DNA序列的选择性共价捕获

dna序列的选择性共价捕获
1.相关申请的交叉引用
2.本技术是要求于2019年8月9日提交的美国临时申请序列号62/884,867的权益的pct国际申请，所述临时申请以引用的方式整体并入本文中。
3.以电子方式提交的序列表的引用
4.与申请一起提交的以电子方式提交的ascii文本文件(名称umc_52553_19893_seq_list.st25.txt；大小：5640字节；创建日期：2020年8月10日)中的序列表的内容以引用的方式整体并入本文中。
5.关于联邦资助的研究和发展的声明
6.本发明是在美国国立卫生研究院(national institutes of health)颁发的hg009338、美国国立卫生研究院颁发的es021007和美国国立卫生研究院颁发的gm114204的政府支持下完成的。政府对本发明具有一定权利。


背景技术：

7.许多生物分析应用采用共价化学来产生用于检测生物活性小分子(secor,2004；kumar,2013)、蛋白质(chen,2013；sletten,2009；takaoka,2013)、蛋白质-蛋白质复合物(krishnamurthy,2011；pham,2013；sutherland,2008)、蛋白质-核酸复合物(hoffman,2015；simon,2016；engreitz,2014)、rna-rna相互作用(simon,2016；engreitz,2014)、染色质结构(yu,2018)以及具有特定功能性质的蛋白质的稳健信号(cravatt,2008；willems,2014)。特定核酸序列的检测在分子生物学和医学中很重要(katsanis，2013)，但共价途径在这个领域不太常见，部分原因是探针与靶序列的共价附接缺乏实用的、可预测的(可编程的)反应。核酸序列检测几乎普遍依赖于核酸探针链与样品中靶序列的watson-crick配对(demidov,2004)。共价交联反应可被用于将探针链锚定到其靶序列上，从而产生不受变性(熔化)影响的探针-靶复合物，所述变性(熔化)在典型的基于杂交的测定中会导致信号退化(图14)(vieregg,2013；simon,2016；costes,1993)。此外，序列特异性共价交联反应可为特定靶序列增加一层选择性(peng,2008；hattori,2009；nishimoto,2013；stevens,2009；fujimoto,2013)。例如，已证明由探针-靶复合物中的c-c错配处的二氯甲基二乙胺形成的选择性交联可被用于选择性检测braf激酶基因序列中与疾病相关的t
→
c突变(shi，2018)。在单独研究中，采用含有无碱基(ap)位点的反应性探针来选择性检测braf基因中的t
→
a多态性(imani-nejad,2017)。在这种情况下，探针链与靶链的共价交联涉及探针中的ap醛基与靶链中腺嘌呤突变的环外氨基的反应(price,2014；catalano,2016)。


技术实现要素：

8.本文提供产生共价交联的核酸链的方法，所述方法包括孵育杂交的双链核酸分子，所述杂交的双链核酸分子包含：(i)包含待交联的2'-脱氧鸟苷(dg)(靶dg)的靶链；和(ii)包含无碱基(ap)残基的至少部分互补的探针链，其中在杂交的核酸分子中，探针链的ap残基位于紧邻探针链中的与靶链中的靶dg直接相对的核苷酸残基的3'的位置处，并且其
中孵育是在允许在探针链的ap残基和靶dg之间形成共价交联的条件下发生；从而产生共价交联的核酸链。在某些实施方案中，孵育是在nacnbh3存在下发生。在某些实施方案中，孵育是在小于或小于约ph 7、小于或小于约ph 6.0，或小于或小于约ph 5.5并且任选地大于或大于约ph 4.5或大于或大于约ph 5.0的ph值下，例如在或在约ph 5.1、ph 5.2或ph 5.3下发生。
9.本文提供检测核酸靶链中特定位置处dg残基(靶dg)的存在或不存在的方法，所述方法包括孵育杂交的双链核酸分子，所述杂交的双链核酸分子包含：(i)靶链；和(ii)包含无碱基(ap)残基的至少部分互补的探针链，其中探针链的ap残基位于紧邻探针链中的与靶链中的待检测靶dg残基的存在或不存在的特定位置直接相对的核苷酸残基的3'的位置处，其中所述孵育是在允许探针链中的ap残基和靶链中的靶dg残基(如果存在)之间形成共价交联的条件下发生；以及检测靶链和探针链是否发生交联，从而检测靶链中特定位置处靶dg残基的存在或不存在。在某些实施方案中，探针链、靶链，或探针链和靶链两者是dna分子。在某些实施方案中，靶链包含基因组或线粒体dna。在某些实施方案中，探针链和靶链的共价交联是通过凝胶电泳、热稳定性监测、荧光法(即fret)、电化学、表面等离子体共振或基于纳米孔的传感器来检测，并且任选地其中探针链和靶链的共价交联是通过基于纳米孔的传感器来检测。在某些实施方案中，所述检测是定量的。在某些实施方案中，孵育是在nacnbh3存在下发生。在某些实施方案中，孵育是在小于或小于约ph 7、小于或小于约ph 6.0，或小于或小于约ph 5.5并且任选地大于或大于约ph 4.5或大于或大于约ph 5.0的ph值下，例如在或在约ph 5.1、ph 5.2或ph 5.3下发生。
10.本文提供检测野生型序列中的突变的方法，所述方法包括根据本文公开的任何方法检测靶链中特定位置处靶dg残基的存在或不存在。
11.本文提供检测核酸链中dg残基的存在的方法，所述方法包括孵育杂交的双链核酸分子，所述杂交的双链核酸分子包含：(i)包含待检测的dg残基(靶dg)的靶链；和(ii)包含无碱基(ap)残基的至少部分互补的探针链，其中在杂交的分子中，探针链的ap残基位于紧邻探针链中的与靶链中的靶dg残基直接相对的核苷酸残基的3'的位置处，并且其中孵育是在允许探针链中的ap残基和靶链中的靶dg残基之间形成共价交联的条件下发生；以及检测探针链和靶链在探针链中的ap残基和靶dg之间的共价交联，从而检测靶链中靶dg残基的存在。在某些实施方案中，探针链、靶链，或探针链和靶链两者是dna分子。在某些实施方案中，靶链是基因组或线粒体dna。在某些实施方案中，探针链和靶链的共价交联是通过凝胶电泳、热稳定性监测、荧光法(即fret)、电化学、表面等离子体共振或基于纳米孔的传感器来检测，并且任选地其中探针链和靶链的共价交联是通过基于纳米孔的传感器来检测。在某些实施方案中，所述检测是定量的。在某些实施方案中，孵育是在nacnbh3存在下发生。在某些实施方案中，孵育是在小于或小于约ph 7、小于或小于约ph 6.0，或小于或小于约ph 5.5并且任选地大于或大于约ph 4.5或大于或大于约ph 5.0的ph值下，例如在或在约ph 5.1、ph 5.2或ph 5.3下发生。
12.本文提供共价交联的杂交的双链核酸分子，所述共价交联的杂交的双链核酸分子包含含有无碱基(ap)残基的探针链和包含2'-脱氧腺苷(dg)残基的靶链，其中ap残基位于紧邻探针链中的与靶链中的dg残基直接相对的核苷酸残基的3’的位置处，并且其中ap残基与靶链中的dg残基共价交联，所述靶链中的dg残基与探针链中的紧邻ap残基的3’的核苷酸
残基直接相对。在某些实施方案中，探针链、靶链，或探针链和靶链两者是dna分子。在某些实施方案中，靶链包含基因组或线粒体dna。并且，在某些实施方案中，核酸分子是分离的。
附图说明
13.图1a,b.图1显示探针1和12对对应于kras nc35c》g的序列的选择性共价捕获。在37℃下在含有nacnbh3(200mm)的乙酸钠(750mm,ph 5.2)缓冲液中将探针-靶双链体孵育24小时。加入甲酰胺上样缓冲液，并且通过在变性20％聚丙烯酰胺凝胶上电泳来拆分样品中的dna。分离后，将凝胶中的
32
p标记的寡核苷酸通过磷相仪分析可视化。a：探针1对突变型和野生型kras序列的共价捕获。泳道1：5'-32
p标记的含ap的探针1；泳道2：用哌啶处理以在ap位点诱导切割的探针1；泳道3：探针-突变体复合物中的交联形成；泳道4：探针-野生型复合物中的交联形成。b：探针12对突变型和野生型kras序列的共价捕获。泳道1：5'-32
p标记的含ap的探针12；泳道2：用哌啶处理以在ap位点诱导切割的探针12；泳道3：探针-突变体复合物中的交联形成；泳道4：探针-野生型复合物中的交联形成。示出的值是从三个或更多个测量值计算的平均值和标准偏差。
14.图2.图2示出反应性的含ap探针(在所示序列中x＝ap)对突变型kras与wt kras基因序列的共价捕获(交联)的产率和选择性。如图1所述的那样进行交联反应和凝胶电泳分析。探针1的序列被设计用于生成完全碱基配对的探针-靶复合物。探针2-5在探针靶复合物中的不同位置处正式引入错配(在所示序列中加有下划线)。探针-突变体复合物中生成的交联产率是每一对的顶部条(灰色)，并且探针-wt复合物是每一对中的底部条(黑色)。
15.图3.图3示出反应性的含ap探针(在所示序列中x＝ap)对突变型kras与wt kras基因序列的共价捕获(交联)的产率和选择性。如图1所述的那样进行交联反应和凝胶电泳分析。探针序列以在探针-靶复合物的靶链上正式引入膨出部的方式变化。探针-突变体复合物中产生的交联产率是每一对的顶部条(灰色)，并且探针-wt复合物中产生的交联产率是每一对的底部条(黑色)。
16.图4.图4示出反应性的含ap探针(在所示序列中x＝ap)对突变型kras与wt kras基因序列的共价捕获(交联)的产率和选择性。如图1所述的那样进行交联反应和凝胶电泳分析。探针序列以在探针-靶复合物的探针链上正式引入膨出部的方式改变。探针-突变体复合物中产生的交联产率是每一对的顶部条(灰色)，并且探针-wt复合物中产生的交联产率是每一对的底部条(黑色)。
