人工合成mRNA及其利用

人工合成mrna及其利用
技术领域
1.本发明涉及人工合成mrna及其利用。本技术要求2019年10月17日提出的日本专利申请第2019-189929号的优先权，并将该专利申请的全部内容结合与此作为参考。


背景技术：

2.迄今为止，基因治疗以病毒等的dna为载体来实施，但仍然存在由于转入到基因组中而导致的致癌等危险性大的问题。另一方面，mrna与dna不同，其作为没有向基因组中插入等风险的安全的核酸药物而受到关注，但被指出了rna本来具有的不稳定性和翻译效率低的缺点(例如，专利文献1至专利文献3)。
3.在专利文献1中，作为通过阐明mrna在细胞内的分解机理来抑制该机理产生的技术，公开了在目标基因的mrna中使用2'-5
′‑
寡腺苷酸合成酶的功能抑制物质的方法。
4.现有技术文献
5.专利文献
6.专利文献1：日本特开2018-74954号公报
7.专利文献2：日本特开2015-221026号公报
8.专利文献3：日本特开2015-226531号公报


技术实现要素：

9.发明欲解决的技术问题
10.的确是，根据专利文献1所记载的技术，rna本来具有的不稳定性得以改善。但是，对于提高mrna的翻译效率，尚有改善的余地。
11.因此，本发明人等进行了深入研究，至此发明了提高mrna的翻译效率的方法。
12.用于解决问题的技术手段
13.本发明是为了解决上述课题而完成的，能够通过以下方式来实现。
14.(1)根据本发明的一个方式，能够提供人工合成mrna。该人工合成mrna具有：mrna的5
′
非翻译区，其对蛋白质进行编码；以及mrna的3
′
非翻译区，其与所述5
′
非翻译区的互补性为40％以上且80％以下。
15.(2)在上述的人工合成mrna中，也可以是，所述蛋白质选自由甘油醛-3-磷酸脱氢酶、β-珠蛋白、rps8和ldhb组成的组。
16.(3)在上述的人工合成mrna中，也可以是，所述3
′
非翻译区与所述5
′
非翻译区的互补性为50％以上且75％以下。
17.(4)根据本发明的其他方式，提供一种包括将上述的人工合成mrna导入细胞的工序的方法。
18.(5)根据本发明的其他方式，提供一种被导入有上述人工合成mrna的细胞。
19.(6)根据本发明的其他方式，提供一种人工合成mrna的制造方法。该人工合成mrna的制造方法包括制备人工合成mrna的工序，所述人工合成mrna具有编码蛋白质的mrna的5
′
非翻译区、和与所述5
′
非翻译区的互补性为40％以上且80％以下的3
′
非翻译区。
20.(7)根据本发明的其他方式，提供人工合成mrna。该人工合成mrna具有：mrna的5
′
非翻译区，所述5
′
非翻译区对甘油醛-3-磷酸脱氢酶进行编码；以及mrna的3
′
非翻译区，所述3
′
非翻译区对甘油醛-3-磷酸脱氢酶进行编码。
21.(8)根据本发明的其他方式，提供一种人工合成mrna的制造方法。该人工合成mrna的制造方法包括制备mrna的工序，所述mrna具有对甘油醛-3-磷酸脱氢酶进行编码的mrna的5
′
非翻译区、以及对甘油醛-3-磷酸脱氢酶进行编码的mrna的3
′
非翻译区。
22.(9)根据本发明的其他方式，提供一种包括将上述(7)的人工合成mrna导入细胞的工序的方法。
23.(10)根据本发明的其他方式，提供一种被导入有上述(7)的人工合成mrna的细胞。
附图说明
24.[图1]是表示制作出的人工合成mrna的图。
[0025]
[图2]是表示测定根据人工合成mrna的蛋白质表达量的结果图。
[0026]
[图3]是表示图1所示的人工合成mrna的稳定性的图。
[0027]
[图4]是表示制作出的人工合成mrna的图。
[0028]
[图5]是表示每个人工合成mrna的表达量的图。
[0029]
[图6]是表示将人工合成mrna导入至来自肾脏的hek293细胞后的每个人工合成mrna的表达量的图。
[0030]
[图7]是表示制作出的人工合成mrna的图。
[0031]
[图8]是表示由于gapdh的utr序列的有无而引起的表达量差异的图。
[0032]
[图9]是表示由于ldhb的utr序列的有无而引起的表达量差异的图。
[0033]
[图10]是表示由于acat2的utr序列的有无而引起的表达量差异的图。
[0034]
[图11]是表示制作出的人工合成mrna的图。
[0035]
[图12]是表示由于有无gapdh的5
′
utr序列缺失而引起的表达量差异的图。
[0036]
[图13]是表示制作出的人工合成mrna的图。
[0037]
[图14]是表示由于有无gapdh的3
′
utr序列缺失而引起的表达量差异的图。
[0038]
[图15]是表示制作出的人工合成mrna的图。
[0039]
[图16]是表示由于5
′
utr 28nt和3
′
utr 28nt的有无而引起的表达量差异的图。
[0040]
[图17]是表示制作出的人工合成mrna的图。
[0041]
[图18]是表示由于互补性而引起的表达量差异的图。
[0042]
[图19]是表示制作出的人工合成mrna的图。
[0043]
[图20]是表示由于互补性而引起的表达量差异的图。
[0044]
[图21]是表示制作出的人工合成mrna的图。
[0045]
[图22]是表示使用了抑癌基因p53时的表达量差异的图。
[0046]
[图23]是用于说明所得到的效果的推测机理的图。
[0047]
[图24]是表示使用了基因组编辑基因hcas9时的表达量差异的图。
[0048]
[图25]是表示使用了基因组编辑基因hcas9时的基因组编辑量差异的图。
[0049]
[图26]是表示使用了β-珠蛋白(β-globin)的5
′
utr时的表达量差异的图。
[0050]
[图27]是表示使用了rps8的5
′
utr时的表达量差异的图。
[0051]
[图28]是表示使用了ldhb的5
′
utr时的表达量差异的图。
具体实施方式
[0052]
本说明书的内容涉及翻译效率高的人工合成mrna及其利用。需要说明的是，为了表示由人为操作来制备这样的特征并且与细胞内(内在性)mrna区分，有时将本发明的mrna称为“人工合成mrna”。在此，在本说明书中，“mrna”表示具有可被翻译成蛋白质的碱基序列信息和结构的rna。另外，两个用语“抑制”和“阻碍”的意思是重复的，经常能够替换使用。因此，在本说明书中，除了根据前后的上下文而特别需要区别的情况，统一使用术语“抑制”。“翻译效率高”是指翻译量的增大。
[0053]
1.mrna
[0054]
本发明的mrna具有目标基因的编码区(对目标基因的表达产物即蛋白质进行编码的区域)。“目标基因”是指利用本发明的mrna在细胞内进行表达的基因。可以采用各种基因作为目标基因。在本说明书中，将通过导入本发明的mrna来表达目标基因的细胞称为“目标细胞”。作为目标基因，例如可以列举出：酶(例如，核酸酶(zfn(zinc finger nuclease)、talen(transcription activator-like effector nuclease)、crispr-cas9等)、细胞因子、激素、神经递质等的基因；其功能下降(例如变异引起的)、缺损等成为疾病原因的基因；虽然正常发挥功能但期望增强其表达的基因；是目标细胞本来不具有的基因且通过其表达而对目标细胞的生存、维持等有益的基因；作用于目标细胞并对提高目标细胞本来具有的功能的蛋白质或对发挥与目标细胞本来具有的功能不同的功能的蛋白质进行编码的基因；不作用于目标细胞但对从目标细胞分泌而作用于周围细胞的蛋白质(例如干预细胞间网络的蛋白质)进行编码的基因等。编码对目标细胞及周围细胞没有实质作用的蛋白质的基因也能够成为目标基因。作为这样的基因，例如可以列举：对在药品等中使用的蛋白质等进行编码的基因(例如，人促红细胞生成素基因、人纤维蛋白原基因、人血清白蛋白基因、人乳铁蛋白基因、人α-葡萄糖苷酶基因)。通过采用这样的基因，在目标细胞内能够产生可用作药品等的重组蛋白质。
[0055]
目标细胞没有特别限定，例如可以使用各种真核细胞作为目标细胞。更具体而言，作为目标细胞，例如可以使用哺乳动物(人、猴、牛、马、兔、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠等)的各种细胞，例如心肌细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、骨细胞、软骨细胞、破骨细胞、实质细胞、表皮角化细胞(角质形成细胞)、上皮细胞(皮肤表皮细胞、角膜上皮细胞、结膜上皮细胞、口腔粘膜上皮、毛囊上皮细胞、口腔粘膜上皮细胞、呼吸道粘膜上皮细胞、肠道粘膜上皮细胞等)、内皮细胞(角膜内皮细胞、血管内皮细胞等)、神经细胞、胶质细胞、脾细胞、胰腺β细胞、系膜细胞、朗格汉斯细胞、肝细胞、它们的前体细胞或干细胞、或诱导多能干细胞(ips细胞)、间充质干细胞(msc)、胚胎干细胞(es细胞)、胚胎生殖细胞(eg细胞)、胚胎肿瘤细胞(ec细胞)等。另外，作为目标细胞，例如可以使用传代细胞、诱导分化为特定的细胞谱系的细胞、株化细胞(例如hela细胞、cho细胞、vero细胞、hek293细胞、hepg2细胞、cos-7细胞、nih3t3细胞、sf9细胞)等。
[0056]
也可以对处于从生物体分离的状态的目标细胞(即分离出的目标细胞)或处于构成生物体的状态的目标细胞导入本发明的mrna。因此，在体外(in vitro)、体内(in vivo)
以及离体(ex vivo)中的任一环境下都能够实施本发明。这里的“分离出的”表示处于从其本来的环境(例如，构成生物体的状态)取出的状态。因此，通常，分离出的目标细胞存在于培养容器内或保存容器内，能够在体外对其进行人为操作。具体而言，从生物体分离且在生物体外处于培养状态的细胞(包括已株化的细胞)够格作为分离出的目标细胞。需要说明的是，只要在上述意义上处于分离出的状态，即使是已形成组织体的状态，也是分离出的细胞。
[0057]
分离出的目标细胞可以从生物体(例如患者)制备。另一方面，也可以将从独立行政法法人理化学研究所生物资源中心、独立行政法人制品评价技术基础机构、atcc(american type culture collection，美国典型培养物保藏中心)、dsmz(german collection of microorganisms and cell cultures，德国微生物和细胞培养物保藏中心)等获得的细胞作为分离出的目标细胞使用。
[0058]
本发明的mrna具有5
′
非翻译区(5
′
utr：5'untranslated region)和3
′
非翻译区(3
′
utr：3'untranslated region)。
[0059]
本发明的一个实施方式的mrna具有对蛋白质进行编码的mrna的5
′
utr和与5
′
utr的互补性为40％以上且80％以下的3
′
utr。换言之，本发明的实施方式的mrna具有：编码目标蛋白质的翻译区域、编码与目的蛋白质不同的蛋白质的mrna的5
′
utr、与5
′
utr的互补性为40％以上且80％以下的3
′
utr。通过采用该方式，能够提高翻译效率。从进一步提高翻译效率的观点出发，3
′
utr的与5
′
utr的互补性优选为50％以上且75％以下。能够提高翻译效率，其结果是，能够提高目标蛋白质的表达效率。
[0060]
作为对蛋白质进行编码的mrna的5
′
utr，没有特别限定，例如优选对每细胞(例如hela细胞)的蛋白质表达量为106分子以上的蛋白质进行编码的mrna的5
′
utr。作为该蛋白质，更优选为选自由甘油醛-3-磷酸脱氢酶、β-珠蛋白(β-globin)、rps8和ldhb组成的组中的蛋白质。
[0061]
此外，本发明的另一实施方式的mrna具有：对甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)进行编码的mrna的5
′
utr和对gapdh进行编码的mrna的3
′
utr。换言之，本发明的实施方式的mrna具有：编码gapdh的mrna的5
′
utr、编码gapdh的mrna的3
′
utr和编码不是gapdh的蛋白质的orf(open reading frame，开放阅读框)。通过采用该方式，能够提高翻译效率。在本说明书中，将“编码～的mrna的utr”也简称为“～的utr”。例如，将“编码gapdh的mrna的5
′
utr”也称为“gapdh的utr”。
[0062]
在本说明书中，作为gapdh的utr，使用来自人的gapdh的utr，但本发明不限于此。作为gapdh的utr，例如也可以使用来自其他生物(例如小鼠)的gapdh的utr。另外，本发明的mrna所具有的gapdh的utr的长度优选为源自生物的gapdh的utr的70％以上且130％成以下，更优选为80％以上且120％以下，进一步优选为90％以上且110％以下。另外，本发明的mrna所具有的gapdh的utr与源自生物的gapdh的utr的一致率优选为70％以上，更优选为80％以上，进一步优选为90％以上。
[0063]
本发明的其他实施方式的mrna具有：编码gapdh的mrna的5
′
utr和与5
′
utr的互补性为40％以上且80％以下的3
′
utr。换言之，本发明的实施方式的mrna具有：编码gapdh的mrna的5
′
utr、与5
′
utr的互补性为40％以上且80％以下的3
′
utr、和编码不是gapdh的蛋白质的orf。通过采用该方式，能够提高翻译效率。从进一步提高翻译效率的观点出发，优选3
′
utr中的与5
′
utr的互补性为50％以上且75％以下。
[0064]
本实施方式的mrna也可以具有其翻译所必需的5
′
帽子结构(m7g(7-甲基鸟苷)经由5
′‑5′
三磷酸桥而与5
′
末端核苷键合而成的结构)和多聚(a)链。多聚(a)链的长度没有特别限定，例如为30～200个碱基。通过使翻译起始因子eif4e结合于5
′
帽子结构、并且使多聚(a)链结合蛋白pabp(poly(a)-binding protein)结合于多聚(a)链中，从而两者经由作为支架蛋白的翻译起始因子eif4g形成复合体，由此mrna形成环状结构(wells se,et al.mol cell.1998；2:135-140)。进而，翻译终止因子erf3通过与pabp-eif4g形成复合体，从而使3
′
utr循环(uchida n,et al.j biol chem.2002；277:50286-50292)。这样的mrna的环状化通过使翻译终止部位和翻译起始部位物理上接近，将结束了翻译的核糖体不经过3
′
utr而是从终止密码子再利用到下一个翻译起始，从而大大有助于翻译起始的效率。5
′
末端帽结构和多聚(a)链不仅是这样的翻译的效率化，而且通过阻碍由核酸外切酶引起的从末端开始的mrna分解从而使mrna稳定，在翻译的高效化和mrna稳定化的两个过程中对控制转录后的基因表达有很大贡献。
[0065]
本发明的mrna例如可以通过体外转录系统、化学合成等方法来制备。通过利用体外转录用的试剂盒(例如，由promega公司提供的ribomaxsystem，由nippongene公司提供的cuga7 in vitro transcription kit，由life technologies公司提供的megascript t7kit)，能够简便地制备目标mrna。另外，关于5
′
帽子结构的附加，也可以利用公知的方法进行，例如可以利用new england biolabs公司提供的3'-o-me-m7g(5')ppp(5')g rna cap structure analog。
[0066]
作为本发明的mrna，也可以并用2种以上的mrna。例如，可以并用具有特定基因的编码区域的mrna和具有对与该基因的表达产物相互作用的表达产物进行编码的区域的mrna。
[0067]
本发明的mrna的量可以考虑使用目的、所使用的目标基因的特征、目标细胞的种类等并且设定为在目标细胞内得到充分量的表达产物即可。表示mrna量的例子时，作为一次的量，可以使每3cm培养皿中含有0.5～1.0μg的mrna。
[0068]
以保护人工合成mrna为目的，例如可以使用核酸外切酶抑制剂、核酸内切酶抑制剂、磷脂、磷酸钙、聚乙烯亚胺、作为纳米胶束形成剂的聚乙二醇-聚阳离子、缓冲剂、无机盐类、2价离子等，以阻止细菌混入为目的，可以使用抗生素等，以使细胞的增殖能力亢进为目的，可以使用动物血清、生长因子、糖类、维生素类、2价离子等。另外，也可以使用制剂上允许的其他成分(例如，载体、赋形剂、崩解剂、缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、无痛化剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水等)。进而，以使有效成分的细胞导入效率亢进为目的，可以使用life technologies公司提供的opti-mem等特殊合成培养基。
