脂耶氏酵母自身能够合成c16和c18长链脂肪酸，为此将来自高山被孢霉mortierella alpina的δ6去饱和酶转化至尿嘧啶营养缺陷型的解脂耶氏酵母po1f构建而成。
63.本技术所使用的废弃食用油中，亚油酸含量为4.9％。
64.实施例1构建用于生产γ-亚麻酸的基因工程菌株
65.1.尿嘧啶营养缺陷型的解脂耶氏酵母polf的构建
66.本部分为尿嘧啶营养缺陷型的解脂耶氏酵母polf的构建，该构建方法为：选自编码尿嘧啶的基因序列上下游分别1000bp作为同源臂，crispr/cas9技术敲除解脂耶氏酵母po1f中的编码尿嘧啶的基因序列，即得尿嘧啶营养缺陷型的解脂耶氏酵母polf。
67.具体构建方法参考按照journal of agricultural and food chemistry杂志2021年第69卷第46期，13831-13837页，论文名称为“harnessing yarrowia lipolytica peroxisomes as a subcellular factory for α-humulene overproduction”中记载的方法制得。
68.2.重组质粒puc-intf3-δ6des的构建
69.s1.合成优化后的来源于高山被孢霉mortierella alpina的δ6去饱和酶基因，得到密码子优化的δ6去饱和酶基因，其核苷酸序列如序列表seq id no.1所示。
70.s2.目标基因的扩增
71.s21.以步骤s1合成的δ6去饱和酶基因作为模板，以des6-f(核苷酸序列如seq id no.6所示)和des6-r(核苷酸序列如seq id no.7所示)为引物进行pcr扩增，得到扩增片段des6-a；
72.s22.以质粒puc-huh-fy为模板，以yat-f和yat-r基因为引物进行pcr扩增，得启动子pyat，其基因序列如seq id no.2所示；
73.s23.以质粒puc-huh-fy为模板，以cy-f和cy-r基为引物进行pcr扩增，得终止子tcyc1t，其基因序列如seq id no.3所示；
74.其中pcr的程序如下：98℃变性10s，56℃退火10s，72℃延伸1min(延伸时间＝目标片段长度/1kb，单位min)，重复35个循环。
75.s3.通过bamh1酶将带有尿嘧啶遗传标记的puc-57-intf3质粒进行酶切，将上述三个扩增出来的基因连入酶切后的puc-57-intf3质粒骨架，采用clonexpress multis one step cloning kit进行一步克隆，构建出带有尿嘧啶遗传标记的重组质粒puc-intf3-δ
6des；
76.s4.用axypreptm dna gelextraction kit(购自康宁生命科学有限公司公司)纯化回收各片段；
77.s5.将环状的重组质粒转化至大肠杆菌dh5a感受态细胞，通过氨苄抗性的平板筛选并通过菌落pcr及测序验证，即得阳性重组质粒puc-intf3-δ6des，重组质粒puc-intf3-δ6des质粒的骨架图如图2所示。
78.其中，
①
des6-f基因序列如seq id no.6所示，具体为：
79.gagtataagaatcattcaaaatggctgctgctcccagtgt
80.②
des6-r基因序列如seq id no.7所示，具体为：
81.tgacataactaattacatgattactgcgccttacccatct
82.③
p
yat
启动子的基因序列如seq id no.2所示，具体为：
83.gtacgtagcaacaacagtgtacgcagtactatagaggaacaattgccccggagaagacggccaggccgcctagatgacaaattcaacaactcacagctgactttctgccattgccactaggggggggcctttttatatggccaagccaagctctccacgtcggttgggctgcacccaacaataaatgggtagggttgcaccaacaaagggatgggatggggggtagaagatacgaggataacggggctcaatggcacaaataagaacgaatactgccattaagactcgtgatccagcgactgacaccattgcatcatctaagggcctcaaaactacctcggaactgctgcgctgatctggacaccacagaggttccgagcactttaggttgcaccaaatgtcccaccaggtgcaggcagaaaacgctggaacagcgtgtacagtttgtcttagcaaaaagtgaaggcgctgaggtcgagcagggtggtgtgacttgttatagcctttagagctgcgaaagcgcgtatggatttggctcatcaggccagattgagggtctgtggacacatgtcatgttagtgtacttcaatcgccccctggatatagccccgacaataggccgtggcctcatttttttgccttccgcacatttccattgctcggtacccacaccttgcttctcctgcacttgccaaccttaatactggtttacattgaccaacatcttacaagcggggggcttgtctagggtatatataaacagtggctctcccaatcggttgccagtctcttttttcctttctttccccacagattcgaaatctaaactacacatcacacaatgcctgttactgacgtccttaagcgaaagtccggtgtcatcgtcggcgacgatgtccgagccgtgagtatccacgacaagatcagtgtcgagacgacgcgttttgtgtaatgacacaatccgaaagtcgctagcaacacacactctctacacaaactaacccagctcttc
84.④
t
cyc1t
终止子的基因序列如seq id no.3所示，具体为：
85.tcatgtaattagttatgtcacgcttacattcacgccctccctccacatccgctctaaccgaaaaggaaggagttagacaacctgaagtctaggtccctatttatttttttatagttatgttagtattaagaacgttatttatatttcaaatttttcttttttttctgtacagacgcgtgtacgcatgtaacattatactgaaaaccttgcttgagaaggttttgggacgctcgaaggctttaatttgc；
86.其中pcr反应中所用pcr酶为takara的primestar maxdna聚合酶，pcr扩增体系如表1所示，bamh1酶切体系如表2所示，一步克隆的体系如表3所示。
87.表1 pcr扩增体系
88.试剂使用量primestar max(2
×
)25μl引物des6-f2μl引物des6-r2μl模板1μlddh2o20μl
89.表2 puc-57-intf3质粒酶切体系
90.组分重组反应质粒载体2μgbamh1酶2μl10xqcut buffer5μlddh2oto50μl
91.表3一步克隆体系
92.组分重组反应线性化载体xμln个插入片段y1 y2
…
ynμl2
×
clonexpress mix5μlddh2oto 10μl
93.x＝(0.02
×
克隆载体碱基对数)ng(0.03pmol)
94.y＝(0.02
×
每个片段碱基对数)ng(0.03pmol)
95.3.解脂耶氏酵母工程菌株polf-001的构建
96.本部分为表达δ6去饱和酶基因的解脂耶氏酵母基因工程菌株的构建方法，包括依次进行的以下步骤：
97.s1.尿嘧啶营养缺陷型解脂耶氏酵母po1f的活化
98.取5μl本实施例第2部分得到的尿嘧啶营养缺陷型工程菌株划线于ypd固体培养基进行活化，待长出单菌落；
99.s2.尿嘧啶营养缺陷型解脂耶氏酵母po1f感受态的制备
100.挑取单菌落至5ml的ypd液体培养基中，于28℃、220rpm的摇床中，培养至菌液在600nm处的吸收值为0.8～1.0；
101.取1ml菌液，于4℃，4000rpm离心3min，收集菌体，按照酵母转化试剂盒frozen-ez y east transformation iitm的操作方法进行感受态的制备，具体方法为：用1ml ez1重悬，4℃，4000rpm离心3min再次收集菌体；弃上清液，用100μl ez2悬浮菌体，每份50μl分装，于-80℃保存，得解脂耶氏酵母po1f感受态细胞；
102.s3.解脂耶氏酵母po1f-001的构建
103.将保存于-80℃的解脂耶氏酵母po1f感受态细胞取出，置于冰上10min；将1μg实施例2获得的带有尿嘧啶遗传标记的重组质粒puc-intf3-δ6des加入解脂耶氏酵母po1f感受态细胞中，轻轻吹打混匀，再加入500μl ez3混匀，于28℃、220rpm的摇床中孵育60min，涂布于ynb固体培养基进行筛选，挑选阳性菌株即为工程菌株polf-001，