17.图5a,b.图5显示在探针12与含有不同比率的突变型kras和wt kras序列的混合物的反应中可检测到两种不同交联的物质的形成。如图1所述的那样进行交联反应和凝胶电泳分析。a：由探针12与突变型kras和野生型kras序列的混合物的交联形成的凝胶电泳分析。与野生型序列形成的低产率交联明显区别于与突变型kras序列形成的高产率交联。b：凝胶电泳数据图，其示出通过将探针12与含有不同比率的野生型kras和突变型kras序列的混合物一起孵育产生的探针-野生型和探针-突变型交联的产率。
18.图6.图6例示了通过探针链中的ap位点与靶链中的鸟嘌呤残基的反应共价捕获靶序列的方案1。
19.图7.图7列出了实施例中使用的寡核苷酸的序列：突变靶nc35c》g(seq id no:1)；野生型靶(seq id no:2)；探针1(seq id no:3)；探针2(seq id no:4)；探针3(seq id no:
5)；探针4(seq id no:6)；探针5(seq id no:7)；探针6(seq id no:8)；探针7(seq id no:9)；探针8(seq id no:10)；探针9(seq id no:11)；探针10(seq id no:12)；探针11(seq id no:13)；和探针12(seq id no:14)。
20.图8.图8示出了具有对应于nc35c》g变体(mut)和野生型(wt)kras基因序列的序列的各种探针的共价捕获(交联形成)的产率。
21.图9.图9是比较各种含ap的探针对突变型kras和wt kras序列的共价捕获的产率和选择性的条形图。所示的探针-靶复合物是kras基因序列的nc35c》g变体(mut)。探针-突变体复合物中产生的交联产率显示在每一对的顶部条(灰色)中，并且探针-wt(nc35c而不是g)kras序列中产生的交联产率显示在每一对的底部条(黑色)中。误差杠绘示了从至少三个测量值计算的标准偏差。
22.图10.图10示出了铁-edta足迹，其证明探针12在双链体w中的交联产生涉及在nc35c》g kras序列中的鸟嘌呤突变处附接。在这个实验中，在铁-edta-h2o2dna切割试剂产生的切割产物的“梯带”中断之前，交联附接位点作为最后一条带(用箭头标记)出现，这是因为超出交联的切割产生大的、缓慢迁移的dna片段(参见于泳道4的上部)，这些片段与相对链连接(luce,r.a.；hopkins,p.b.methods enzymol.2001,340,396-412)。泳道1：未交联对照的fe-edta切割；泳道2：是5'-32
p标记的nc35c》g靶链上的maxam-gilbert g特异性切割(测序)反应；泳道3是5'-32
p标记的nc35c》g靶链的a g特异性切割(测序)反应；泳道4是分离的探针-靶双链体的羟基自由基足迹反应(
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p标记在nc35c》g靶链上)。将
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p标记的寡脱氧核苷酸在20％变性聚丙烯酰胺凝胶上拆分，并通过磷相仪分析进行可视化。
23.图11.图11示出了双链体w中交联形成的时间过程。将探针-靶双链体w在含有nacnbh3(250mm)的乙酸钠缓冲液(750mm,ph 5)中在37℃下孵育。在不同的时间从反应中取出等分试样，将dna用乙醇沉淀，并储存在
–
20℃下直到进行电泳分析。将样品溶解于甲酰胺上样缓冲液中，上样到变性20％聚丙烯酰胺凝胶上，并通过电泳拆分出dna片段。将
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p标记的寡脱氧核苷酸在20％变性聚丙烯酰胺凝胶上拆分，并通过磷相仪分析进行可视化。该图显示了随时间变化的交联产率百分比。
24.图12.图12示出了ph对探针12共价捕获突变型kras和野生型kras基因序列(双链体w和x)的产率和选择性的影响。泳道1：标记的探针链；泳道2：用哌啶处理以在ap位点诱导链切割的探针链(0.1m哌啶，30分钟，95℃)；泳道3：双链体w，乙酸钠(750mm，ph 5.2)和nacnbh3(200mm)；泳道4：双链体w，hepes(50mm,ph 7)、nacl(100mm)和nacnbh3(200mm)；泳道5：双链体x，乙酸钠(750mm，ph 5.2)和nacnbh3(200mm)；泳道6：双链体x，hepes(50mm,ph 7)、nacl(100mm)和nacnbh3(200mm)。
25.图13.图13显示铁-edta足迹提供了表明探针12在双链体x中的交联产生涉及在野生型(wt)kras序列中的相对腺嘌呤残基处附接的证据。在这个实验中，在铁-edta-h2o2dna切割试剂产生的切割产物的“梯带”中断之前，交联附接位点作为最后一条带(用箭头标记)出现，这是因为超出交联的切割产生大的、缓慢迁移的dna片段(参见于泳道4的上部)，这些片段与相对链连接(luce,r.a.；hopkins,p.b.methods enzymol.2001,340,396-412)。泳道1：未交联对照的fe-edta切割；泳道2：是5'-32
p标记的wt靶链上的maxam-gilbert g特异性切割(测序)反应；泳道3是5'-32
p标记的wt靶链的a g特异性切割(测序)反应；泳道4是分离的探针-wt双链体的羟基自由基足迹反应(
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p标记在野生型靶链上)。将
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p标记的寡脱氧核
苷酸在20％变性聚丙烯酰胺凝胶上拆分，并通过磷相仪分析进行可视化。探针-靶复合物有可能以(至少)两种不同的形式存在(如上图，左图)。wt kras序列中的交联形成可通过具有膨出的腺嘌呤残基(左上)或膨出的鸟嘌呤残基(左下)的双链体进行。具有膨出的腺嘌呤的复合物将靶腺嘌呤残基置于潜在有利的交联形成排列中，类似于在以下中所见：imani nejad,m.等人,chembiochem.2017,18,1383-1386。
26.图14.图14说明，虽然核酸链的杂交是可逆的，产生不稳定并可导致信号丢失的探针-靶复合物，但探针-靶双链体的共价链间交联提供了更稳定的信号。
具体实施方式
27.下文紧接定义的术语通过整体参考说明书而被更完全地定义。就提供描述性支持所必需的程度而言，所附权利要求书的主题和/或文本以全文引用的方式整体并入本文中。
28.定义
29.本书面描述的所有读者都将理解，本文描述和要求保护的示例性方面和实施方案可在不存在本文中具体公开或未具体公开的任何所叙述的特征、要素或步骤的情况下适当地实践。
30.术语“一”(“a”或“an”)实体是指所述实体中的一个或多个；例如，“一探针”应理解为代表一个或多个“探针”。因此，术语“一(“a”(或“an”))”、“一个(种)或多个(种)”和“至少一个/种”在本文可互换使用。
31.术语“和(以及/并且)/或(或者)”当在本文使用时应当视为具体公开了所具体指定的特征或组分中的每一者与另一者在一起或不与另一者在一起。因此，本文在短语例如“a和/或b”中使用的“和/或”意欲包括“a和b”、“a或b”、“a”(单独)和“b”(单独)。同样，如在短语例如“a、b和/或c”中使用的“和/或”意欲涵盖以下实施方案中的每一种：a、b和c；a、b或c；a或c；a或b；b或c；a和c；a和b；b和c；a(单独)；b(单独)；和c(单独)。
32.应理解，每当在本文用语言“包含”来描述方面时，还提供了以“由
……
组成”和/或“基本上由
……
组成”描述的其他类似方面。
33.除非另有定义，否则本文使用的技术和科技术语具有与本公开相关领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。例如，除非另有说明，否则“互补的”碱基对是指a/t和g/c碱基配对。
34.数值范围将限定范围的数值包括在内。即使在列举值的清单(即，1、2、3或4)时没有用“以及之间的任何范围”等明确标识，本公开也明确地包括这些值之间的任何范围，即，1至3、1至4、2至4等。
35.本文提供的标题仅是为了便于参考，而不是对本公开的各个方面或方面的限制，本公开的各个方面或方面可通过整体参考本专利说明书而得。
36.如本文所用，术语“同一性”，即与本文公开的氨基酸序列或核苷酸序列的“同一性百分比”是指两个或更多个核苷酸序列之间或两个或更多个氨基酸序列之间的关系。当一个序列中的一个位置被比较序列的相应位置中的相同核酸碱基或氨基酸占据时，这些序列被说成在所述位置处是“同一的”。“序列同一性”百分比是通过确定两个序列中出现同一核酸碱基或氨基酸的位置的数量来计算，从而产生“同一”位置的数量。然后将“同一”位置的数量除以比较窗口中的位置总数并乘以100从而得出“序列同一性”的百分比。“序列同一
性”的百分比是通过在比较窗内比较两个最佳比对的序列来确定。为了最佳地比对序列以进行比较，比较窗口中的核苷酸或氨基酸序列的部分可包含称为空位的添加或缺失，而参考序列保持不变。最佳比对是这样的比对，其即使有空位，也能在参考序列和比较序列之间产生尽可能多的数量的“同一”位置。两个序列之间的“序列同一性”的百分比可使用、即可从国家生物技术信息中心(national center for biotechnology informatio)获得的程序“blast”来确定，该程序结合了程序blastn(用于核苷酸序列比较)和blastp(用于氨基酸序列比较)，这两种程序基于karlin和altschul的算法(proc.natl.acad.sci.usa 90(12):5873-5877,1993)。
37.如本文所用，当提及核酸分子时，术语“互补的”被给予其用于如本领域所理解的互补watson-crick碱基配对的标准定义。“互补性百分比(％)”可如针对“同一性百分比”所解释的那样确定，但是是基于有义链和反义链对准时互补位置的数量，而不是基于比对中的同一位置。