[0069]
2.导入方法
[0070]
为了利用本发明使目标基因在目标细胞内表达，进行向目标细胞导入目标基因的mrna的步骤。
[0071]
向目标细胞导入mrna可以通过公知的方法进行。例如，能够利用磷酸钙共沉淀法、电穿孔(potter,h.et al.,proc.natl.acad.sci.u.s.a.81,7161-7165(1984))、脂质体转染法(felgner,p.l.et al.,proc.natl.acad.sci.u.s.a.84,7413-7417(1987))、微注射法(graessmann,m.&graessmann,a.,proc.natl.acad.sci.u.s.a.73,366-370(1976))、
hanahan方法(hanahan,d.,j.mol.biol.166,557-580(1983))、醋酸锂法(schiestl,r.h.et al.,curr.genet.16,339-346(1989))、原生质体-聚乙二醇法(yelton,m.m.et al.,proc.natl.acad.sci.81,1470-1474(1984))、超声波基因导入法、利用阳离子性多胺酸的方法(例如，参照特开2011-173802号公报)、利用包含具有阳离子性聚合物链段和非荷电亲水性聚合物链段的嵌段共聚物的聚离子络合物(pic)型的聚合物胶束的方法(例如，参照特开2004-352972号公报、国际公开第2012/005376号手册)等进行实施。
[0072]
3.用途
[0073]
根据本发明的mrna，由于在目标细胞内提高了翻译效率，因此目标蛋白质实现高表达。因此，本发明能够应用于需要目标蛋白质的高表达的各种用途。作为本发明的用途的例子，可列举出：(a)各种病毒性疾病(例如乙型肝炎、后天性免疫缺陷症状群aids、成人t细胞白血病)、遗传病(例如杜氏肌营养不良症、囊性腺纤维化、β-地中海贫血、hurler综合症、视网膜色素变性症、x链肾性尿崩溃)的治疗、(b)癌免疫疗法、(c)ips细胞的制作、(d)干细胞(例如，ips细胞、es细胞等多分化能干细胞)或前体细胞的分化诱导等。
[0074]
上述(a)和(b)利用本发明作为所谓的rna药物。在作为(a)的具体例的乙型肝炎的治疗中，例如，通过使用以将转入到基因组中的病毒dna切断、分解的核酸酶(zfn、talen、或crispr-cas9)基因作为目标基因而转入的mrna，从而能够进行没有致癌风险的病毒治疗，该致癌风险在使用以往的病毒载体的方法中成为问题。这样，本发明作为病毒去除剂也是有用的。在遗传疾病的治疗中，例如将致病基因(因功能降低或缺损而引起疾病者)作为目标基因，来应用本发明。在上述(b)的用途中，利用本发明将肿瘤抗原的mrna导入抗原递提示细胞中，在体内产生肿瘤疫苗。如果将本发明应用于上述(c)和(d)的用途，则能够在不使用病毒载体的情况下导入初始化因子，因此能够克服细胞癌化的问题。
[0075]
将本发明用作rna药物时的制剂化可以按照常规方法进行。在制剂化时，可以含有制剂上允许的其他成分(例如，缓冲剂、赋形剂、崩解剂、乳化剂、悬浮剂、无痛化剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水、载体等)。作为缓冲剂，可以使用磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液等。作为赋形剂，可以使用乳糖、淀粉、山梨糖醇、d-甘露醇、白糖等。作为崩解剂，可以使用淀粉、羧甲基纤维素、碳酸钙等。作为缓冲剂，可以使用磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐等。作为乳化剂，可以使用阿拉伯胶、海藻酸钠、黄蓍胶等。作为悬浮剂，可以使用单硬脂酸甘油酯、单硬脂酸铝、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、月桂基硫酸钠等。作为无痛化剂，可以使用苄醇、氯丁醇、山梨糖醇等。作为稳定剂，可以使用丙二醇、抗坏血酸等。作为保存剂，可以使用苯酚、苯扎氯铵、苄醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯等。作为防腐剂，可以使用苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。
[0076]
制剂化时的剂型也没有特别限定。剂型的例子为注射剂、片剂、散剂、细粒剂、颗粒剂、胶囊剂和糖浆剂。
[0077]
本发明的rna药物可以根据其剂型通过口服给药或非口服给药(静脉内、动脉内、皮下、皮内、肌肉内或腹腔内注射、经皮、经鼻、经粘膜等)应用于对象。这些给药途径并不是互斥的途径，可以并用任意选择的两个以上(例如，在口服给药的同时或经过规定时间后进行静脉注射等)。这里的“对象”没有特别限定，包括人和人以外的哺乳动物(包括宠物动物、家畜、实验动物。具体而言，例如，小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、猴、牛、猪、山羊、绵羊、狗、猫、鸡、鹌鹑等)。在一个优选方式中，本发明的rna药物适用于人类。
[0078]
本发明的rna药物的给药量以能够得到期待的治疗效果的方式设定。在设定治疗上有效的给药量时，一般考虑患者的症状、年龄、性别以及体重等。另外，本领域技术人员能够考虑这些事项来设定适当的给药量。作为给药计划，例如可以采用1天1次～数次、2天1次、或3天1次等。在制作给药计划时，能够考虑患者的症状、有效成分的效果持续时间等。
[0079]
实施例
[0080]
1.目的
[0081]
以提高各种期待临床应用的人工合成mrna在目标细胞内的翻译效率为目的，进行了以下的研究。
[0082]
2.研究材料和方法
[0083]
(1)质粒
[0084]
作为rna转染用的载体，使用了pbk-5f-egfp-pa72。作为pbk-5f-egfp-pa72的制作方法，使用了nogimori及其他的“dom34 mediates targeting of exogenous rna in the antiviral oas/rnase l pathway”nucleic acids research,volume 47,issue 1,10january 2019,pages 432-449中记载的方法。
[0085]
(2)非翻译区的插入
[0086]
·
gapdh的5
′
utr的插入
[0087]
关于gapdh的5
′
utr序列，将序列号1和序列号2所示的寡核苷酸杂交，插入到pbk-5f-egfp-pa72的kpni、xhoi位点。在此，gapdh的5
′
utr序列如序列号27所示。
[0088]
·
gapdh的3
′
utr的插入
[0089]
关于gapdh的3
′
utr序列，通过使用了从hela细胞中提取的总rna、和示于序列号3及序列号4的寡核苷酸的逆转录pcr法进行分离。分离出的序列插入到pbk-5f-egfp-pa72的ecori、xbai位点。在此，gapdh的3
′
utr序列如序列号28所示。
[0090]
·
acat2的5
′
utr的插入
[0091]
关于acat2的5
′
utr序列，通过使用了从hela细胞提取的总rna、和示于序列号5及序列号6的寡核苷酸的逆转录pcr法进行分离。分离出的序列插入到pbk-5f-egfp-pa72的kpni、xhoi位点。在此，acat2的5
′
utr序列如序列号29所示。
[0092]
·
acat2的3
′
utr的插入
[0093]
关于acat2的3
′
utr序列，通过使用了从hela细胞提取的总rna、和示于序列号7及序列号8的寡核苷酸的逆转录pcr法进行分离。分离出的序列插入到pbk-5f-egfp-pa72的ecori、xbai位点。在此，acat2的3
′
utr序列如序列号30所示。
[0094]
·
ldhb的5
′
utr的插入
[0095]
关于ldhb的5
′
utr序列，通过使用了从hela细胞提取的总rna、和示于序列号9及序列号10的寡核苷酸的逆转录pcr法进行分离。分离出的序列插入到pbk-5f-egfp-pa72的kpni、xhoi位点。在此，ldhb的5
′
utr序列如序列号31所示。
[0096]
·