104.其中，ypd固体培养基配比表见表4；
105.ypd液体培养基配比表见表5；
106.ynb固体培养基配比表见表6。
107.表4 ypd固体培养基配比表
108.名称酵母膏蛋白胨葡萄糖琼脂含量(g/l)10202020
109.表5 ypd液体培养基配比表
110.名称酵母膏蛋白胨葡萄糖含量(g/l)102020
111.表6 ynb固体培养基配比表
112.名称ynb(无氨基酸和硫酸铵)硫酸铵葡萄糖琼脂含量(g/l)1.752020
113.4.重组质粒puc-scp2-pex4-5的构建
114.s1.目的基因片段的扩增
115.s11.参照酵母基因组dna提取试剂盒说明书中的方法提取解脂耶氏酵母po1f的全基因组dna(试剂盒购买自生工生物工程上海有限公司)；
116.s12.以基因组dna为模板，利用引物pex4-f和pex4-r为引物进行pcr扩增，得到扩增片段pex4；
117.s13.以基因组dna为模板，利用引物pex5-f和pex5-r为引物进行pcr扩增，得到扩增片段pex5；
118.s14.以质粒puc-huh-fy为模板，以yat-f和yat-r基为引物进行pcr扩增，得到启动子p
yat
；
119.s15.以解脂耶氏酵母基因组为模板，以cy-f和cy-r基为引物进行pcr扩增，得到终止子t
cyc1t
；
120.其中pcr扩增所用酶及体系同表1，pcr的程序如下：98℃变性10s，56℃退火10s，72℃延伸1min(延伸时间＝目标片段长度/1kb，单位min)，重复35个循环。
121.s2.重组质粒puc-scp2-pex4的构建
122.s21.通过ecor1酶将带有尿嘧啶遗传标记的质粒puc-57-scp2进行酶切，将pex4、启动子pyat、密码子tcyc1t的扩增片段连入酶切后的puc-57-scp2质粒骨架，采用clonexpress multis one step cloning kit进行一步克隆，构建出重组质粒puc-scp2-pex4；
123.s22.用axypreptm dna gel extraction kit(购自康宁生命科学有限公司)纯化回收各片段；
124.s23.将环状的重组质粒转化大肠杆菌dh5a感受态细胞，通过氨苄抗性的平板筛选并通过菌落pcr及测序验证，即得阳性重组质粒puc-scp2-pex4。
125.s3.重组质粒puc-scp2-pex4-5的构建
126.s31.通过paci酶将重组质粒puc-scp2-pex4进行酶切，将pex5、启动子pyat、密码子tcyc1t的扩增片段连入酶切后的puc-scp2-pex4质粒骨架，采用clonexpress multis one step cloning kit进行一步克隆，构建出重组质粒puc-scp2-pex4-5；
127.s32.用axypreptm dna gel extraction kit(购自康宁生命科学有限公司)纯化回收各片段；
128.s33.将环状重组质粒转化大肠杆菌dh5a感受态细胞，通过氨苄抗性的平板筛选并通过菌落pcr及测序验证，即得阳性重组质粒puc-scp2-pex4-5，该重组质粒带有尿嘧啶遗传标记，puc-scp2-pex4-5质粒的骨架图参见图3。
129.其中，
①
pex4-f的基因序列如seq id no.8所示，具体为：
130.ccctgattgactggaacagcatgatcaccccaaaccccgc
131.②
pex4-r的基因序列如seq id no.9所示，具体为：
132.tgacataactaattacatgaggcttcatgacatcctcgta
133.③
pex5-f的基因序列如seq id no.10所示，具体为：
134.gctcgaaggctttaatttgcatgaacaacaaccccaccaa
135.④
pex5-r的基因序列如seq id no.11所示，具体为：
136.acaagttccgtagttggatcggtcgcagcttggtctcgta；
137.其中，一步克隆的体系如表3所示，质粒puc-57-scp2的ecor1酶切的体系如表7所示，重组质粒puc-scp2-pex4的pac1酶切的体系如表8所示，具体步骤同重组质粒puc-intf3-δ6des的构建。
138.表7质粒puc-57-scp2酶切体系
[0139][0140][0141]
