一种具有多功能特性的大豆肽粉的新型酶解提取法的制作方法

1.本发明涉及食品开发技术领域，尤其是涉及一种具有多功能特性的大豆肽粉的新型酶解提取法。


背景技术：

2.大豆肽为小分子的蛋白质，分子量段在5000以下，非常容易被人体吸收和利用。分子量段在50-2000之间的称为小肽、寡肽、低聚肽，一般普遍认为分子量在1000左右的小分子肽最好，这个分子量的大豆肽既能保证很好地被人体吸收，也可以保证肽的功能性与活性。2-10肽属于寡肽，10-50肽属于多肽，通常十肽以下者较具医药及商业实用性。
3.大豆肽具有降低血脂、提升免疫、美白护肤、抗癌、抗氧化性等功效，某些低分子肽类不仅能提供人体生长、发育所需的营养物质，且更易为人体所消化、吸收。但是迄今为止，结构改造后大豆蛋白改性产品的加工功能性质，例如乳化性等性质，尚未有具有很高商业价值的、可与酪蛋白酸钠等大分子乳化剂相媲美的高乳化性大豆肽产品。为了满足消费者对于天然、绿色食品的需要，适应人们追求营养、低脂、环保的要求，亟需开发一种健康、安全的一种多功能大豆肽粉。
4.随着国内酶学工业的发展和对大豆功能性成分越来越深入的研究，大豆肽作为一种新型的大豆深加工产品，必将得到进一步的开发利用，并蕴含着巨大的市场潜力。蛋白质的功能性质包括乳化性、起泡性、持水性和持油性等。酶法制备大豆多肽的工艺条件一般都比较温和，但因酶理化特性的差异，其反应条件受限制，目前的酶解法在酶解过程中酶容易失活和反应不彻底，使得到的产物中肽含量变低，影响大豆多肽的品质，因此实际生产中，需要开发一种新型酶解法制备大豆多肽。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种具有多功能特性的大豆肽粉的新型酶解提取法。本发明所提供的大豆肽的提取方法效率高，可重复利用，且制备的大豆肽得率高并具有优良的功能特性，具有极高的开发和利用价值。
6.本发明的技术方案如下：
7.一种具有多功能特性的大豆肽粉的新型酶解提取法，包括以下步骤：
8.(1)微流化处理大豆分离蛋白：将大豆分离蛋白溶解在去离子水中，然后使用微流化器在40-160mpa下对其进行微流化；随后，收集微流化的大豆分离蛋白样品；
9.(2)蛋白酶复合材料的合成：将咪唑-2-甲醛和聚乙烯吡咯烷酮混合，然后加入去离子水，使咪唑-2-甲醛和聚乙烯吡咯烷酮的质量浓度为5％-15％；将混合物在70-90℃下溶解3-6h，以获得澄清溶液；
10.将该溶液冷却至室温后，迅速向溶液中加入中性蛋白酶、风味蛋白酶、无花果蛋白酶、碱性蛋白酶混合均匀；
11.然后在混合溶液中加入1.5-3wt％的硝酸锌，静置，最后离心收集沉淀物并用去离
子水洗涤，最终获得蛋白酶复合材料；
12.(3)蛋白酶生物催化膜的制备：首先使用均质机将细菌纤维素加工成纤维素纳米纤维浆料；
13.然后将纤维素纳米纤维浆料、羧化多壁碳纳米管、步骤(2)制备的蛋白酶复合材料和十六烷基三甲基溴化铵混合为溶液；
14.最后，利用滤纸作为支撑层，通过真空过滤处理上述溶液，分离滤纸表面的膜，最终得到蛋白酶生物催化膜；
15.(4)酶膜反应器深度酶解：将步骤(3)得到的蛋白酶生物催化膜与酶膜反应罐联用，在酶膜反应罐中加入步骤(1)处理得到的微流化的大豆分离蛋白样品，将其置于恒温水浴锅中升温，打开蠕动泵，常压循环1-5min；然后，调节系统压力至0.1-0.5mpa，运行2-6h后，关闭蠕动泵；
16.(5)喷雾干燥制备大豆肽粉末：将步骤(4)处理后得到的酶解液离心处理，将离心后得上清液喷雾干燥，即得大豆肽粉。
17.优选的，步骤(1)所述的大豆分离蛋白的浓度为10-20％。
18.优选的，步骤(1)所述的微流化器采用型号为m-110eh的连续高剪切流体处理均质器，处理时间为10-60min。
19.优选的，步骤(2)中所述的唑-2-甲醛即ica和聚乙烯吡咯烷酮混合质量比例为8-12:1。