ldhb的3
′
utr的插入
[0097]
关于ldhb的3
′
utr序列，通过使用了从hela细胞提取的总rna、和示于序列号11及序列号12的寡核苷酸的逆转录pcr法进行分离。分离出的序列插入到pbk-5f-egfp-pa72的ecori、xbai位点。在此，ldhb的3
′
utr序列如序列号32所示。
[0098]
·
gapdh的与5
′
utr序列完全互补的3
′
utr的插入
[0099]
关于gapdh的与5
′
utr序列完全互补的3
′
utr序列，将序列号13和序列号14所示的寡核苷酸杂交，并插入到pbk-5f-egfp-pa72的kpni、xhoi位点。在此，gapdh的与5
′
utr序列完全互补的3
′
utr序列示于序列号33。
[0100]
·
gapdh的与5
′
utr序列互补性为94％的3
′
utr的插入
[0101]
关于gapdh的与5
′
utr序列互补性为94％的3
′
utr序列，将序列号15和序列号16所示的寡核苷酸杂交，插入到pbk-5f-egfp-pa72的kpni、xhoi位点。在此，gapdh的与5
′
utr序列互补性为94％的3
′
utr序列如序列号34所示。
[0102]
·
gapdh的与5
′
utr序列互补性为88％的3
′
utr的插入
[0103]
关于gapdh的与5
′
utr序列互补性为88％的3
′
utr序列，将序列号17和序列号18所示的寡核苷酸杂交，插入到pbk-5f-egfp-pa72的kpni、xhoi位点。在此，gapdh的与5
′
utr序列互补性为88％的3
′
utr序列示于序列号35。
[0104]
·
gapdh的与5
′
utr序列互补性为75％的3
′
utr的插入
[0105]
关于gapdh的与5
′
utr序列互补性为75％的3
′
utr序列，将序列号19与序列号20所示的寡核苷酸杂交，并插入到pbk-5f-egfp-pa72的kpni、xhoi位点。在此，gapdh的与5
′
utr序列互补性为75％的3
′
utr序列如序列号36所示。
[0106]
·
gapdh的与5
′
utr序列互补性为50％的3
′
utr的插入
[0107]
关于gapdh的与5
′
utr序列互补性为50％的3
′
utr序列，将序列号21与序列号22所示的寡核苷酸杂交，并插入到pbk-5f-egfp-pa72的kpni、xhoi位点。在此，gapdh的与5
′
utr序列互补性为50％的3
′
utr序列如序列号37所示。
[0108]
·
gapdh的与5
′
utr序列互补性为25％的3
′
utr的插入
[0109]
关于gapdh的与5
′
utr序列互补性为25％的3
′
utr序列，将序列号23与序列号24所示的寡核苷酸杂交，并插入到pbk-5f-egfp-pa72的kpni、xhoi位点。在此，gapdh的与5
′
utr序列互补性为25％的3
′
utr序列示于序列号38。
[0110]
·
β-珠蛋白的5
′
utr的插入
[0111]
关于β-珠蛋白的5
′
utr序列，将序列号41和序列号42所示的寡核苷酸杂交，并插入到pbk-5f-egfp-pa72的kpni、xhoi位点。在此，β-珠蛋白的5
′
utr序列如序列号94所示。
[0112]
·
β-珠蛋白的与5
′
utr序列完全互补的3
′
utr的插入
[0113]
关于β-珠蛋白的与5
′
utr序列完全互补的3
′
utr，将序列号43和序列号44所示的寡核苷酸杂交，并插入到pbk-5f-egfp-pa72的ecori、xbai位点。在此，β-珠蛋白的与5
′
utr序列完全互补的3
′
utr序列示于序列号95。
[0114]
·
β-珠蛋白的与5
′
utr序列互补性为92％的3
′
utr的插入
[0115]
关于β-珠蛋白的与5
′
utr序列互补性为92％的3
′
utr，将序列号45和序列号46所示的寡核苷酸杂交，并插入到pbk-5f-egfp-pa72的ecori、xbai位点。在此，β-珠蛋白的与5
′
utr序列互补性为92％的3
′
utr序列如序列号96所示。
[0116]
·
β-珠蛋白的与5
′
utr序列互补性为88％的3
′
utr的插入
[0117]
关于β-珠蛋白的与5
′
utr序列互补性为88％的3
′
utr，将序列号47和序列号48所示的寡核苷酸杂交，并插入到pbk-5f-egfp-pa72的ecori、xbai位点。在此，β-珠蛋白的与5
′
utr序列互补性为88％的3
′
utr序列如序列号97所示。
[0118]
·
β-珠蛋白的与5
′
utr序列互补性为74％的3
′
utr的插入
[0119]
关于β-珠蛋白的与5
′
utr序列互补性为74％的3
′
utr，将序列号49和序列号50所示的寡核苷酸杂交，并插入到pbk-5f-egfp-pa72的ecori、xbai位点。在此，β-珠蛋白的与5
′
utr序列互补性为74％的3
′
utr序列如序列号98所示。
[0120]
·
β-珠蛋白的与5
′
utr序列互补性为50％的3
′
utr的插入
[0121]
关于β-珠蛋白的与5
′
utr序列互补性为50％的3
′
utr，将序列号51和序列号52所示的寡核苷酸杂交，并插入到pbk-5f-egfp-pa72的ecori、xbai位点。在此，β-珠蛋白的与5
′
utr序列互补性为50％的3
′
utr序列如序列号99所示。
[0122]
·
β-珠蛋白的与5
′
utr序列互补性为24％的3
′
utr的插入
[0123]
关于β-珠蛋白的与5
′
utr序列互补性为24％的3
′
utr，将序列号53与序列号54所示的寡核苷酸杂交，并插入到pbk-5f-egfp-pa72的ecori、xbai位点。在此，β-珠蛋白的与5
′
utr序列互补性为24％的3
′
utr序列如序列号100所示。
[0124]
·
rps8的5
′
utr的插入
[0125]
关于rps8的5
′
utr序列，将序列号55和序列号56所示的寡核苷酸杂交，并插入到pbk-5f-egfp-pa72的kpni、xhoi位点。在此，rps8的5
′
utr序列如序列号101所示。
[0126]
·
rps8的与5
′
utr序列完全互补的3
′
utr的插入
[0127]
关于rps8的与5
′
utr序列完全互补的3
′
utr，将序列号57和序列号58所示的寡核苷酸杂交，并插入到pbk-5f-egfp-pa72的ecori、xbai位点。在此，rps8的与5
′
utr序列完全互补的3
′
utr序列如序列号102所示。
[0128]
·
rps8的与5
′
utr序列互补性为93％的3
′
utr的插入
[0129]
关于rps8的与5
′
utr序列互补性为93％的3
′
utr，将序列号59和序列号60所示的寡核苷酸杂交，并插入到pbk-5f-egfp-pa72的ecori、xbai位点。在此，rps8的与5
′
utr序列互补性为93％的3
′
utr序列如序列号103所示。
[0130]
·
rtp8的与5
′
utr序列互补性为86％的3
′
utr的插入
[0131]
关于rtp8的与5
′
utr序列互补性为86％的3
′
utr，将序列号61和序列号62所示的寡核苷酸杂交，并插入到pbk-5f-egfp-pa72的ecori、xbai位点。在此，rps8的与5
′
utr序列互补性为86％的3
′
utr序列如序列号104所示。
[0132]
·
rtp8的与5
′
utr序列互补性为71％的3
′
utr的插入
[0133]
关于rps8的与5
′
utr序列互补性为71％的3
′
utr，将序列号63和序列号64所示的寡核苷酸杂交，并插入到pbk-5f-egfp-pa72的ecori、xbai位点。在此，rps8的与5
′
utr序列互补性为71％的3
′
utr序列如序列号105所示。
[0134]
·
rps8的与5
′
utr序列互补性为50％的3
′
utr的插入
[0135]
关于rps8的与5
′
utr序列互补性为50％的3
′
utr，将序列号65和序列号66所示的寡核苷酸杂交，并插入到pbk-5f-egfp-pa72的ecori、xbai位点。在此，rps8的与5
′
utr序列互补性为50％的3
′
utr序列如序列号106所示。
[0136]
·
rps8的与5
′
utr序列互补性为29％的3
′
utr的插入