38.术语“核酸”是本领域众所周知的术语并且在本文中用于包括dna和rna。除非另有说明，否则“核酸”分子和“多核苷酸”可互换使用。核酸可包含常规的磷酸二酯键或非常规的键(即，酰胺键，例如在肽核酸(pna)中发现的)。在某些方面，核酸是dna。“分离的”核酸欲指这样的核酸分子，其已从其天然环境，例如从受试者获得的基因组dna的样品中被移出。分离的rna分子包括多核苷酸的体内或体外rna转录物。分离的多核苷酸或核酸进一步包括以合成方式产生的此类分子。
39.如本文所用，术语“工程化的”包括通过合成方式(即通过重组技术、体外肽合成，通过肽的酶促或化学偶联，或这些技术的某些组合)对核酸或多肽分子的操作。
40.综述
41.共价反应广泛用于生物分析化学中，用于检测生物活性代谢物、蛋白质-蛋白质复合物和具有特定催化功能的蛋白质。特定核酸序列的检测在分子生物学和医学中很重要，并且共价交联反应有可能增强对特定靶序列的选择性并防止探针-靶复合物变性(熔化)，所述变性(熔化)在典型的基于杂交的测定中会导致信号退化(参见例如us20190271029a1，其通过引用整体并入本文中)。尽管如此，共价途径在这个领域中并不常见，部分原因是缺乏用于共价捕获靶序列的简单且可靠的反应。本文公开了化学反应性核酸探针，其与包含2'-脱氧鸟苷(dg)残基的靶序列杂交并共价捕获所述靶序列，例如在对应于人kras基因(seq id no:15)的癌症驱动变体的35位处的胞嘧啶至鸟嘌呤突变中。这种途径利用还原胺化反应以在探针链中的无碱基位点和dg之间产生稳定的共价附接。重要的是，公开了向探针-靶双链体中引入非规范结构(例如膨出部和错配)可显著提高探针捕获靶dg序列的产率和选择性方面的性能。在某些实施方案中，含有无碱基位点的探针能够同时定量检测混合物中存在dg的序列和不存在dg的序列。
42.本文公开了独特的交联反应的效用，所述交联反应被设计为扩展用于共价捕获定义的dna序列的库。这个过程利用探针链中的ap醛基与靶序列中鸟嘌呤残基的环外氨基之间的还原胺化反应，以产生稳定的共价交联的探针-靶复合物(方案1；图6)(dutta,2007；johnson,2013)。该反应通过亚胺中间体的初始平衡形成进行，随后亚胺中间体被氰基硼氢化钠(nacnbh3)(borch,1971)还原从而得到n
2-烷基鸟嘌呤交联(dutta,2007；johnson,2013)。重要的是，证明了将非规范结构(例如膨出部和错配)引入到探针-靶双链体中的探
针序列显著提高了共价捕获靶序列的产率和选择性。
43.交联的探针-靶分子可通过许多方案，例如通过典型的荧光(a.p.silverman等人,chem.rev.2006,106,3775；j.g.wetmur,crit.rev.biochem.mol.biol.,1991,26,227；s.tyagi等人,nat.biotechnol.1996,14,303；a.p.silverman等人,adv.clin.chem.2007,43,79；v.v.demidov等人,trends biochem.sci.2004,29,62；l.hu等人,biomark.res.2014,2,3)、比色法(i.alexandre等人,anal.biochem.2001,295,1)或电化学方法(x.li等人,anal.chem.2006,78,6096)检测。在某些方面，纳米孔技术与序列特异性交联化学相结合，为核酸序列的单分子传感提供了高对比度(本质上是数字)的信号。
44.产生共价交联的核酸链的方法。
45.本文提供了产生共价交联的核酸链的方法。所述方法包括孵育杂交的双链核酸分子，所述杂交的双链核酸分子包含：(i)包含待交联的2'-脱氧鸟苷(dg)(本文称为“靶dg”)的靶链；和(ii)包含无碱基(ap)残基的至少部分互补的探针链。在某些实施方案中，出于检测和/或鉴定靶链中靶dg残基的存在的目的而执行此类方法。在某些实施方案中，探针链、靶链，或探针链和靶链两者是dna分子。并且，在某些实施方案中，靶链包含例如来自取自生物体的生物样品的基因组或线粒体dna，基本上由其组成或由其组成。在杂交的核酸分子中，探针链的ap残基位于紧邻探针链中的与靶链中的靶dg直接相对的核苷酸残基的3'的位置处。为了说明，双链核酸序列：
46.探针链
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
5'gcxgg 3'
47.靶链
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
3'cgacc 5'。
48.探针链(顶部)中的c残基与靶链(底部)中的靶dg残基直接相对，并且探针链中的ap残基(x)紧邻探针链中的与靶链中的靶dg残基直接相对的c残基的3'。杂交的双链核酸分子的孵育是在允许探针链的ap残基和靶dg之间形成共价交联的条件，例如在别处更详细描述的那些条件下发生，从而产生共价交联的核酸链。在某些实施方案中，孵育是在nacnbh3存在下发生。在某些实施方案中，孵育是在小于或小于约ph 7、小于或小于约ph 6.0，或小于或小于约ph 5.5并且任选地大于或大于约ph 4.5或者大于或大于约ph 5.0的ph值下发生。例如，在某些实施方案中，孵育是在或在约ph 5.1、ph 5.2或ph 5.3下发生。在某些实施方案中，孵育是在20℃和42℃之间或在约20℃和42℃之间或两者之间的任何特定值下，例如在24℃和37℃之间或在约24℃和37℃之间或两者之间的任何特定值下发生。在某些实施方案中，孵育是在或在约24℃或37℃下发生。
49.如本文所述，杂交的核酸分子的交联可增加其稳定性。进一步地，杂交的核酸分子如何交联也可产生可区分的特征。例如，在某些实施方案中，包含介于探针链的ap残基和靶链的靶dg残基之间的交联的交联的杂交双链分子在稳定性和/或凝胶迁移率方面与除了在靶链的靶dg位置处具有dc、da或dt取代之外同一的也交联的杂交双链分子是可区分的。例如，在某些实施方案中，包含介于探针链的ap残基和靶链的靶dg残基之间的交联的交联的杂交双链分子在稳定性和/或凝胶迁移率方面与除了在靶链的靶dg位置处具有dc取代之外同一的也交联的杂交双链分子是可区分的。此种取代可指示基因的某个等位基因(无论野生型或突变型)，包括当被识别时可帮助预测和/或诊断某些疾病或疾病状态的等位基因。在某些实施方案中，靶链中dg残基的存在或不存在可用于确定对治疗的潜在抗性和/或疾病、癌症、肿瘤等的最佳治疗选择。在某些实施方案中，所述方法进一步包括检测探针链和
靶链的共价交联。在某些实施方案中，所述检测检测和/或鉴定靶链中dg残基(靶dg)的存在。在某些实施方案中，检测是通过凝胶电泳、热稳定性监测、荧光法(即，fret)、电化学、表面等离子体共振或基于纳米孔的传感器进行，任选地，其中所述检测是通过基于纳米孔的传感器进行。这样的检测方法可提供交联形成和/或交联形成类型的定性评估，并且在某些实施方案中还可提供交联形成(包括形成的交联的类型)的定量检测。
50.检测核酸靶链中特定位置处dg残基的存在或不存在的方法。
51.本文提供了检测核酸靶链中特定位置处dg残基(靶dg)的存在或不存在的方法。所述方法包括孵育杂交的双链核酸分子，所述杂交的双链核酸分子包含(i)靶链；和(ii)包含无碱基(ap)残基的至少部分互补的探针链。在某些实施方案中，探针链、靶链，或探针链和靶链两者是dna分子。并且，在某些实施方案中，靶链包含例如来自取自生物体的生物样品的基因组或线粒体dna。如本文别处所例示，在杂交的核酸分子中，探针链的ap残基位于紧邻探针链中的与靶链中的待检测靶dg残基的存在或不存在的特定位置直接相对的核苷酸残基的3'的位置处。杂交的双链核酸分子的孵育是在允许探针链的ap残基和靶链中的靶dg残基(如果存在)之间形成共价交联的条件，例如在别处更详细描述的那些条件下发生。在某些实施方案中，孵育是在nacnbh3存在下发生。在某些实施方案中，孵育是在小于或小于约ph 7、小于或小于约ph 6.0，或小于或小于约ph 5.5并且任选地大于或大于约ph 4.5或者大于或大于约ph 5.0的ph值下发生。例如，在某些实施方案中，孵育是在或在约ph 5.1、ph 5.2或ph 5.3下发生。在某些实施方案中，孵育是在20℃和42℃之间或在约20℃和42℃之间或两者之间的任何特定值下，例如在24℃和37℃之间或在约24℃和37℃之间或两者之间的任何特定值下发生。在某些实施方案中，孵育是在或在约24℃或37℃下发生。
52.在某些实施方案中，所述方法进一步包括检测靶链和探针链是否发生交联，从而检测靶链中特定位置处靶dg残基的存在(ap残基与靶dg发生交联)或不存在(ap残基与靶dg未发生交联)。在某些实施方案中，探针链和靶链的共价交联是通过凝胶电泳、热稳定性监测、荧光法(即fret)、电化学、表面等离子体共振或基于纳米孔的传感器来检测，并且任选地其中探针链和靶链的共价交联是通过基于纳米孔的传感器来检测。这样的检测方法可提供交联形成和/或交联形成类型的定性评估，并且在某些实施方案中还可提供交联形成(包括形成的交联的类型)的定量检测。在某些实施方案中，靶dg存在于靶链中的特定位置处，并且探针链中的ap残基和靶链中的靶dg之间形成共价交联。因此，在某些实施方案中，所述方法检测靶链中dg残基的存在。在某些其他实施方案中，靶dg不存在于靶链中的特定位置处，并且探针链中的ap残基和靶dg之间不形成共价交联。因此，在某些实施方案中，所述方法检测靶链中dg残基的不存在。
53.检测核酸链中dg残基的存在的方法。