20.优选的，步骤(2)中加入的中性蛋白酶、风味蛋白酶、无花果蛋白酶、碱性蛋白酶分别为1-5wt％；加入上述蛋白酶后混合时间为5-20min。
21.优选的，步骤(2)中在混合溶液中加入硝酸锌后静置时间为8-15min。
22.优选的，步骤(3)中所述维素纳米纤维浆料、羧化多壁碳纳米管、步骤(1)制备的蛋白酶复合材料和十六烷基三甲基溴化铵即ctab的添加质量比为4-6:1-3:1:1。
23.优选的，步骤(3)中使用均质机将细菌纤维素加工成纤维素纳米纤维浆料时，均质机的转速为10000rmp-14000rpm、均质时间为1-5min；
24.所述羧化多壁碳纳米管的平均直径为2-8nm，平均长度为5-16μm。
25.优选的，步骤(4)中所述反应条件为ph：6-11，温度：40-60℃。
26.优选的，步骤(5)中所述离心转速为5000-10000rmp，离心20-60min，喷雾干燥温度为140-200℃，喷雾压力0.1-1mpa。
27.本发明有益的技术效果在于：
28.1、本发明利用微流化技术处理提高了大豆分离蛋白的溶解度，微射流能够改变蛋白质的物理化学及功能特性，从而提高蛋白的溶解性、乳化性、起泡性等特性。微射流作为一种有效的辅助酶解预处理方法，可以改变蛋白质结构并影响酶的切割位点，导致水解效率和产品性质的变化，微流化可大大提高了大豆分离蛋白的水解度。
29.2、使用复合材料用作固定生物大分子的基质，可以保护酶免受外部环境的影响，而有机骨架的固定甚至有利于增强酶的生物活性。本发明将有机骨架制成连续膜材料的形式，可以解决回收问题，采用环保纤维材料细菌纤维素，具有高柔韧性，强度和优异的生物相容性。生物催化膜的使用不仅可以使多种蛋白酶同时进行酶促反应，还可以提高蛋白酶的利用率，降低生产成本。
30.3、酶膜反应器是将酶催化反应和膜分离耦合在一起的装置，膜和生物化学反应相结合的系统或操作单元依靠酶的专一性、催化性及膜特有的功能集生物反应与反应产物的原位分离、浓缩和酶的回收利用于一体，能够改变反应过程、控制反应进程，从而实现减少副产物的生成、进而提高大豆肽得率。
31.4、本发明采用生物复合材料将多种蛋白酶制备成复合蛋白酶材料，提高了酶促反应效率及范围，然后将制备的复合蛋白酶材料合成生物催化膜，做到将复合蛋白酶反复利用，降低成本，最终联合酶膜反应器对大豆分离蛋白进行酶解，大大提高酶促反应进程，加大对大豆分离蛋白的酶解，提高大豆肽的转化率，最后利用喷雾干燥得到大豆肽粉末。
具体实施方式
32.下面结合实施例，对本发明进行具体描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
33.实施例1：
34.(1)微流化处理大豆分离蛋白：使用去离子水制备10％的大豆分离蛋白分散体。然后，使用m-110eh微流化器在40mpa下对其进行微流化，处理时间为60min。随后，收集微流化的大豆分离蛋白样品。
35.(2)蛋白酶复合材料的合成：将咪唑-2-甲醛和聚乙烯吡咯烷酮按照8:1的比例混合，然后加入去离子水，使咪唑-2-甲醛和聚乙烯吡咯烷酮的质量浓度为15％。将混合物在70℃下溶解3h，以获得澄清溶液；
36.溶液冷却至室温后，迅速向该溶液中分别加入1％的中性蛋白酶、风味蛋白酶、无花果蛋白酶、碱性蛋白酶混合5min。
37.然后，在溶液中加入1.5％的硝酸锌，静置10min。最后，离心收集沉淀物并用去离子水。最终获得蛋白酶复合材料。
38.(3)蛋白酶生物催化膜的制备：首先，使用均质机将细菌纤维素加工成纤维素纳米纤维浆料。然后按照4:1:1:1的质量比将纤维素纳米纤维浆料、羧化多壁碳纳米管、步骤(2)制备的蛋白酶复合材料和十六烷基三甲基溴化铵混合为溶液。
39.其中，均质机的型号为grx2000/4，转速为10000rmp，时间为5min；羧化多壁碳纳米管的平均直径为4nm，平均长度为10μm。
40.最后，利用滤纸作为支撑层，通过真空过滤处理混合物溶液，分离滤纸表面的膜，最终得到蛋白酶生物催化膜。