[0137]
关于rps8的与5
′
utr序列互补性为29％的3
′
utr，将序列号67和序列号68所示的寡核苷酸杂交，并插入到pbk-5f-egfp-pa72的ecori、xbai位点。在此，rps8的与5
′
utr序列互补性为29％的3
′
utr序列如序列号107所示。
[0138]
·
rps8的与5
′
utr序列互补性为14％的3
′
utr的插入
[0139]
关于rps8的与5
′
utr序列互补性为14％的3
′
utr，将序列号69和序列号70所示的寡核苷酸杂交，并插入到pbk-5f-egfp-pa72的ecori、xbai位点。在此，rps8的与5
′
utr序列互补性为14％的3
′
utr序列如序列号108所示。
[0140]
·
ldhb的与5
′
utr序列完全互补的3
′
utr的插入
[0141]
关于ldhb的与5
′
utr序列完全互补的3
′
utr，将序列号71和序列号72所示的寡核苷酸杂交，并插入到pbk-5f-egfp-pa72的ecori、xbai位点。在此，ldhb的与5
′
utr序列完全互补的3
′
utr序列如序列号109所示。
[0142]
·
ldhb的与5
′
utr序列互补性为93％的3
′
utr的插入
[0143]
关于ldhb的与5
′
utr序列互补性为93％的3
′
utr，将序列号73和序列号74所示的寡核苷酸杂交，并插入到pbk-5f-egfp-pa72的ecori、xbai位点。在此，ldhb的与5
′
utr序列互补性为93％的3
′
utr序列如序列号110所示。
[0144]
·
ldhb的与5
′
utr序列互补性为87％的3
′
utr的插入
[0145]
关于ldhb的与5
′
utr序列互补性为87％的3
′
utr，将序列号75和序列号76所示的寡核苷酸杂交，并插入到pbk-5f-egfp-pa72的ecori、xbai位点。在此，ldhb的与5
′
utr序列互补性为87％的3
′
utr序列如序列号111所示。
[0146]
·
ldhb的与5
′
utr序列互补性为75％的3
′
utr的插入
[0147]
关于ldhb的与5
′
utr序列互补性为75％的3
′
utr，将序列号77和序列号78所示的寡核苷酸杂交，并插入到pbk-5f-egfp-pa72的ecori、xbai位点。在此，ldhb的与5
′
utr序列互补性为75％的3
′
utr序列如序列号112所示。
[0148]
·
ldhb的与5
′
utr序列互补性为50％的3
′
utr的插入
[0149]
关于ldhb的与5
′
utr序列互补性为50％的3
′
utr，将序列号79和序列号80所示的寡核苷酸杂交，并插入到pbk-5f-egfp-pa72的ecori、xbai位点。在此，ldhb的与5
′
utr序列互补性为50％的3
′
utr序列如序列号113所示。
[0150]
·
ldhb的与5
′
utr序列互补性为25％的3
′
utr的插入
[0151]
关于ldhb的与5
′
utr序列互补性为25％的3
′
utr，将序列号81和序列号82所示的寡核苷酸杂交，并插入到pbk-5f-egfp-pa72的ecori、xbai位点。在此，ldhb的与5
′
utr序列互补性为25％的3
′
utr序列如序列号114所示。
[0152]
·
cas9 mrna合成质粒的制作
[0153]
cas9的cdna序列通过使用mail及其他的“rna-guided human genome engineering via cas9”science.2013feb 15；339(6121):823-6中记载的hcas9质粒(addgene plasmid#41815)、和示于序列号83及序列号84的寡核苷酸的pcr法进行分离。通过使用了将分离出的序列插入到pbk-5f-egfp-pa72的hindiii位点而得的质粒和示于序列号83及序列号85的寡核苷酸的逆pcr法，得到pbk-f-hcas9-pa72质粒。在此，hcas9的cdna序列如序列号115所示，hcas9的氨基酸序列如序列号116所示。
[0154]
·
gapdh的5
′
utr向cas9 mrna合成质粒的插入
[0155]
通过使用了pbk-f-hcas9-pa72质粒和示于序列号86及序列号87的寡核苷酸的逆pcr法，将gapdh的5
′
utr插入。在此，gapdh的5
′
utr如序列号27所示。
[0156]
·
gapdh的与5
′
utr序列互补性为75％的3
′
utr向cas9 mrna合成质粒的插入
[0157]
通过使用了pbk-f-hcas9-pa72质粒和示于序列号88及序列号89的寡核苷酸的逆
pcr法，将gapdh的与5
′
utr序列互补性为75％的3
′
utr插入。在此，gapdh的与5
′
utr序列互补性为75％的3
′
utr序列如序列号36所示。
[0158]
·
gapdh的与5
′
utr序列互补性为50％的3
′
utr向cas9 mrna合成质粒的插入
[0159]
通过使用了pbk-f-hcas9-pa72质粒和示于序列号90及序列号91的寡核苷酸的逆pcr法，将gapdh的与5
′
utr序列互补性为50％的3
′
utr插入。在此，gapdh的与5
′
utr序列互补性为50％的3
′
utr序列如序列号37所示。
[0160]
·
p53的cdna的插入
[0161]
p53的cdna序列通过使用了从u20s细胞提取的总rna、和示于序列号25及序列号26的寡核苷酸的逆转录pcr法进行离析。分离出的p53的cdna序列插入到pbk-5f-egfp-pa72的hindiii位点。在此，p53的cdna序列如序列号39所示，p53的氨基酸序列如序列号40所示。
[0162]
(3)rna合成
[0163]
将用bsmbi对各种pbk-5f-egfp-pa72、各种pbk-5f-p53-pa72及各种pbk-f-hcas9-pa72质粒进行处理而得者作为模子，合成5xflag-egfp-pa72、5xflag-p53-pa72以及flag-hcas9-pa72 mrna。rna合成使用t7 rna聚合酶(takara bio株式会社)，按照该t7 rna聚合酶的操作说明书进行。
[0164]
(4)转染
[0165]
hela细胞、293t细胞、u2os细胞均使用添加了5％的胎牛血清(fetal bovine serum)的达尔伯克改良伊格尔培养基(dulbecco’smodified eagle’s medium，日水制药株式会社)，在5％co2存在下以37℃进行培养。将hela细胞以达到约50％铺满的方式撒种在35mm盘子中，然后培养了24小时。然后，使用lipofectamine rnaimax(life technologies japan株式会社)，按照该操作说明书导入已合成的各种rna。
[0166]
(5)rna分析
[0167]
rna转染后的来自hela细胞的总rna的分离通过使用了硫氰酸胍、酸性苯酚、氯仿的方法即agpc(acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction，酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿萃取)法进行。制备的总rna通过琼脂糖mops缓冲凝胶(20mm mops(ph 7.0)，5mm醋酸钠、1mm edta、2.0％琼脂糖、2.46m甲醛)进行分离后，在20xssc缓冲液中转录到尼龙膜biodyne-b(日本pall株式会社)。转录后的尼龙膜用uv固定后，使用dig标记探针进行杂交。dig标记探针的制作和杂交使用dig rna labeling mix(roche diagnostics株式会社)和dig wash and block buffer set(roche diagnostics株式会社)，按照操作说明书进行。mrna的检测使用化学发光试剂cdp-star(roche diagnostics株式会社)，通过las3000mini(富士写真胶片株式会社)进行检测。
[0168]
(6)蛋白质的分析
[0169]