表8重组质粒puc-scp2-pex4酶切体系
[0142]
组分重组反应质粒载体2μgpac1酶2μl10x qcut buffer5μlddh2oto 50μl
[0143]
5.用于生产γ-亚麻酸的基因工程菌株的构建
[0144]
本部分为用于生产γ-亚麻酸的基因工程菌株的构建方法，包括依次进行的以下步骤：
[0145]
s1.工程菌株polf-001的活化
[0146]
取5μl上述得到的工程菌株polf-001划线于ypd-5foa固体培养基，在5foa的作用下，细胞丢除尿嘧啶，可实现筛选标记的循环使用，待长出单菌落后，在ypd固体培养基中再次划线活化，得到工程菌株polf-002；
[0147]
s2.工程菌株polf-002感受态的制备
[0148]
挑取单菌落至5ml的ypa液体培养基中，于28℃、220rpm的摇床中，培养至菌液在600nm处的吸收值为0.8～1.0；
[0149]
取1ml菌液，于4℃、4000rpm离心3min，收集菌体，按照酵母转化试剂盒frozen-ez y east transformation iitm的操作方法进行感受态的制备，具体方法为：用1ml ez1重悬，4℃、4000rpm离心3min再次收集菌体；弃上清液，用100μl ez2悬浮菌体，每份50μl分装，于-80℃保存，得工程菌株polf-002感受态细胞；
[0150]
s3.解脂耶氏酵母工程菌株po1f-003的构建
[0151]
将保存于-80℃的解脂耶氏酵母polf-002感受态细胞取出，置于冰上10min；将1μg第4部分获得的带有尿嘧啶遗传标记的重组质粒puc-scp2-pex4-5加入解脂耶氏酵母po1f-002感受态细胞中，轻轻吹打混匀，再加入500μl ez3混匀，于28℃、220rpm的摇床中孵育60min，涂布于ynb固体培养基进行筛选，挑选阳性菌株即为工程菌株polf-003，工程菌株polf-003即为产γ-亚麻酸的基因工程菌株。
[0152]
其中，ypd-5foa发酵培养基配比表见表9。
[0153]
表9 ypd-5foa固体培养基配比表
[0154][0155]
实施例2解脂耶氏酵母polf、工程菌株polf-001和工程菌株polf-003在以废弃油为唯一碳源培养基上的生长情况
[0156]
本实施例考察解脂耶氏酵母polf、实施例1构建的工程菌株polf-001和工程菌株polf-003在以废弃油为唯一碳源培养基上的生长情况，该方法包括依次进行的以下步骤：
[0157]
s1.活化
[0158]
取1ml活菌数为1.0*108cfu/ml的解脂耶氏酵母polf接种到10ml常规的ypd固体培养基中，于28℃、220rpm的摇床中，培养24h；
[0159]
取1ml活菌数为1.0*108cfu/ml的工程菌株po1f-001接种到10ml常规的ypd固体培养基中，于28℃、220rpm的摇床中，培养24h；
[0160]
取1ml活菌数为1.0*108cfu/ml的工程菌株po1f-003接种到10ml常规的ypd固体培养基中，于28℃、220rpm的摇床中，培养24h；
[0161]
s2.生长情况的测定
[0162]
将活化后的三种菌株分别接种到5ml ypd液体培养基，培养至对数生长期，获得种子液，取500μl种子液分别接种至废弃油为唯一碳源的发酵培养基中测试其生长od值，测定结果如图4所示。
[0163]
由图4可知，在生长状况方面，在废弃油为唯一碳源的培养基中，工程菌株po1f-003和工程菌株po1f-001都可以正常生长，且工程菌株po1f-003的生长情况比野生型菌株更好，证明其可以在废弃油为唯一碳源上正常生长。
[0164]
实施例3工程菌株polf-001和工程菌株polf-003在以废弃油为唯一碳源培养基上合成γ-亚麻酸的情况
[0165]
本实施例考察实施例1构建的工程菌株polf-001和工程菌株polf-003合成γ-亚麻酸的情况，目的在于考察过表达β-氧化途径的pex4基因和pex5基因的工程菌株在以废弃油为唯一碳源培养基发酵时对增加含油量的影响，该方法包括依次进行的以下步骤：
[0166]
s1.废弃食用油的预处理
[0167]
取废弃食用油1kg，经100目筛网粗滤、2.0μm的滤膜微滤，除去其中的固体杂质，用蒸馏水洗涤3次，除去其中的水溶性杂质，分层，取上层油液，在115℃下湿热灭菌0.5h。
[0168]
s2.种子液的制备
[0169]