41.(4)酶膜反应器深度酶解：将步骤(3)得到的新型生物催化膜与酶膜反应罐联用，在酶膜反应罐中加入步骤(1)处理的微流化大豆分离蛋白溶液，将其置于恒温水浴锅中升温，调节ph至6，升温至40℃，打开蠕动泵，常压循环1min；然后，调节系统压力至0.1mpa，运行2h后，关闭蠕动泵；
42.(5)喷雾干燥制备大豆肽粉末：步骤(4)处理后的酶解液离心处理，转速为5000rmp，离心60min，将离心后得上清液喷雾干燥，干燥温度140℃，喷雾压力0.1mpa。
43.实施例2
44.(1)微流化处理大豆分离蛋白：使用去离子水制备15％的大豆分离蛋白分散体。然
后，使用m-110eh微流化器在100mpa下对其进行微流化，处理时间为30min。随后，收集微流化的大豆分离蛋白样品。
45.(2)蛋白酶复合材料的合成：将咪唑-2-甲醛和聚乙烯吡咯烷酮按照10:1的比例混合，然后加入去离子水，使咪唑-2-甲醛和聚乙烯吡咯烷酮的质量浓度为10％。将混合物在80℃下溶解4.5h，以获得澄清溶液；
46.溶液冷却至室温后，迅速向该溶液中分别加入2.5％的中性蛋白酶、风味蛋白酶、无花果蛋白酶、碱性蛋白酶混合15min。
47.然后，在溶液中加入2％的硝酸锌，静置10min。最后，离心收集沉淀物并用去离子水。最终获得蛋白酶复合材料。
48.(3)蛋白酶生物催化膜的制备：首先，使用均质机将细菌纤维素加工成纤维素纳米纤维浆料。然后按照5:2:1:1的质量比将纤维素纳米纤维浆料、羧化多壁碳纳米管、步骤(2)制备的蛋白酶复合材料和十六烷基三甲基溴化铵混合为溶液。
49.其中，均质机的均质机的型号为grx2000/4，转速为12000rmp，时间为2.5min化多壁碳纳米管的平均直径为5nm，平均长度为12μm。
50.最后，利用滤纸作为支撑层，通过真空过滤处理混合物溶液，分离滤纸表面的膜，最终得到蛋白酶生物催化膜。
51.(4)酶膜反应器深度酶解：将(3)得到的新型生物催化膜与酶膜反应罐联用，在酶膜反应罐中加入步骤(1)处理的微流化大豆分离蛋白溶液，将其置于恒温水浴锅中升温，调节ph至9，升温至50℃，打开蠕动泵，常压循环3min；然后，调节系统压力至0.25mpa，运行4h后，关闭蠕动泵；
52.(5)喷雾干燥制备大豆肽粉末：将步骤(4)处理后的酶解液离心处理，转速为8000rmp，离心45min，将离心后得上清液喷雾干燥，干燥温度180℃，喷雾压力0.5mpa。
53.实施例3
54.(1)微流化处理大豆分离蛋白：使用去离子水制备20％的大豆分离蛋白分散体。然后，使用m-110eh微流化器在160mpa下对其进行微流化，处理时间为60min。随后，收集微流化的大豆分离蛋白样品。
55.(2)蛋白酶复合材料的合成：将咪唑-2-甲醛和聚乙烯吡咯烷酮按照12:1的比例混合，然后加入去离子水，使咪唑-2-甲醛和聚乙烯吡咯烷酮的质量浓度为5％。将混合物在90℃下溶解6h，以获得澄清溶液；
56.溶液冷却至室温后，迅速向该溶液中分别加入5％的中性蛋白酶、风味蛋白酶、无花果蛋白酶、碱性蛋白酶混合20min。
57.然后，在溶液中加入3％的硝酸锌，静置10min。最后，离心收集沉淀物并用去离子水。最终获得蛋白酶复合材料。
58.(3)蛋白酶生物催化膜的制备：首先，使用均质机将细菌纤维素加工成纤维素纳米纤维浆料。然后按照6:3:1:1的质量比将纤维素纳米纤维浆料、羧化多壁碳纳米管、步骤(2)制备的蛋白酶复合材料和十六烷基三甲基溴化铵混合为溶液。
59.其中，均质机的型号为grx2000/4，转速为14000rmp，时间为1min；羧化多壁碳纳米管的平均直径为6nm，平均长度为8μm。
60.最后，利用滤纸作为支撑层，通过真空过滤处理混合物溶液，分离滤纸表面的膜，
最终得到蛋白酶生物催化膜。