蛋白质的细胞内表达通过以下所示的蛋白质印迹法进行。导入后的来自细胞的蛋白质裂解物的调整使用sds-page样品缓冲液(50mm tris-hcl(ph 6.8)、4％的甘油、2％的sds、2％的2-巯基乙醇、0.004％的溴酚蓝)进行。蛋白质裂解物通过使用了8、10、12或15％的丙烯酰胺的sds-page法进行分离后，电转印到硝酸纤维素膜biotrace nc(日本pall株式会社)，转印后的硝化纤维素膜通过抗flag m2小鼠单克隆抗体(sigmaal drich japan合同会社)、抗gapdh抗体(saito etal jbc)、抗pabpc1抗体(osawa et al rna(2012))以及过氧化物酶附加抗小鼠igg(jackson immunoresearch laboratories,inc.)或过氧化物酶附加
抗兔igg(jackson immunoresearch laboratories,inc.)进行孵化。硝化纤维素膜上的过氧化物酶的酶活性使用鲁米诺化学发光法，利用las3000mini(富士写真胶片株式会社)进行检测。
[0170]
(7)aavs区域基因组编辑效率的定量
[0171]
基因组编辑效率的定量通过以下所示的t7内切核酸酶测定法来进行。将识别aavs区域的sgrna(赛默飞世尔科技公司)和已合成的各种hcas9 mrna导入hela细胞中。将导入后的细胞用50mm naoh处理，从而调整基因组dna。通过使用了调整后的基因组dna和示于序列号92及序列号93的寡核苷酸的pcr法，扩增aavs基因组序列。将扩增后的基因组序列在热变性后进行退火，从而得到包含错配的序列。经退火的aavs基因组序列通过t7内切核酸酶i(new england biolabs株式会社)进行处理。处理后的aavs基因组序列通过琼脂糖凝胶电泳分离后，用溴化乙锭进行染色，利用typhoon9400(ge healthcare株式会社)进行检测。
[0172]
3.实验结果
[0173]
(i)实验1
[0174]
图1是表示制作成的人工合成mrna的图。图1所示的人工合成mrna从上到下依次表示具有gapdh的5
′
utr序列和gapdh的3
′
utr序列的人工合成mrna、具有ldhb的5
′
utr序列和ldhb的3
′
utr序列的人工合成mrna、和具有acat2的5
′
utr序列和acat2的3
′
utr序列的人工合成mrna。在该实验中使用的人工合成mrna的5
′
末端附加了帽子结构，并且在3
′
末端附加含72个碱基的多聚a链。另外，在作为该实验中使用的人工合成mrna的蛋白质编码区的orf中，具有附加了5xflag标签的egfp(enhanced green fluorescent protein，增强型绿色荧光蛋白)。
[0175]
图2是表示测定了根据人工合成mrna的蛋白质表达量的结果的图。蛋白质表达量通过将图1所示的人工合成mrna导入到hela细胞中来测定。图2表示每个人工合成mrna的表达量。
[0176]
在图2中，表示将具有acat2的utr序列的人工合成mrna的表达量作为1时的表达量的相对值。在图2中，作为参考，也示出具有β-珠蛋白的3
′
utr的人工合成mrna的结果。
[0177]
根据图2的结果可知，具有gapdh的utr序列的人工合成mrna与具有acat2的utr序列的人工合成mrna相比，显示约10倍的表达量。另外可知，与作为表达效率高的人工合成mrna而被标准使用的具有β-珠蛋白的3
′
utr序列的人工合成mrna相比，具有gapdh的utr序列的人工合成mrna表示约5倍的表达量。
[0178]
图3是表示图1所示的人工合成mrna的稳定性的图。图3的横轴表示从将人工合成mrna导入细胞之后的经过时间，图3的纵轴表示以将人工合成mrna导入细胞后的mrna的量为100％时的mrna的量。
[0179]
根据图3的结果可知，任一个人工合成mrna在hela细胞内均显示出同样的分解速度。由图2和图3所示的结果可知，gapdh的5
′
utr序列和gapdh的3
′
utr序列所起到的效果不是稳定性提高这样的效果，而是翻译效率提高的效果。
[0180]
(ii)实验2
[0181]
图4是表示制作成的人工合成mrna的图。图4所示的人工合成mrna从上到下依次表示具有acat2的5
′
utr序列和acat2的3
′
utr序列的人工合成mrna、具有acat2的5
′
utr序列和gapdh的3
′
utr序列的人工合成mrna、具有gapdh的5
′
utr序列和acat2的3
′
utr序列的人工合
成mrna、和具有gapdh的5
′
utr序列和gapdh的3
′
utr序列的人工合成mrna。在该实验中使用的人工合成mrna的5
′
末端附加了盖结构，并且在3
′
末端附加含72个碱基的多聚a链。另外，作为该实验中使用的人工合成mrna的蛋白质编码区的orf具有附加了5xflag标签的egfp。
[0182]
图5是表示每个人工合成mrna的表达量的图。蛋白质表达量通过将图4所示的人工合成mrna导入hela细胞来测定。在图5中，表示将具有acat2的5
′
utr序列及acat2的3
′
utr序列的人工合成mrna的表达量作为1时的表达量的相对值。
[0183]
由图5的结果可知，与具有acat2的5
′
utr序列和acat2的3
′
utr序列的人工合成mrna相比，具有gapdh的5
′
utr序列和acat2的3
′
utr序列的人工合成mrna示出约10倍的表达量。还可知，与具有acat2的5
′
utr序列及acat2的3
′
utr序列的人工合成mrna相比，具有gapdh的5
′
utr序列及gapdh的3
′
utr序列的人工合成mrna示出约25倍的表达量。即，可知通过具有gapdh的5
′
utr序列，能够得到提高翻译效率的效果，此外，通过具有gapdh的3
′
utr序列，能够得到提高翻译效率的协同效果。
[0184]
图6是表示将人工合成mrna导入来源于肾脏的hek293细胞时的每个人工合成mrna的表达量的图。和与图5相关的实验相比，除了变更所导入的细胞以外，用同样的方法进行了实验。根据图6的结果，也发现了与根据图5的结果可知的情况相同的倾向。即，可知通过具有gapdh的5
′
utr序列，能够得到提高翻译效率的效果，此外，通过具有gapdh的3
′
utr序列，能够得到提高翻译效率的协同效果。根据与图5和图6相关的实验结果可知，通过具有gapdh的utr序列而得到的提高翻译效率的效果在任何细胞中都是有效的，没有细胞特异性。
[0185]
(iii)实验3
[0186]
图7是表示制作出的人工合成mrna的图。图7所示的人工合成mrna从上到下依次表示不具有utr序列的人工合成mrna、具有5
′
utr序列但不具有3
′
utr序列的人工合成mrna、不具有5
′
utr序列但具有3
′
utr序列的人工合成mrna、以及具有5
′
utr序列和3
′
utr序列的人工合成mrna。在该实验中使用的人工合成mrna的5
′
末端附加了帽子结构，并且在3
′
末端附加含72个碱基的多聚a链。另外，作为该实验中使用的人工合成mrna的蛋白质编码区的orf具有附加了5xflag标签的egfp。
[0187]
图8是表示由gapdh的utr序列的有无而引起的表达量差异的图。图9是表示由ldhb的utr排列的有无而引起的表达量差异的图。图10是表示由acat2的utr序列的有无而引起的表达量差异的图。蛋白质表达量通过将图7所示的人工合成mrna导入hela细胞来测定。在图8、9、10中，表示将不具有utr序列的人工合成mrna的表达量作为1时的表达量的相对值。
[0188]
根据图8的结果可知，具有gapdh的5
′
utr序列和gapdh的3
′
utr序列的人工合成mrna的表达量大于5
′
utr序列但不具有3
′
utr序列的人工合成mrna的表达量与不具有5
′
utr序列但具有3
′
utr序列的人工合成mrna的表达量之和。即，可知，通过具有gapdh的5
′
utr序列和gapdh的3
′
utr序列，能够得到提高翻译效率的协同效果。
[0189]
另一方面，根据图9的结果，具有ldhb的5
′
utr序列和ldhb的3
′
utr序列的人工合成mrna的表达量与具有5
′
utr序列但不具有3
′
utr序列的人工合成mrna的表达量和不具有5
′
utr序列但具有3
′
utr序列的人工合成mrna的表达量之和相等。即，通过具有ldhb的5
′
utr序列和ldhb的3
′
utr序列而得到的效果停留在相加的效果。
[0190]