分别将工程菌株polf-001和工程菌株polf-003单菌落接种到10ml常规的ypd固体培养基，培养24h，得一级种子；取一级种子接种到10mlypd培养基中，再次培养24h，得二级种子，即得种子发酵液，种子液活菌数为1.2
×
108～2.4
×
108cfu/ml。
[0170]
s3.工程菌株的发酵
[0171]
分别取两工程菌株种子发酵液，按体积比为5％～10％的接种量接种至1000ml废弃油为唯一碳源的ynb发酵培养基中，保证接入培养基的活菌数相同，分别于28℃、220rpm条件下，通风培养96h，获得发酵产物。
[0172]
其中，以废弃油为唯一碳源的ynb发酵培养基配比表见表10。
[0173]
表10以废弃油为唯一碳源的ynb发酵培养基配比表
[0174]
名称酵母粉ynb废弃油含量(g/l)2.51.725
[0175]
s4.发酵培养产物分析
[0176]
分别将上述得到的发酵产物固液分离，收集固体，得到油脂菌体，添加0.5％(v/v)的溶壁酶，55℃酶解1h后，加入30ml正己烷萃取，静置等待分层，取上层有机相液体，重复萃取后，挥干溶剂，分别测定总油脂；
[0177]
另分别取30μl上步所得油脂，将脂肪酸进行甲酯化：加入500μl的1mol/l的naoh的甲醇溶液，室温下以1200rpm离心30min；随后加入40μl硫酸和500μl色谱级正己烷提取脂肪酸甲酯；最后8000rpm离心2min，取上层通过微孔滤膜去杂质，注入气相色谱仪，分析、计算γ-亚麻酸含量。
[0178]
其中，气相色谱具体检测方法如下所示：
[0179]
检测条件：进样口温度100℃，进样体积1.0μl，分流比为69.8:1；
[0180]
色谱柱：db-23(60.0m
×
0.25mm
×
0.25μm)；
[0181]
色谱条件：初始温度为100℃,25℃/min升温至196℃。随后，2℃/min升温至220℃保温6min；
[0182]
检测器温度：280℃。
[0183]
用γ-亚麻酸甲酯标品进行定性定量，γ-亚麻酸甲酯标准曲线如图5所示；
[0184]
工程菌株polf-003发酵后油脂气相色谱图如图6所示；
[0185]
工程菌株polf-001和工程菌株polf-003两菌株发酵后发酵液中油脂含量图如图7所示；
[0186]
工程菌株polf-001和工程菌株polf-003两菌株发酵后发酵液中γ-亚麻酸含量图如图8所示。
[0187]
由图7可知，从发酵产物总油脂含量方面考虑，工程菌株po1f-003显著优于工程菌株po1f-001；由图8可知，从发酵产物的γ-亚麻酸含量来看，工程菌株po1f-003明显高于工程菌株po1f-001，工程菌株po1f-003发酵液中的γ-亚麻酸含量约为工程菌株po1f-001发酵液中的γ-亚麻酸含量的2倍。因此，工程菌株po1f-003比工程菌株po1f-001更适宜用作生产γ-亚麻酸的菌株。
[0188]
经计算，1l发酵液中工程菌株po1f-003的油脂含量达到1.2g，γ-亚麻酸占总脂肪酸的52.3％，即每1l餐厨废弃油可制得含52.3％γ-亚麻酸的油38.5g。
[0189]
实施例4-8产γ-亚麻酸的基因工程菌株在合成γ-亚麻酸中的应用
[0190]
实施例4-8分别为一种产γ-亚麻酸的基因工程菌株在合成γ-亚麻酸中的应用方法，它们的步骤与实施例3基本相同，本实施例以工程菌株polf-003为发酵菌株，不同之处在于以废弃油为唯一碳源的ynb发酵培养基各组分配比及不同步骤工艺参数的不同，不同实施例以废弃油为唯一碳源的ynb发酵培养基配比表具体详见表11，不同制备步骤各项工艺参数见表12。
[0191]
表11实施例4-8中以废弃油为唯一碳源的ynb发酵培养基配比表
[0192][0193]
表12实施例4-8中步骤工艺参数表
[0194][0195][0196]
实施例4-8应用产γ-亚麻酸的基因工程菌株合成γ-亚麻酸时，工程菌株的油脂含量及γ-亚麻酸占总脂肪酸的比例汇总表详见下表13。
[0197]
表13油脂含量及γ-亚麻酸占总脂肪酸的比例汇总表
[0198][0199]
从实验结果来看，25g/l的废弃油为底物时，油脂产量和γ-亚麻酸占总脂肪酸的
比例都较佳。灭菌温度和灭菌时间对于实验最后的含量影响较少；培养温度和转速对于菌株的生长产生一定的影响，解脂耶氏酵母在30℃，220rpm的转速下生长状态最佳。
[0200]
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。