61.(4)酶膜反应器深度酶解：将(3)得到的新型生物催化膜与酶膜反应罐联用，在酶膜反应罐中加入步骤(1)处理的微流化大豆分离蛋白溶液，将其置于恒温水浴锅中升温，调节ph至11，升温至60℃，打开蠕动泵，常压循环5min；然后，调节系统压力至0.5mpa，运行6h后，关闭蠕动泵；
62.(5)喷雾干燥制备大豆粉末：将步骤(4)处理后的酶解液离心处理，转速为10000rmp，离心20min，将离心后得上清液喷雾干燥，干燥温度200℃，喷雾压力1mpa。
63.测试例：
64.通过测定实验组制备的大豆肽的乳化活性、乳化稳定性、起泡性、泡沫稳定性、持水性、持油性及肽含量，并将大豆磷脂的乳化活性和乳化稳定性、蛋清的起泡性和泡沫稳定性、淀粉磷酸酯的持水性和淀粉的持油性作为标准(标准品的功能特性设定为100％)，具体测定方法如下，测定结果如表1所示。
65.(1)乳化性的测定：用0.2mol/l，ph为7.0的磷酸盐溶液配制1％(m/v)需测定的溶液，取30ml于100ml烧杯中，加入大豆油10ml，用均质机将混合溶液以5000r/min的速度均质2min，制得乳状液待用。分别在0、10min时用微量移液器吸取底部乳状液50μl，加入25ml的0.1％(m/v)sds溶液混合均匀(稀释500倍)。以相同的sds溶液作空白对照，立即测定其在500nm处的吸光度。乳化活性(eai)和乳化稳定性(esi)的计算公式如下：
[0066][0067]
a0为均质后迅速被稀释的乳化液的吸光度；c为乳状液形成前蛋白质水溶液中蛋白质浓度(g/ml)；φ为乳状液中油的体积分数(1/4)。
[0068][0069]
a0为均质后迅速被稀释的乳化液的吸光度；a10为乳状液在静置10min后的吸光度；t为时间(10min)。
[0070]
(2)起泡性的测定：用0.2mol/l、ph为7.0的磷酸盐溶液配制1％需测定的溶液，用移液管取40ml于100ml小烧杯中，用均质机以5000r/min的速度均质2min，立即转入量筒中，分别记录均质停止和30min之后的泡沫体积v1、v2。起泡能力(fai)和泡沫稳定性(fsi)的计算公式如下：
[0071][0072]
v1为均质停止时的泡沫体积。
[0073][0074]
v1为均质停止时的泡沫体积；v2为均质停止30min后的泡沫体积。
[0075]
(3)持水性和持油性的测定：称取0.5g(m0)大豆肽，加入10ml水或大豆油，充分振荡，4000r/min离心30min，弃去水或大豆油，称量离心后沉淀的质量(m1)，按式(5)计算持水性(h1)或持油性(h2)。
[0076]
[0077]
(4)肽含量(分子量5000da以下)＝(5000da的肽质量/蛋白总质量)
×
100％
[0078]
表1
[0079][0080]
由表1可以得出，实施例2最佳。制备的大豆肽的乳化活性、乳化稳定性、起泡性、泡沫稳定性、持水性和持油性均高于参照的标准品，且制备的肽含量最高。
[0081]
对比例：
[0082]
在实施例2的基础上，设置对比例：
[0083]
对比例1：省去微流化处理，其他加工工艺与实施例2相同。
[0084]
对比例2：省去生物复合材料，改用复合蛋白酶，其他加工工艺与实施例2相同。
[0085]
对比例3：省去生物催化膜，其他加工工艺与实施例2相同。
[0086]
对比例4：省去酶膜反应器酶解，其他加工工艺与实施例2相同。
[0087]
测定了各对照组的功能特性及肽含量，具体测定方法与测试例相同，测定结果如表2所示。
[0088]
表2
[0089][0090]
由表2可以得出，实施例2最佳，其制备的大豆肽乳化活性、乳化稳定性、起泡性、泡沫稳定性、持水性、持油性、肽含量都得到了显著改善。
[0091]
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，对于本领域的普通技术人员而言，在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。