54.本文提供了检测核酸链中dg残基的存在的方法。所述方法包括孵育杂交的双链核酸分子，所述杂交的双链核酸分子包含(i)包含待检测的dg残基(靶dg)的靶链；和(ii)包含无碱基(ap)残基的至少部分互补的探针链。在某些实施方案中，探针链、靶链，或探针链和靶链两者是dna分子。在某些实施方案中，靶链是例如来自取自生物体的生物样品的基因组或线粒体dna。如本文别处所例示，在杂交的核酸分子中，探针链的ap残基位于紧邻探针链中的与靶链中的靶dg残基直接相对的核苷酸残基的3'的位置处。孵育是在允许探针链中的ap残基和靶链中的靶dg残基之间形成共价交联的条件，例如在别处更详细描述的那些条件
下发生。在某些实施方案中，孵育是在nacnbh3存在下发生。在某些实施方案中，孵育是在小于或小于约ph 7、小于或小于约ph 6.0，或小于或小于约ph 5.5并且任选地大于或大于约ph 4.5或者大于或大于约ph 5.0的ph值下发生。例如，在某些实施方案中，孵育是在或在约ph 5.1、ph 5.2或ph 5.3下发生。在某些实施方案中，孵育是在20℃和42℃之间或在约20℃和42℃之间或两者之间的任何特定值下，例如在24℃和37℃之间或在约24℃和37℃之间或两者之间的任何特定值下发生。在某些实施方案中，孵育是在或在约24℃或37℃下发生。
55.在某些实施方案中，所述方法进一步包括检测探针链和靶链的在探针链中的ap残基与靶dg之间的共价交联；从而检测靶链中靶dg残基的存在。在某些实施方案中，探针链和靶链的共价交联是通过凝胶电泳、热稳定性监测、荧光法(即fret)、电化学、表面等离子体共振或基于纳米孔的传感器来检测，并且任选地其中探针链和靶链的共价交联是通过基于纳米孔的传感器来检测。这样的检测方法可提供交联形成和/或交联形成类型的定性评估，并且在某些实施方案中还可提供交联形成(包括形成的交联的类型)的定量检测。
56.检测野生型序列中的突变的方法。
57.本文提供了检测野生型序列中的突变的方法。所述方法包括根据所述方法中的任一种和使用上述或本文其他任何地方描述的核酸检测靶链中特定位置处靶dg残基的存在或不存在。在某些实施方案中，靶dg残基存在于靶链中的特定位置处并且突变包括t
→
g、a
→
g或c
→
g突变。在某些其他实施方案中，dg残基在靶链中的特定位置处不存在并且突变包括g
→
t、g
→
a或g
→
c突变。
58.在某些实施方案中，靶链中dg残基的存在或不存在代表疾病相关突变，例如癌症相关突变。在某些实施方案中，靶链中dg残基的存在或不存在可用于确定对治疗的潜在抗性和/或疾病、癌症、肿瘤等的最佳治疗选择。
59.共价交联的、杂交的双链核酸分子。
60.本文提供了共价交联的杂交的双链核酸分子。所述分子包含含有无碱基(ap)残基的探针链和包含2'-脱氧腺苷(dg)残基的靶链，其中如本文别处所例示，ap残基位于紧邻探针链中的与靶链中的dg残基直接相对的核苷酸残基的3'的位置处，并且ap残基与靶链中的dg残基共价交联，所述靶链中的dg残基与探针链中的紧邻ap残基的3’的核苷酸残基直接相对。在某些实施方案中，核酸分子是分离的。在某些实施方案中，探针链、靶链，或探针链和靶链两者是dna分子。在某些实施方案中，靶链是例如来自取自生物体的生物样品的基因组或线粒体dna。
61.在上文和本文任何地方公开的方法和核酸中的任一者的某些实施方案中，紧邻地侧接探针链中ap残基的5'和3'的序列可与靶链中的相应序列完全互补，或者它可被改变，使得在杂交的分子中某些相对残基错配并且/或者在靶链或探针链中形成膨出部。探针链中紧邻地侧接ap残基的5'和3'的包括ap残基在内的序列、区域、区段等可被定义为探针链序列的5、6、7、8或9个核苷酸长的区段，即紧靠ap残基的5'的2、3或4个核苷酸至紧靠ap残基的3'的2、3或4个核苷酸。例如，其中x是探针链的ap残基并且y是紧邻地侧接ap残基的5'和3'的包括ap残基在内的5个核苷酸长的探针链区段的其他残基，该序列可以是5'yyxyy3'。例如，其中x是探针链的ap残基并且y是紧邻地侧接ap残基的5'和3'的包括ap残基在内的6个核苷酸长的探针链区段的其他残基，该序列可以是5’yyxyyy 3’或5’yyyxyy3’。例如，其中x是探针链的ap残基并且y是紧邻地侧接ap残基的5'和3'的包括ap残基在内的7个核苷酸
长的探针链区段的其他残基，该序列可以是5'yyyxyyy 3'或5'yyyyxyy 3'或5'yyxyyyy 3'等。在某些实施方案中，探针链中紧邻地侧接ap残基的5'和3'的包括ap残基在内的序列包含以下，基本上由以下组成，或由以下组成：(i)探针链和靶链(例如，本文别处公开的探针1)之间在除ap残基位置之外的位置处完全互补的碱基配对。在其他实施方案中，紧邻地侧接探针链中ap残基的5'和3'的序列包含以下，基本上由以下组成或由以下组成：(ii)紧靠探针链上ap残基的5'的核苷酸残基与靶dg(例如，本文别处公开的探针2)之间的错配，其中在某些此类实施方案中，紧靠探针链的ap残基的5'的核苷酸残基是a、t或g；(iii)紧靠探针链的ap残基的3'的核苷酸残基与靶链(例如，本文别处公开的探针3、4和5)上直接相对的残基之间的错配；(iv)在靶链(例如，本文别处公开的探针6、7和8)中形成膨出部的序列；和/或(v)在探针链(例如，本文别处公开的探针9、10、11和12)中形成膨出部的序列，其中在某些此类实施方案中，在探针链中形成膨出部的探针链序列包含紧邻探针链中的ap残基的3'的不具有靶链序列中的相应残基的核苷酸的插入，任选地，其中插入是a的插入。已经发现，在某些实施方案中，使用与(ii)、(iii)、(iv)或(v)一致的探针链序列可提供优于使用具有完全互补碱基配对的探针链序列的益处。在某些实施方案中，这样的益处可以是交联反应的产率增加和/或ap残基对靶dg残基的选择性相对于其他交联形成增加。
62.在上文和本文任何地方公开的方法和核酸中的任一者的某些实施方案中：(i)靶链包含靶dg残基的5'的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、40或50个核苷酸和靶dg残基的3'的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、40或50个核苷酸；并且/或者(ii)探针链包含ap残基的5'的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、40或50个核苷酸和ap残基的3'的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、40或50个核苷酸。在某些实施方案中：(i)靶链包含位于靶dg残基的5'的不超过3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、40、50或100个核苷酸和位于靶dg残基的3'的不超过3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、40、50或100个核苷酸；并且/或者(ii)探针链包含位于ap残基的5'的不超过3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、40、50或100个核苷酸和位于ap残基的3'的不超过3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、40、50或100个核苷酸。在某些实施方案中：(i)靶链的长度是至少或至少约以下、是或是约以下，或介于以下的任一者之间或介于约以下的任一者之间：12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸；(ii)探针链的长度小于或小于约以下、是或是约以下，或介于以下的任一者之间或介于约以下的任一者之间：100、90、80、70、60、50、40、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13或12个核苷酸；并且/或者(iii)杂交的核酸分子包含含有探针链的ap残基和靶链的靶dg残基的杂交的序列部分，其长度是至少或至少约以下、是或是约以下，或介于以下的任一者之间或介于约以下的任一者之间：12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90或100个邻接核苷酸。如本文所指出的，探针链与靶链至少部分互补以允许探针链与靶链杂交，特别是在探针链中紧邻地侧接ap残基的5’和3’的包括ap残基在内的区域与靶链中靶dg(无论存在或不存在)的特定位置的区域中杂交。在某些实施方案中，含有探针链的ap残基和靶链的靶dg残基位置的杂交部分除所述ap残基的位置之外具有至少或至少约以下、以下或约以下，或介于以下的任一者之间或介于约以下的任一者之间的互补性：50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，或者具有100％互补性。
63.在上文和本文任何地方公开的方法和核酸中的任一者的某些实施方案中，探针链和/或靶链包含与链的5'端、3'端，或5'端和3'端两者共价附接的末端延伸部(terminal extension)。在某些实施方案中，末端延伸部与链的3'端共价附接，并选自由以下各项组成的群组：聚(dc)
(3-33)
(poly(dc)
(3-33)
)、聚(dg)
(3-33)
(poly(dg)
(3-33)
)、聚(da)
(3-33)
(poly(da)
(3-33)
)、聚(dt)
(3-33)
(poly(dt)
(3-33)
)和聚(dn)
(3-33)
(poly(dn)
(3-33)
)，其中n是2'-脱氧胞嘧啶、2'-脱氧鸟苷、2'-脱氧腺苷、胸腺嘧啶、无碱基物(abase)、肌苷、黄嘌呤核苷、7-甲基鸟苷、二氢尿苷或5-甲基胞苷的任何组合。
64.在某些具体的、非限制性的例示性实施方案中，将上述交联反应应用于检测对应于人kras基因序列的非编码链中第35位的c
