一种产γ-亚麻酸的基因工程菌株、其构建方法及其应用

技术特征：
1.一种产γ-亚麻酸的基因工程菌株，其特征在于，它是以解脂耶氏酵母yarrowia lipolytica为出发菌株，表达δ6去饱和酶基因同时过表达pex4基因和pex5基因，该菌可以废弃食用油作为唯一碳源生长。2.根据权利要求1所述的一种产γ-亚麻酸的基因工程菌株，其特征在于，所述δ6去饱和酶基因来源于高山被孢霉mortierella alpina，δ6去饱和酶基因序列如seq id no.1所示；所述pex4基因和pex5基因来源于解脂耶氏酵母，所述pex4基因序列如seq id no.4所示，所述pex5基因序列如seq id no.5所示。3.一种权利要求1或2所述的产γ-亚麻酸的基因工程菌株的一种构建方法，其特征在于，该构建方法包括以下步骤：(1)解脂耶氏酵母工程菌株polf-001的构建分别构建尿嘧啶营养缺陷型解脂耶氏酵母polf和重组质粒puc-intf3-δ6des，将重组质粒puc-intf3-δ6des转入尿嘧啶营养缺陷型的解脂耶氏酵母polf中，即得解脂耶氏酵母工程菌株polf-001；(2)解脂耶氏酵母工程菌株polf-002的制备将解脂耶氏酵母工程菌株polf-001接种于ypd-5foa固体培养基，待长出单菌落后，在ypd固体培养基中再次划线活化，得到解脂耶氏酵母工程菌株polf-002；(3)重组质粒puc-scp2-pex4-5的构建以puc-57-scp2质粒为骨架，在该质粒骨架上插入pex4基因表达盒和pex5基因表达盒，即得重组质粒puc-scp2-pex4-5；(4)产γ-亚麻酸的基因工程菌株的构建将重组质粒puc-scp2-pex4-5转入解脂耶氏酵母工程菌株polf-002，即得所述的产γ-亚麻酸的基因工程菌株。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述尿嘧啶营养缺陷型解脂耶氏酵母polf的构建方法为，通过crispr/cas9技术敲除解脂耶氏酵母po1f中的编码尿嘧啶基因；步骤(1)所述重组质粒puc-intf3-δ6des的构建方法为，以puc-57-intf3质粒为骨架，在该质粒骨架上插入δ6去饱和酶基因表达盒。5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述δ6去饱和酶基因表达盒启动子为来源于解脂耶氏酵母的p
yat
启动子、p
tef
启动子或p
fbain
启动子中的一种，终止子为来源于解脂耶氏酵母的t
xpr2t
终止子、t
lip2t
终止子和t
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终止子中的一种。步骤(3)中，所述pex4基因表达盒启动子为来源于解脂耶氏酵母的p
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启动子、p
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启动子和p
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启动子中的一种，终止子为来源于解脂耶氏酵母的t
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终止子、t
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终止子和t
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终止子中的一种；步骤(3)中，所述pex5基因表达盒启动子为来源于解脂耶氏酵母的p
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启动子、p
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启动子和p
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启动子中的一种，终止子为来源于解脂耶氏酵母的t
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终止子、t
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终止子和t
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终止子中的一种。6.根据权利要求1或2所述的产γ-亚麻酸的基因工程菌株的一种应用，其特征在于，所
述的产γ-亚麻酸的基因工程菌株可在以废弃食用油作为唯一碳源的培养基上发酵生产γ-亚麻酸。7.根据权利要求6所述的一种产γ-亚麻酸的基因工程菌株的一种应用，其特征在于，所述发酵包括以下步骤：(1)’废弃食用油的预处理废弃食用油经过滤，除去固体杂质，用蒸馏水洗涤3～4次，分层，取上层油液，进行灭菌；(2)’种子液的制备将所述产γ-亚麻酸的基因工程菌株进行活化，接种到ypd液体培养基，培养至对数生长期，获得种子液；(3)’发酵生产γ-亚麻酸按照体积比为5％～10％的比例将种子液接种到废弃油为唯一碳源的ynb发酵培养基中，在25～30℃、200～240rpm条件下，通风培养92～100h，获得发酵产物γ-亚麻酸。8.根据7所述的产γ-亚麻酸的基因工程菌株的应用，其特征在于，步骤(1)’中，所述灭菌温度为105～115℃，灭菌时间为25～30min。9.根据7所述的产γ-亚麻酸的基因工程菌株的应用，其特征在于，步骤(2)’中，所述种子液中活菌数为1.2
×
108～2.4
×
108cfu/ml。10.根据7～9中任一项所述的产γ-亚麻酸的基因工程菌株的应用，其特征在于，步骤(3)’中，所述发酵培养中废弃油添加量为20～30g/l，ynb添加量为1.0～2.5g/l。

技术总结
本发明公开了一种产γ-亚麻酸的基因工程菌株、其构建方法及其应用，属于生物工程技术领域。本发明以解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica为出发菌株，表达Δ6去饱和酶基因同时过表达β-氧化途径的PEX4基因和PEX5基因；本发明构建的工程菌株可在以废弃食用油为唯一碳源的培养基上合成γ-亚麻酸。本发明的工程菌稳定性好、胞内油脂γ-亚麻酸含量高，合成途径不受季节限制、产量稳定、发酵底物成本低廉，并且可资源化利用废弃食用油。本发明适用于构建产γ-亚麻酸的基因工程菌株，构建的工程菌株进一步应用于生产γ-亚麻酸。亚麻酸。


技术研发人员：汪庆卓 刘云起 杜菲
受保护的技术使用者：南京师范大学
技术研发日：2022.04.18
技术公布日：2022/6/10