另外，由图10的结果可知，具有acat2的utr序列的人工合成mrna的表达量与不具
有utr序列的人工合成mrna的表达量相比，翻译效率降低。由图8至图10的结果可知，通过具有5
′
utr序列和3
′
utr序列而得到的提高翻译效率的协同效果是gapdh的特征性效果。
[0191]
(iv)实验4
[0192]
图11是表示制作出的人工合成mrna的图。图11所示的人工合成mrna从上到下依次表示具有gapdh的5
′
utr序列和gapdh的3
′
utr序列的人工合成mrna(以下，也称为“野生型”)、缺失了将5
′
utr序列三分割而成的部分中的最靠5
′
末端侧部分的人工合成mrna(缺失移位体1)、缺失了将5
′
utr序列三分割而成的部分中的中央部分的人工合成mrna(缺失移位体2)、以及缺失了将5
′
utr序列三分割而成的部分中的最靠3
′
末端侧部分的人工合成mrna(缺失移位体3)。在该实验中使用的人工合成mrna的5
′
末端附加了帽子结构，并且在3
′
末端附加含72个碱基的多聚a链。另外，作为该实验中使用的人工合成mrna的蛋白质编码区的orf具有egfp。
[0193]
图12是表示由gapdh的5
′
utr序列缺失的有无而引起的表达量差异的图。蛋白质表达量通过将图11所示的人工合成mrna导入hela细胞来测定。在图12中，表示将野生型的表达量作为100时的表达量的相对值。
[0194]
图13是表示制作成的人工合成mrna的图。图13所示的人工合成mrna从上到下依次表示具有gapdh的5
′
utr序列和gapdh的3
′
utr序列的人工合成mrna(野生型)、缺失了将3
′
utr序列三分割而成的部分中的最靠5
′
末端侧部分的人工合成mrna(缺失移位体4)、缺失了将3
′
utr序列三分割而成的部分中的中央部分的人工合成mrna(缺失移位体5)、以及缺失将3
′
utr序列三分割而成的部分中的最靠3
′
末端侧部分的人工合成mrna(缺失移位体6)。在该实验中使用的人工合成mrna的5
′
末端附加了帽子结构，并且在3
′
末端附加含72个碱基的多聚a链。另外，作为该实验中使用的人工合成mrna的蛋白质编码区的orf具有egfp。
[0195]
图14是表示由有无gapdh的3
′
utr序列缺失而引起的表达量差异的图。蛋白质表达量通过将图13所示的人工合成mrna导入hela细胞来测定。在图14中，表示将野生型的表达量作为100时的表达量的相对值。
[0196]
由图12、14的结果可知，对于任何缺失变异体，与野生型相比，表达效率都降低。由此可知，gapdh的5
′
utr序列及gapdh的3
′
utr序列同时存在于整个区域有助于提高翻译效率的效果。
[0197]
(v)实验5
[0198]
图15是表示制作成的人工合成mrna的图。通常，gapdh的5
′
utr序列与gapdh的3
′
utr序列在整个区域内具有互补性。在该实验中，使用了具有作为彼此互补性特别高的区域的5
′
utr序列的一部分和3
′
utr序列的一部分的人工合成mrna。具体而言，作为5
′
utr序列，使用了作为将gapdh的5
′
utr序列三分割而成的部分中的最靠5
′
末端侧部分的cu富集区域(28核苷酸)(以下，也称为“5
′
utr28nt”)。作为gapdh的3
′
utr序列，使用了作为将gapdh的3
′
utr序列三分割而成的部分中的最靠5
′
末端侧部分的ag富集区域(28核苷酸)(以下，也称为“3
′
utr 28nt”)。
[0199]
图16是表示由5
′
utr 28nt和3
′
utr 28nt的有无而引起的表达量差异的图。蛋白质表达量通过将人工合成mrna导入hela细胞来测定。在图16中，表示将野生型的表达量作为1时的表达量的相对值。
[0200]
由图16的结果可知，与野生型相比，具有5
′
utr 28nt和3
′
utr 28nt中至少一者的
人工合成mrna的翻译效率降低。由该结果可知，gapdh的5
′
utr序列及gapdh的3
′
utr序列同时存在于整个区域有助于提高翻译效率的效果。
[0201]
(vi)实验6
[0202]
图17是表示制作成的人工合成mrna的图。在该实验中，使用了具有gapdh的5
′
utr序列、且具有与gapdh的5
′
utr序列有规定互补性的3
′
utr序列的人工合成mrna。具体而言，图17所示的人工合成mrna从上到下依次表示具有与gapdh的5
′
utr序列有94％的互补性的3
′
utr序列的人工合成mrna、具有与gapdh的5
′
utr序列有88％的互补性的3
′
utr序列的人工合成mrna、具有与gapdh的5
′
utr序列有75％的互补性的3
′
utr序列的人工合成mrna、具有与gapdh的5
′
utr序列有50％的互补性的3
′
utr序列的人工合成mrna、和具有与gapdh的5
′
utr序列有25％的互补性的3
′
utr序列的人工合成mrna。在该实验中使用的人工合成mrna的5
′
末端附加了帽子结构，并且在3
′
末端附加含72个碱基的多聚a链。另外，作为该实验中使用的人工合成mrna的蛋白质编码区的orf具有egfp。
[0203]
图18是表示由互补性引起的表达量差异的图。蛋白质表达量通过将人工合成mrna导入hela细胞来测定。在图18中，表示将野生型的表达量作为1时的表达量的相对值。
[0204]
根据图18的结果可知，具有与gapdh的5
′
utr序列有50％的互补性的3
′
utr序列的人工合成mrna和具有与gapdh的5
′
utr序列有75％的互补性的3
′
utr序列的人工合成mrna显示出野生型的2.5倍以上的高翻译效率。
[0205]
图19是表示制作成的人工合成mrna的图。在该实验中，使用了具有gapdh的5
′
utr序列、且具有与gapdh的5
′
utr序列有100％的互补性的3
′
utr序列的人工合成mrna。在该实验中使用的人工合成mrna的5
′
末端附加了帽子结构，并且在3
′
末端附加含72个碱基的多聚a链。另外，作为该实验中使用的人工合成mrna的蛋白质编码区的orf具有egfp。
[0206]
图20是表示由互补性引起的表达量差异的图。蛋白质表达量通过将人工合成mrna导入hela细胞来测定。在图20中，表示将野生型的表达量作为100时的表达量的相对值。
[0207]
根据图20的结果，具有与gapdh的5
′
utr序列有100％的互补性的3
′
utr序列的人工合成mrna未发现蛋白质的表达。由该结果可知，具有与gapdh的5
′
utr序列有部分互补性的3
′
utr序列是重要的。
[0208]
(vii)实验7
[0209]
图21是表示制作成的人工合成mrna的图。在该实验中使用的人工合成mrna的5
′
末端附加了帽子结构，并且在3
′
末端附加含72个碱基的多聚a链。另外，该实验以实用化为目的，作为蛋白质编码区，使用了抑癌基因p53的orf。对orf附加了5xflag标签。
[0210]
图22是表示使用了抑癌基因p53时的表达量差异的图。蛋白质表达量通过将人工合成mrna导入至u2os细胞而测定。在图22中，表示将具有与gapdh的5
′
utr序列有75％的互补性的3
′
utr序列的人工合成mrna的表达量作为100时的表达量的相对值。
[0211]
根据图22的结果可知，与作为表达效率高的人工合成mrna而被标准使用的具有β-珠蛋白的3
′
utr序列的人工合成mrna相比，野生型显示约高4倍的翻译效率，具有与gapdh的5
′
utr序列有75％的互补性的3
′
utr序列的人工合成mrna显示约高10倍的翻译效率。
[0212]
图23是用于说明所得到的效果的推测机理的图。本实施方式的人工合成mrna具有gapdh的5
′
非翻译区和gapdh的3
′
非翻译区。或者，本实施方式的人工合成mrna具有5
′
非翻译区和与5
′
非翻译区的互补性为40％以上且80％以下的3
′
非翻译区。换言之，在本实施方
式的人工合成mrna中，相对于gapdh的5
′
utr序列，3
′
utr序列均具有部分互补性。可以认为，这样的部分互补性促进mrna的环状化，从而使核糖体有效地再利用，因此翻译效率提高。
[0213]
(viii)实验8
[0214]
图24是表示使用了基因组编辑基因hcas9时的表达量差异的图。图的纵轴表示表达量(表达(倍增))。在该实验中，使用以下的mrna。图表示将不具有5