→
g突变的dna序列(nc35c》g，此突变对应于kras基因的编码链中的c35g
→
c易位)(riely,2008)。这种遗传变体导致kras蛋白中的癌症驱动g12a取代(knickelbein,2015)。发现dg-ap交联反应可用于突变型kras序列的选择性共价捕获。
65.通过含ap的探针链与靶链中的鸟嘌呤残基的反应来选择性地共价捕获癌症驱动kras基因序列。
66.本文公开了其中ap位点与nc35c》g kras基因序列中的鸟嘌呤突变选择性交联的探针。探针序列1(图1a和图2)被设计为将ap位点定位在远离探针-靶复合物中的靶鸟嘌呤残基1nt处。这种设计基于先前的观察，即ap醛可与相对于ap位点的5'侧偏移1nt的相对链上的鸟嘌呤残基形成共价交联(双链体a，图1)(dutta,2007；johnson,2013)。这种途径进一步认识到，在交联反应中加入与水相容的氢化物还原剂nacnbh3有可能通过还原胺化反应(方案1；图6)(johnson，2013)产生可观(约20％)的产率的化学稳定的dg-ap链间交联。在当前研究开始时，这种链间dna交联反应的范围和普遍性是未知的，之前仅在两种不同的序列环境中进行了检查(johnson，2013；dutta，2007；和imani-nejad，2019)。
67.通过用酶尿嘧啶dna糖基化酶(udg)处理相应含2'-脱氧尿嘧啶的寡核苷酸来制备含有反应性ap位点的21nt的5'-32
p标记的探针链1(varshney,1991；lindahl,1977；和stuart,1987)。通过哌啶诱导的在ap位点处的切割以产生短的10nt 32p标记的片段来确认探针中ap残基的安装(图1a，泳道2)(mchugh，1995；stuart，1987)。将5'-32
p标记的、含ap的探针链与突变型kras靶序列在含有nacnbh3(200mm)的乙酸钠缓冲液(0.75m,ph5.2)中一起孵育，之后将
32
p标记的产物在变性的20％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析。交联的21bp探针-靶复合物被检测为7.2
±
0.9％产率的特征性缓慢迁移带(dutta,2007；johnson,2013；hartley,1993)(图1a)。将含ap的探针链与野生型(wt)kras序列一起孵育，以显著较低的产率(1.7
±
1.1％)产生缓慢迁移的交联带。因此，探针1为突变序列(双链体a，图1a)提供的信号比为wt序列(双链体b，图1a)提供的信号高4.2倍，并且突变序列和wt序列之间的交联产率相差5.5％。由缺乏靶鸟嘌呤残基的双链体中的交联产生引起的背景信号的来源将在下面进一步讨论。
68.将错配引入到探针-靶复合物中的探针序列可提高共价捕获突变型kras序列的选择性和产率。
69.基于观察到的含ap的探针1对突变型kras序列的选择性检测，理论上认为正式将非规范结构(例如错配和膨出部)引入到探针-靶复合物中的探针序列的改变将改善与突变型kras靶序列形成共价交联的选择性和产率。此外，先前已证明，探针-靶复合物中的错配
显著提高了含ap的探针链选择性检测braf基因序列中的t
→
a突变的能力(imani-nejad,2017)。首先检查与探针-突变体复合物(双链体c，图2)中的靶鸟嘌呤残基产生g/a错配的含ap的探针2的性能。然而，ap探针序列的这种改变显著降低了检测突变型kras序列的产率和选择性(与突变体交联产率为4.2
±
0.6％，而对于wt序列为2.6
±
0.4％产率)。接下来检查位于突变序列(探针3-5)中靶鸟嘌呤残基远端的ap位点的3'侧的错配的影响。发现这个位置中的错配显著提高了探针与突变序列相对于wt序列交联的产率和选择性(双链体e-j，图2)。在这个系列中，利用产生a/c错配的探针5获得了最佳性能(探针-突变体双链体i中的交联产率为36.1
±
1.2％，探针-wt双链体j中的产率为5.1
±
0.4％，对应于对靶序列的7.1倍选择性，并且突变序列和wt序列之间的交联产率相差31％)。
70.通过将正式膨出部引入到探针-靶复合物中的含ap的探针链实现突变型kras序列的共价捕获的选择性和产率。
71.检查含ap的探针6和7的性能，其中一个或两个碱基缺失导致探针-靶复合物(双链体k-n，图3)中的靶链上正式产生1nt或2nt的膨出部。这些探针以良好产率产生交联，并且对突变型kras突变序列的选择性优于对wt的选择性，但产率和选择性两者均低于上文讨论的最佳3'-错配探针(图2，探针5，双链体i/j)提供的产率和选择性。设计用于在探针-靶复合物(双链体o/p，图3)中产生膨出部和错配的探针8提供的交联产率和选择性类似于在探针-靶复合物(双链体m/n，图3)中的靶链上产生正式的2nt膨出部的探针。
72.用在探针-靶复合物中的探针链上正式引入膨出部的碱基插入检查一系列含ap的探针9-12(图4)。随着t、c或g插入探针中，与突变型kras序列形成的交联的产率适中，并且对突变序列的选择性相对于wt序列相当差(双链体q-v，图4)。另一方面，将a残基插入到探针(双链体w/x)中提供了最佳的探针-突变体交联形成总产率(57.7
±
1％)、良好选择性(5.7倍)以及与用wt序列所产生的交联形成相比的大的产率差异(48％)。这种交联反应的代表性凝胶电泳分析示于图1b中。
73.探针通过与35位的突变鸟嘌呤残基的快速反应捕获突变型kras序列，并且不需要严格的温度控制。
74.检查了探针12在双链体w和x中产生交联的几个关键特征。铁-edta足迹实验(luce,2001；johnson,2013)正确地找到了nc35c》g序列中鸟嘌呤突变处探针-突变体双链体的交联附接位置(图10)。还原胺化反应在双链体w中快速产生交联，在4小时内产生》40％的产率，并在约8小时内达到约58％的最终产率(图11)。在信号强度(产率)和突变序列相对于wt的选择性两者方面，双链体w中的交联反应在ph 5.2时比在ph 7时更好(图12)。这种类型的ph依赖性对于还原胺化反应是典型的(borch,1972)。进一步证明了，成功使用这些探针不需要严格的温度控制。具体来说，证明了当反应在37℃(上述标准条件)或室温(24℃；图4)下进行时，产率和相对于wt序列探针12对突变序列的选择性相当。
75.还考虑了在35位缺乏靶g残基的wt双链体x中产生的“背景”交联的起源。人们认为双链体x中的交联可能是由涉及ap位点和直接相对的a残基之间的低产率反应的独特过程引起的(price,2014)。事实上，在双链体x中产生的分离的交联上的铁-edta足迹反应为这一假设提供了证据(图13)。
76.混合物中的突变型和野生型kras序列的同时定量检测。
77.本文公开了在含有突变序列和wt序列的不同部分的混合物中选择性捕获(例如，
用探针12)突变型kras序列的能力。证明了由探针与突变序列和wt序列的反应产生的交联双链体可通过凝胶电泳完全分离(图5a)。这是通过使交联的双链体进一步进入凝胶中来完成的。在这些实验条件下，可使用凝胶电泳分别和同时测量混合物中突变型和wt kras序列的相对量(图5b)。由与突变序列和wt序列的交联形成产生的信号的分离使得突变型kras靶序列能够被检测，而没有显著的背景信号(图5b)。
78.因此，上面公开了一种新的杂交诱导的可编程的交联反应，其用于核酸的序列选择性共价捕获。反应性交联探针是由廉价的商业试剂以简单的一步程序制备，并在不需要严格的温度控制的等温测定条件下实现对特定靶序列的精确特异性。这些含化学反应性ap的探针的效用已被证明可用于共价捕获对应于人kras基因序列中的nc35c》g突变的dna序列。共价交联反应产生化学稳定的探针-靶复合物，其对热变性免疫(johnson，2013；catalano，2015；imani-nejad，2019)。特别是，将非规范错配和膨出的结构引入到探针-靶双链体中显著提高了在信号强度(产率)和相对于野生型序列对突变型kras序列的选择性两者方面的性能。某些含无碱基位点的探针的凝胶电泳分析能够同时定量检测混合物中的突变型和野生型kras序列，而没有背景干扰(图5)。虽然这些探针-靶双链体的三维结构是未知的，但错配和膨出部会产生动态复合物(rossetti,2015；john,2004)，其可能可更好地适应共价交联形成所需的扭曲。在这里，使用
32
p标记的探针链、凝胶电泳分析和磷光成像来检测交联的探针-靶复合物；然而，预计此种序列选择性共价捕获可适于与其他方法一起使用，所述其他方法包括毛细管电泳(durney,2015)、纳米孔技术(zhang,2015；shi,2018；imani-nejad,2017)、荧光光谱法(silverman,2006；demidov,2004)、紫外-可见光谱法(alexandre,2001)和/或电化学检测(li,2006)。
79.实施例段落
80.段落1.一种产生共价交联的核酸链的方法，所述方法包括孵育杂交的双链核酸分子，所述杂交的双链核酸分子包含：(i)包含nc35c》g突变人kras基因序列的区段的靶链，所述nc35c》g突变人kras基因序列包含nc35c》g突变的突变g核苷酸残基；和(ii)包含无碱基(ap)残基的至少部分互补的探针链，其中在所述杂交的核酸分子中，所述探针链的ap残基位于紧邻所述探针链中与所述nc35c》g突变的突变g核苷酸残基直接相对的核苷酸残基的3'的位置处，并且其中孵育是在允许所述探针链的ap残基和所述nc35c》g突变型kras基因序列的突变g核苷酸残基之间形成共价交联的条件下发生；从而产生共价交联的核酸链；任选地，其中所述探针链、所述靶链，或所述探针链和所述靶链两者是dna分子；任选地，其中所述靶链包含基因组或线粒体dna；任选地，其中所述孵育是在nacnbh3存在下发生；并且/或者任选地，其中所述孵育是在小于或小于约ph 7、小于或小于约ph 6.0，或小于或小于约ph 5.5并且任选地大于或大于约ph 4.5或大于或大于约ph 5.0的ph值下发生；并且任选地，其中所述孵育是在或在约ph 5.1、ph 5.2或ph 5.3下发生。
81.段落2.如段落1所述的方法，其中与所述靶链中的nc35c》g突变序列的区域杂交的探针链序列包含：5’gcxgg；5’gaxgg；5’gcxtg；5’gcxcg；5’gcxag；5’gcxgc；5’gcxcg；5’gcxac；5’gcxtgg；5’gcxcgg；5’gcxggg；或5’gcxagg，其中x是所述ap残基，并且其中在所述杂交分子中，所述探针链的ap残基位于紧邻所述探针链中与所述nc35c》g突变的突变g核苷酸残基直接相对的核苷酸残基的3'的位置处；任选地，其中与所述靶链中的nc35c》g突变序列的区域杂交的探针链的序列包含：5’gcxtgg；5’gcxcgg；5’gcxggg；或5’gcxagg；并且任选
地，其中与所述靶链中的nc35c》g突变序列的区域杂交的探针链的序列包含5'gcxagg。
82.段落3.如段落1或2所述的方法，其中：(i)所述靶链包含所述nc35c》g突变的突变g核苷酸残基的5’的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、40或50个核苷酸和所述nc35c》g突变的突变g核苷酸残基的3’的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、40或50个核苷酸；并且/或者(ii)所述探针链包含所述ap残基的5’的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、40或50个核苷酸和所述ap残基的3’的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、40或50个核苷酸；任选地，其中：(i)所述靶链包含所述nc35c》g突变的突变g核苷酸残基的5’的不超过3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、40、50或100个核苷酸和所述nc35c》g突变的突变g核苷酸残基的3’的不超过3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、40、50或100个核苷酸；并且/或者(ii)所述探针链包含所述ap残基的5’的不超过3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、40、50或100个核苷酸和所述ap残基的3’的不超过3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、40、50或100个核苷酸。
83.段落4.如段落3所述的方法，其中：(i)所述靶链的长度是至少或至少约以下、是或是约以下，或介于以下的任一者之间或介于约以下的任一者之间：12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸；
84.(ii)所述探针链的长度小于或小于约以下、是或是约以下，或介于以下的任一者之间或介于约以下的任一者之间：100、90、80、70、60、50、40、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13或12个核苷酸；并且/或者(iii)所述杂交的核酸分子包含含有所述探针链的ap残基和所述靶链的nc35c》g突变的突变g核苷酸残基的杂交的序列部分，其长度是至少或至少约以下、是或是约以下，或介于以下的任一者之间或介于约以下的任一者之间：12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90或100个邻接核苷酸。
85.段落5.如段落4所述的方法，其中含有所述探针链的ap残基和所述靶链的nc35c》g突变的突变g核苷酸残基的杂交部分除所述ap残基的位置之外具有至少或至少约以下、以下或约以下，或介于以下的任一者之间或介于约以下的任一者之间的互补性：50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，或者具有100％互补性。
86.段落6.如段落1所述的方法，其中所述探针链包含以下，基本上由以下组成，或由以下组成：seq id no:3或其包含5’gcxgg的片段；seq id no:4或其包含5’gaxgg的片段；seq id no:5或其包含5’gcxtg的片段；seq id no:6或其包含5’gcxcg的片段；seq id no:7或其包含5’gcxag的片段；seq id no:8或其包含5’gcxgc的片段；seq id no:9或其包含5’gcxcg的片段；seq id no:10或其包含5’gcxac的片段；seq id no:11或其包含5’gcxtgg的片段；seq id no:12或其包含5’gcxcgg的片段；seq id no:13或其包含5’gcxggg的片段；或seq id no:14或其包含5’gcxagg的片段，其中x是所述ap残基；任选地，其中所述探针链包含以下、基本上由以下组成，或由以下组成：序列ttggagctgcxaggcgtaggca(seq id no:14)或其包含5’gcxagg的片段。
87.段落7.如段落1至6中任一项所述的方法，其中通过所述方法产生的共价交联的核酸链的产率与通过除了其中所述靶链包含野生型人kras基因序列而非所述nc35c》g突变序列的方法产生的共价交联的核酸链的产率相比更大。
88.段落8.如段落1至7中任一项所述的方法，其中与使用包含5’gcxgg的等效探针链
相比，从使用包含5’gaxgg、5’gcxtg、5’gcxcg、5’gcxag、5’gcxgc、5’gcxcg、5’gcxac、5’gcxtgg、5’gcxcgg、5’gcxggg或5’gcxagg的探针链获得的共价交联的核酸链的产率和/或观察到的相对于野生型kras基因序列的选择性更大；任选地，其中与使用包含序列seq id no:3或其包含5’gcxgg的片段、基本上由此组成或由此组成的等效探针链相比，从使用包含以下序列、基本上由其组成或由其组成的探针链获得的共价交联的核酸链的产率和/或相对于野生型kras基因序列的选择性更大：seq id no:4或其包含5’gaxgg的片段；seq id no:5或其包含5’gcxtg的片段；seq id no:6或其包含5’gcxcg的片段；seq id no:7或其包含5’gcxag的片段；seq id no:8或其包含5’gcxgc的片段；seq id no:9或其包含5’gcxcg的片段；seq id no:10或其包含5’gcxac的片段；seq id no:11或其包含5’gcxtgg的片段；seq id no:12或其包含5’gcxcgg的片段；seq id no:13或其包含5’gcxggg的片段；或seq id no:14或其包含5’gcxagg的片段。
89.段落9.一种检测人kras基因中nc35c》g[[c35g》c]]癌症驱动突变的存在的方法，所述方法包括孵育杂交的双链dna分子(dsdna)，所述杂交的双链dna分子包含：(i)包含kras基因序列的区段的靶链，所述区段包含对应于人kras基因(seq id no:15)的编码链中的残基35的核苷酸残基；和(ii)包含无碱基(ap)残基的至少部分互补的探针链，其中在所述杂交分子中，探针链的ap残基位于紧邻所述探针链中与所述靶链中的对应于所述人kras基因(seq id no:15)的编码链中的残基35的核苷酸残基直接相对的核苷酸残基的3'的位置处，并且其中孵育是在允许所述探针链中的ap残基和所述nc35c》g kras突变基因中的突变g核苷酸残基(如果存在)之间形成共价交联的条件下发生；以及检测所述探针链和靶链在所述探针链中的ap残基和所述nc35c》g kras突变基因中的突变g核苷酸残基之间的共价交联，从而检测kras基因突变的存在；任选地，其中所述探针链中的ap残基和所述kras突变基因中的突变g核苷酸残基之间的共价交联的形成与野生型kras基因中相同位置处的c核苷酸残基相比选择性地发生；任选地，其中所述靶链是基因组或线粒体dna；任选地，其中所述探针链和所述靶链的共价交联是通过凝胶电泳、热稳定性监测、荧光法(即fret)、电化学、表面等离子体共振或基于纳米孔的传感器来检测；任选地，其中所述孵育是在nacnbh3存在下发生；并且/或者任选地，其中所述孵育是在小于或小于约ph 7、小于或小于约ph 6.0或小于或小于约ph 5.5并且任选地大于或大于约ph 4.5或大于或大于约ph 5.0的ph值下发生；并且任选地，其中所述孵育是在或在约ph 5.1、ph 5.2或ph 5.3下发生。
[0090]
段落10.如段落9所述的方法，其中将探针链和包含nc35c》g kras突变基因的突变g核苷酸残基的靶链的共价交联的检测与探针链和包含野生型kras基因的c核苷酸残基的靶链的共价交联的检测进行比较；任选地，其中交联的探针-突变体靶链分子和交联的探针-野生型靶链分子的形成和/或检测是同时进行的；任选地，其中探针-突变体靶链和探针-野生型靶链的形成和/或检测在同一样品内进行；并且/或者任选地，其中检测和/或比较是定量进行的。
[0091]
段落11.如段落9或10所述的方法，其中与靶链中的对应于kras基因(seq id no:15)的编码链中的残基35的核苷酸残基的区域杂交的探针链的序列包含：5’gcxgg；5’gaxgg；5’gcxtg；5’gcxcg；5’gcxag；5’gcxgc；5’gcxcg；5’gcxac；5’gcxtgg；5’gcxcgg；5’gcxggg；或5’gcxagg，其中x是ap残基，其中在杂交分子中，探针链的ap残基位于紧邻探针链中与靶链的对应于kras基因(seq id no:15)的编码链中的残基35的核苷酸残基直接相对