′
utr序列及3
′
utr序列时的表达量作为1时的表达量的相对值。
[0215]
·
不具有5
′
utr序列和3
′
utr序列的基因组编辑基因hcas9(对照)
[0216]
·
具有gapdh的5
′
utr序列的人工合成mrna
[0217]
·
具有gapdh的5
′
utr序列、且具有与gapdh的5
′
utr序列有75％互补性的3
′
utr序列的人工合成mrna
[0218]
·
具有gapdh的5
′
utr序列、且具有与gapdh的5
′
utr序列有50％互补性的3
′
utr序列的人工合成mrna
[0219]
根据图24的结果可知，与不具有5
′
utr序列和3
′
utr序列的基因组编辑基因hcas9相比，具有gapdh的5
′
utr序列的人工合成mrna显示2倍以上的翻译效率，具有与gapdh的5
′
utr序列有75％互补性的3
′
utr序列的人工合成mrna和具有与gapdh的5
′
utr序列有50％互补性的3
′
utr序列的3
′
utr序列的人工合成mrna显示5倍以上的翻译效率。
[0220]
图25是表示使用了基因组编辑基因hcas9时的基因组编辑量差异的图。图的纵轴表示基因组编辑量(基因组编辑(倍增))。在该实验中，使用与图24相同的mrna。图表示将不具有5
′
utr序列和3
′
utr序列的基因组编辑基因hcas9的基因组编辑量作为1时的基因组编辑量的相对值。
[0221]
根据图25的结果可知，与不具有5
′
utr序列和3
′
utr序列的基因组编辑基因hcas9相比，具有gapdh的5
′
utr序列的人工合成mrna示出2倍以上的基因组编辑量，具有与gapdh的5
′
utr序列有75％互补性的3
′
utr序列的人工合成mrna和具有与gapdh的5
′
utr序列有50％互补性的3
′
utr序列的人工合成mrna示出3倍以上的基因组编辑量。
[0222]
(ix)实验9
[0223]
图26是表示使用了β-珠蛋白(β-珠蛋白)的5
′
utr时的表达量差异的图。图的纵轴表示表达量(表达(倍增))。在该实验中，使用以下的mrna。图表示将不具有5
′
utr序列及3
′
utr序列的人工合成mrna的表达量作为1时的表达量的相对值。
[0224]
·
具有β-珠蛋白的5
′
utr序列、且具有与β-珠蛋白的5
′
utr序列有100％互补性的3
′
utr序列的人工合成mrna
[0225]
·
具有β-珠蛋白的5
′
utr序列、且具有与β-珠蛋白的5
′
utr序列有92％互补性的3
′
utr序列的人工合成mrna
[0226]
·
具有β-珠蛋白的5
′
utr序列、且具有与β-珠蛋白的5
′
utr序列有88％互补性的3
′
utr序列的人工合成mrna
[0227]
·
具有β-珠蛋白的5
′
utr序列、且具有与β-珠蛋白的5
′
utr序列有74％互补性的3
′
utr序列的人工合成mrna
[0228]
·
具有β-珠蛋白的5
′
utr序列、且具有与β-珠蛋白的5
′
utr序列有50％互补性的3
′
utr序列的人工合成mrna
[0229]
·
具有β-珠蛋白的5
′
utr序列、且具有与β-珠蛋白的5
′
utr序列有24％互补性的3
′
utr序列的人工合成mrna
[0230]
·
β-珠蛋白的5
′
utr序列、且不具有3
′
utr序列的人工合成mrna
[0231]
·
不具有5
′
utr序列和3
′
utr序列的人工合成mrna
[0232]
·
具有gapdh的5
′
utr序列、且具有gapdh的3
′
utr序列的人工合成mrna
[0233]
根据图26的结果可知，具有与β-珠蛋白的5
′
utr序列有74％互补性的3
′
utr序列的人工合成mrna和具有与β-珠蛋白的5
′
utr序列有50％互补性的3
′
utr序列的3
′
utr序列的人工合成mrna显示出优异的翻译效率。
[0234]
(x)实验10
[0235]
图27是表示使用了rps8的5
′
utr时的表达量差异的图。图的纵轴表示表达量(表达(倍增))。在该实验中，使用以下的mrna。图表示将不具有5
′
utr序列和3
′
utr序列的人工合成mrna的表达量作为1时的表达量的相对值。
[0236]
·
具有rps8的5
′
utr序列、且具有与rps8的5
′
utr序列有100％互补性的3
′
utr序列的人工合成mrna
[0237]
·
具有rps8的5
′
utr序列、且具有与rps8的5
′
utr序列有93％互补性的3
′
utr序列的人工合成mrna
[0238]
·
具有rps8的5
′
utr序列、且具有与rps8的5
′
utr序列有86％互补性的3
′
utr序列的人工合成mrna
[0239]
·
具有rps8的5
′
utr序列、且具有与rps8的5
′
utr序列有71％互补性的3
′
utr序列的人工合成mrna
[0240]
·
具有rps8的5
′
utr序列、且具有与rps8的5
′
utr序列有50％互补性的3
′
utr序列的人工合成mrna
[0241]
·
具有rps8的5
′
utr序列、且具有与rps8的5
′
utr序列有29％互补性的3
′
utr序列的人工合成mrna
[0242]
·
具有rps 8的5
′
utr序列、且具有与rps8的5
′
utr序列有14％互补性的3
′
utr序列的人工合成mrna
[0243]
·
具有rps8的5
′
utr序列且不具有3
′
utr序列的人工合成mrna
[0244]
·
不具有5
′
utr序列和3
′
utr序列的人工合成mrna
[0245]
·
具有gapdh的5
′
utr序列且具有gapdh的3
′
utr序列的人工合成mrna
[0246]
根据图27的结果可知，具有与rps8的5
′
utr序列有71％互补性的3
′
utr序列的人工合成mrna和具有与rps8的5
′
utr序列有50％互补性的3
′
utr序列的3
′
utr序列的人工合成mrna显示出优异的翻译效率。
[0247]
(x)实验10
[0248]
图28是表示使用了ldhb的5
′
utr时的表达量差异的图。图的纵轴表示表达量(表达(倍增))。在该实验中，使用以下的mrna。图表示将具有ldhb的5
′
utr序列且不具有3
′
utr序列的人工合成mrna的表达量作为1时的表达量的相对值。
[0249]
·
具有ldhb的5
′
utr序列、且具有与ldhb的5
′
utr序列有100％互补性的3
′
utr序列的人工合成mrna
[0250]
·
具有ldhb的5
′
utr序列、且具有与ldhb的5
′
utr序列有93％互补性的3
′
utr序列的人工合成mrna
[0251]
·
具有ldhb的5
′
utr序列、且具有与ldhb的5
′
utr序列有87％互补性的3
′
utr序列的人工合成mrna
[0252]
·
具有ldhb的5
′
utr序列、且具有与ldhb的5
′
utr序列有75％互补性的3
′
utr序列的人工合成mrna
[0253]
·
具有ldhb的5
′
utr序列、且具有与ldhb的5
′
utr序列有50％互补性的3
′
utr序列的人工合成mrna
[0254]
·
具有ldhb的5
′
utr序列、且具有与ldhb的5
′
utr序列有25％互补性的3
′
utr序列的人工合成mrna
[0255]
·
具有ldhb的5
′
utr序列、且不具有3
′
utr序列的人工合成mrna
[0256]
根据图28的结果可知，具有与ldhb的5
′
utr序列有75％互补性的3
′
utr序列的人工合成mrna和具有与ldhb的5
′
utr序列有50％互补性的3
′
utr序列的3
′
utr序列的人工合成mrna显示出优异的翻译效率。
[0257]
产业实用性
[0258]
根据本发明，导入目标细胞后的人工合成mrna的翻译效率提高，能够实现目标基因的高表达。作为本发明的用途，例如可以设想mrna药物(各种病毒性疾病的治疗、癌免疫疗法等)、ips细胞的制作、干细胞或前体细胞的分化诱导。
[0259]
本发明不受上述发明的实施方式和实施例的说明任何限定。在不脱离权利要求书的记载的情况下，本领域技术人员容易想到的范围内，各种变形方式也包含在本发明中。对于本说明书中明示的论文、公开专利公报及专利文献等的内容，以引用其全部的内容的方式进行引用。