的核苷酸残基的3'的位置处；任选地，其中与靶链的对应于kras基因(seq id no:15)的编码链中的残基35的核苷酸残基的区域杂交的探针链的序列包含：5’gcxtgg；5’gcxcgg；5’gcxggg；或5’gcxagg；并且任选地，其中与靶链的对应于人kras基因(seq id no:15)的编码链中的残基35的核苷酸残基的区域杂交的探针链的序列包含5’gcxagg。
[0092]
段落12.如段落9至11中任一项所述的方法，其中：(i)所述靶链包含对应于kras基因(seq id no:15)的编码链中的残基35的核苷酸残基的5’的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、40或50个核苷酸和对应于kras基因(seq id no:15)的编码链中的残基35的核苷酸残基的3’的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、40或50个核苷酸；并且/或者(i)探针链包含ap残基的5’的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、40或50个核苷酸和ap残基的3’的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、40或50个核苷酸；任选地，其中：(i)靶链包含对应于kras基因(seq id no:15)的编码链中的残基35的核苷酸残基的5’的不超过3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、40、50或100个核苷酸和对应于kras基因(seq id no:15)的编码链中的残基35的核苷酸残基的3’的不超过3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、40、50或100个核苷酸；并且/或者(ii)探针链包含ap残基的5’的不超过3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、40、50或100个核苷酸和ap残基的3’的不超过3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、40、50或100个核苷酸。
[0093]
段落13.如段落12所述的方法，其中：(i)所述靶链的长度是至少或至少约以下、是或是约以下，或介于以下的任一者之间或介于约以下的任一者之间：12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸；(ii)所述探针链的长度小于或小于约以下、是或是约以下，或介于以下的任一者之间或介于约以下的任一者之间：100、90、80、70、60、50、40、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13或12个核苷酸；并且/或者(iii)所述杂交的核酸分子包含含有探针链的ap残基和靶链的对应于所述人kras基因(seq id no:15)的编码链中的残基35的核苷酸残基的杂交的部分，其具有至少或至少约以下、以下或约以下，或介于以下的任一者之间或介于约以下的任一者之间的长度：12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90或100个邻接核苷酸。
[0094]
段落14.如段落13所述的方法，其中含有所述探针链的ap残基和所述靶链的对应于所述人kras基因(seq id no:15)的编码链中的残基35的核苷酸残基的杂交部分除所述ap残基的位置之外具有至少或至少约以下、以下或约以下，或介于以下的任一者之间或介于约以下的任一者之间的互补性：50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，或者具有100％互补性。
[0095]
段落15.如段落9所述的方法，其中所述探针链包含以下，基本上由以下组成，或由以下组成：seq id no:3或其包含5’gcxgg的片段；seq id no:4或其包含5’gaxgg的片段；seq id no:5或其包含5’gcxtg的片段；seq id no:6或其包含5’gcxcg的片段；seq id no:7或其包含5’gcxag的片段；seq id no:8或其包含5’gcxgc的片段；seq id no:9或其包含5’gcxcg的片段；seq id no:10或其包含5’gcxac的片段；seq id no:11或其包含5’gcxtgg的片段；seq id no:12或其包含5’gcxcgg的片段；seq id no:13或其包含5’gcxggg的片段；或seq id no:14或其包含5’gcxagg的片段，其中x是所述ap残基；任选地，其中所述探针链包含以下，基本上由以下组成，或由以下组成：序列ttggagctgcxaggcgtaggca(seq id no:14)
或其包含5’gcxagg的片段。
[0096]
段落16.如段落9至15中任一项所述的方法，其中与使用包含5’gcxgg的等效探针链相比，从使用包含5’gaxgg、5’gcxtg、5’gcxcg、5’gcxag、5’gcxgc、5’gcxcg、5’gcxac、5’gcxtgg、5’gcxcgg、5’gcxggg或5’gcxagg的探针链获得的共价交联的核酸链的产率和/或观察到的相对于野生型kras基因序列的选择性更大；任选地，其中与使用包含序列seq id no:3、基本上由其组成或由其组成的等效探针链相比，从使用包含以下序列、基本上由其组成或由其组成的探针链获得的共价交联的核酸链的产率和/或相对于野生型kras基因序列的选择性更大：seq id no:4；seq id no:5；seq id no:6；seq id no:7；seq id no:8；seq id no:9；seq id no:10；seq id no:11；seq id no:12；seq id no:13；或seq id no:14。
[0097]
段落17.一种用于检测人kras基因序列中的nc35c》g突变的单链核酸探针，所述探针包含序列：5’gcxgg；5’gaxgg；5’gcxtg；5’gcxcg；5’gcxag；5’gcxgc；5’gcxcg；5’gcxac；5’gcxtgg；5’gcxcgg；5’gcxggg；或5’gcxagg，其中x是ap残基，任选地，其中所述探针包含序列：5’gcxtgg；5’gcxcgg；5’gcxggg；或5’gcxagg；任选地，其中所述探针包含序列5’gcxagg；并且/或者任选地，其中所述探针是dna分子。
[0098]
段落18.如段落17所述的探针，其中所述探针包含ap残基的5'的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、40或50个核苷酸和ap残基的3'的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、40或50个核苷酸；任选地，其中所述探针包含ap残基的5'的不超过3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、40、50或100个核苷酸和ap残基的3'的不超过3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、40、50或100个核苷酸。
[0099]
段落19.如段落17或18所述的探针，其中所述探针的长度是小于或小于约以下、是或是约以下，或介于以下的任一者之间或介于约以下的任一者之间：100、90、80、70、60、50、40、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13或12个核苷酸。
[0100]
段落20.如段落17至19中任一项所述的探针，其中所述探针能够与包含nc35c》g突变的nc35c》g突变人kras基因序列的区域杂交；任选地，其中所述探针链包含至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、25、30、40或50个核苷酸的邻接序列，所述邻接序列除所述ap残基的位置之外与包含nc35c》g点突变位点的nc35c》g突变人kras基因序列具有至少或至少约以下、以下或约以下，或介于以下的任一者之间或介于约以下的任一者之间的互补性：50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，或者具有100％互补性。
[0101]
段落21.如段落17至20中任一项所述的探针，其中所述探针包含以下，基本上由以下组成，或由以下组成：seq id no:3或其包含5’gcxgg的片段；seq id no:4或其包含5’gaxgg的片段；seq id no:5或其包含5’gcxtg的片段；seq id no:6或其包含5’gcxcg的片段；seq id no:7或其包含5’gcxag的片段；seq id no:8或其包含5’gcxgc的片段；seq id no:9或其包含5’gcxcg的片段；seq id no:10或其包含5’gcxac的片段；seq id no:11或其包含5’gcxtgg的片段；seq id no:12或其包含5’gcxcgg的片段；seq id no:13或其包含5’gcxggg的片段；或seq id no:14或其包含5’gcxagg的片段，其中x是所述ap残基；任选地，其中所述探针包含以下，基本上由以下组成，或由以下组成：序列ttggagctgcxaggcgtaggca(seq id no:14)或其包含5’gcxagg的片段。
[0102]
段落22.如段落17至21中任一项所述的探针，其中所述探针包含可检测标记；任选
地，其中所述探针是放射性标记的，并且任选地，其中所述放射性标记物是32p；或任选地，其中所述探针包含与所述探针的5'端、3'端，或5'端和3'端两者共价附接的末端延伸部；并且任选地，其中所述末端延伸部与所述探针的3'端共价附接并且选自由以下各项组成的群组：聚(dc)(3-33)、聚(dg)(3-33)、聚(da)(3-33)、聚(dt)(3-33)和聚(dn)(3-33)，其中n是2'-脱氧胞嘧啶、2'-脱氧鸟苷、2'-脱氧腺苷、胸腺嘧啶、无碱基物、肌苷、黄嘌呤核苷、7-甲基鸟苷、二氢尿苷或5-甲基胞苷的任何组合。
[0103]
段落23.一种共价交联的杂交的双链核酸分子，所述共价交联的杂交的双链核酸分子包含：(i)包含含有nc35c》g点突变位点的突变g核苷酸残基的nc35c》g突变人kras基因序列区段的区段的靶链；(ii)包含无碱基(ap)残基的至少部分互补的探针链，其中在所述杂交的分子中，所述探针链的ap残基位于紧邻探针链中与nc35c》g点突变的突变g核苷酸残基直接相对的核苷酸残基的3'的位置处；其中所述探针链的ap残基与nc35c》g突变kras基因序列的突变g核苷酸残基共价交联；任选地，其中所述核酸分子是经分离的。
[0104]
段落24.如段落23所述的交联的核酸分子，其中所述探针链、所述靶链，或所述探针链和所述靶链两者是dna分子；任选地，其中所述靶链是基因组或线粒体dna。
[0105]
段落25.如段落24所述的交联的核酸分子，其中与所述靶链中的nc35c》g点突变位点的区域杂交的探针链序列包含：5’gcxgg；5’gaxgg；5’gcxtg；5’gcxcg；5’gcxag；5’gcxgc；5’gcxcg；5’gcxac；5’gcxtgg；5’gcxcgg；5’gcxggg；或5’gcxagg，其中x是所述ap残基，并且其中在所述杂交的分子中，所述探针链的ap残基位于紧邻所述探针链中与所述nc35c》g点突变的g核苷酸残基直接相对的核苷酸残基的3'的位置处；任选地，其中与所述靶链中的nc35c》g点突变位点的区域杂交的探针链的序列包含：5’gcxtgg；5’gcxcgg；5’gcxggg；或5’gcxagg；并且任选地，其中与所述靶链中的nc35c》g点突变位点的区域杂交的探针链的序列包含5'gcxagg。
[0106]
段落26.如段落24或25所述的交联的核酸分子：其中：(i)所述靶链包含nc35c》g点突变的5'的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、40或50个核苷酸和nc35c》g点突变的3'的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、40或50个核苷酸；并且/或者(ii)所述探针链包含ap残基的5'的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、40或50个核苷酸和ap残基的3'的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、40或50个核苷酸。
[0107]
段落27.如段落26所述的交联的核酸分子：其中：(i)所述靶链的长度是至少或至少约以下、是或是约以下，或介于以下的任一者之间或介于约以下的任一者之间：12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸；(ii)所述探针链的长度小于或小于约以下、是或是约以下，或介于以下的任一者之间或介于约以下的任一者之间：100、90、80、70、60、50、40、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13或12个核苷酸；并且/或者(iii)所述杂交的核酸分子包含含有探针链的ap残基和靶链的nc35c》g点突变位点的杂交的部分，其长度是至少或至少约以下、是或是约以下，或介于以下的任一者之间或介于约以下的任一者之间：12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90或100个邻接核苷酸。
[0108]
段落28.如段落27所述的交联的核酸分子，其中含有所述探针链的ap残基和所述靶链的nc35c》g点突变位点的杂交的部分除所述ap残基的位置之外具有至少或至少约以
下、以下或约以下，或介于以下的任一者之间或介于约以下的任一者之间的互补性：50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，或者具有100％互补性。
[0109]
段落29.如段落24所述的交联的核酸分子，其中所述探针链包含以下，基本上由以下组成，或由以下组成：seq id no:3或其包含5’gcxgg的片段；seq id no:4或其包含5’gaxgg的片段；seq id no:5或其包含5’gcxtg的片段；seq id no:6或其包含5’gcxcg的片段；seq id no:7或其包含5’gcxag的片段；seq id no:8或其包含5’gcxgc的片段；seq id no:9或其包含5’gcxcg的片段；seq id no:10或其包含5’gcxac的片段；seq id no:11或其包含5’gcxtgg的片段；seq id no:12或其包含5’gcxcgg的片段；seq id no:13或其包含5’gcxggg的片段；或seq id no:14或其包含5’gcxagg的片段，其中x是所述ap残基；任选地，其中所述探针链包含以下，基本上由以下组成，或由以下组成：序列ttggagctgcxaggcgtaggca(seq id no:14)或其包含5’gcxagg的片段。
[0110]
段落30.如段落24至29中任一项所述的交联的核酸分子，其中所述探针链和/或所述靶链包含与所述探针的5'端、3'端，或5'端和3'端两者共价附接的末端延伸部；任选地，其中所述末端延伸部与所述链的3'端共价附接并且选自由以下各项组成的群组：聚(dc)(3-33)、聚(dg)(3-33)、聚(da)(3-33)、聚(dt)(3-33)和聚(dn)(3-33)，其中n是2'-脱氧胞嘧啶、2'-脱氧鸟苷、2'-脱氧腺苷、胸腺嘧啶、无碱基物、肌苷、黄嘌呤核苷、7-甲基鸟苷、二氢尿苷或5-甲基胞苷的任何组合。
[0111]
实施例
[0112]
本公开的宽度和范围不应受上述示例性实施方案中的任一个限制，而应仅仅根据所附权利要求和它们的等同物来界定。
[0113]
材料和方法.
[0114]
dna寡核苷酸购自integrated dna technologies(idt,coralville,ia)，[γ-32
p]-atp购自perkin elmer life science，尿嘧啶dna糖基化酶购自new england biolabs(ipswitch,ma)，哌啶和丙烯酰胺购自fisher scientific(waltham,ma)。氰基硼氢化钠和其他化学品购自sigma-aldrich(st.louis,mo)。
[0115]
交联反应.
[0116]
dna双链体是通过在含有nacl(100mm)的mops(50mm,ph 7)中混合
32
p标记的含有2'-脱氧尿嘧啶的寡核苷酸与略微过量的互补链、将混合物加热至90℃、之后冷却至室温(24℃)来产生。ap位点是通过在37℃下在由tris-hcl(20mm,于25℃下ph 8)、二硫苏糖醇(1mm)、edta(1mm)、mops(25mm,ph 7)和nacl(10mm)组成的溶液中用尿嘧啶dna糖基化酶(udg，10单位/毫升最终浓度)处理40分钟来产生。将dna用乙醇沉淀，并且将双链体重新溶解于由含有nacnbh3(200mm)的乙酸钠(750mm，ph 5.2)缓冲液组成的溶液中。于37℃下孵育24小时后，将dna用乙醇沉淀，重新溶解于甲酰胺上样缓冲液中，并在变性的20％聚丙烯酰胺凝胶上通过电泳分析产物。分离后，将凝胶中的
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p标记的寡核苷酸通过磷相仪分析可视化。
[0117]
为了验证udg处理成功地在链中产生ap位点，将寡核苷酸于90℃下在哌啶水溶液(100mm)中加热30分钟，以在ap位点诱导链切割。将所得dna在speed-vac浓缩器中干燥，重新溶解于甲酰胺上样缓冲液中，并进行凝胶电泳分析。在时间过程实验中，在选定的时间点取出反应混合物的等分试样并在凝胶电泳分析之前冷冻在干冰中。在涉及wt和突变型kras
序列的混合物的实验中，将
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p标记的含ap的探针链添加到含有不同比率的wt和突变型kras序列的混合物中，并如上所述的那样进行处理。如先前所述(johnson,2013；luce,2001)的那样进行正确地找到靶链上交联附接位置的足迹实验。误差杠反映平均值的标准偏差。使用单批标记的探针一式三份进行典型的交联反应。双链体w和x中的交联反应是使用至少四个不同批次的标记探针一式三份进行(即至少十二个单独的交联反应)。对于双链体w和x观察到的稍微较大的标准偏差是由于以下事实引起：各批次标记探针之间的交联产率变化略大于使用单批标记探针在三次重复中观察到的交联产率变化。这可能反映盐杂质或与标记的含ap的探针链相关的特定活性的批次间变化。
[0118]
人kras基因seq id no:15
[0119]