抗CD37抗体-美登素偶联物及其使用方法与流程

抗cd37抗体-美登素偶联物及其使用方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年10月31日提交的第62/928,939号美国临时申请的优先权权益，所述第62/928,939号美国临时申请通过本发明的引用，成为本发明的一部分。


背景技术：

3.蛋白-小分子治疗性偶联物领域已经取得了很大的进展，提供了许多临床有益的药物，并有望在未来几年提供更多的药物。由于特异性、功能的多样性和相对较低的脱靶活性，蛋白-偶联物治疗能够提供一些优势，副作用较少。蛋白的化学修饰可通过使其更有效、更稳定或更多模式来扩大这些优势。
4.一些标准化学转化通常用于创建和操作蛋白的翻译后修饰。有许多方法可以让人们能够选择性修饰某些氨基酸的侧链。例如，可通过与水溶性碳二亚胺试剂的初始活化以及随后与胺的反应来靶向羧酸侧链(天冬氨酸和谷氨酸)。同样，可通过使用活性酯或异硫氰酸盐来靶向赖氨酸，可通过马来酰亚胺和α-卤代羰基来靶向半胱氨酸硫醇。
5.创造化学改变的蛋白治疗剂或试剂的一个重大障碍是产生具有生物活性的同质形式的蛋白。药物或可检测标记与多肽的偶联可能难以控制，导致偶联物的异质混合物在附着的药物分子的数量和化学偶联的位置上不同。在某些情况下，可能需要使用合成有机化学工具控制偶联位点和/或与多肽偶联的药物或可检测标记，以指导化学键在多肽上的精确和选择性形成。
6.cd37是跨膜四超家族的成员，也称为跨膜四超家族。cd37是一种细胞表面糖蛋白，已知可与整合素和其他跨膜四超家族蛋白复合。它在正常成熟b细胞和大多数b细胞恶性肿瘤中选择性表达。cd37抗原在b细胞中大量表达，但在浆细胞和正常干细胞中不存在。因此，cd37是患有b细胞恶性肿瘤患者的合适治疗靶点，包括复发性b细胞衍生的恶性肿瘤，例如b细胞慢性淋巴细胞白血病(cll)、毛细胞白血病(hcl)和b细胞非霍奇金淋巴瘤(nhl)。


技术实现要素：

7.本发明提供了cd37抗体-美登素偶联物结构。发明还包括此类偶联物的生产方法以及此类偶联物的使用方法。
8.本发明各方面包括具有至少一个修饰氨基酸残基的偶联物，所述氨基酸残基具有式(i)的侧链：
[0009][0010]
其中
[0011]
z为cr4或n；
[0012]
r1选自氢、烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、环烷基、取代环烷基、杂环基和取代杂环基；
[0013]
r2和r3分别独立选自氢、烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、烷氧基、取代烷氧基、氨基、取代氨基、羧基、羧基酯、酰基、酸氧基、酰氨基、氨酰基、烷基酰胺、取代烷基酰胺、磺酰基、硫代烷氧基、取代硫代烷氧基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、环烷基、取代环烷基、杂环基和取代杂环基，或者r2和r3可选环形连接形成五元或六元杂环基；
[0014]
每个r4独立选自氢、卤素、烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、烷氧基、取代烷氧基、氨基、取代氨基、羧基、羧基酯、酰基、酸氧基、酰氨基、氨酰基、烷基酰胺、取代烷基酰胺、磺酰基、硫代烷氧基、取代硫代烷氧基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、环烷基、取代环烷基、杂环基和取代杂环基；
[0015]
l是包含-(t
1-v1)
a-(t
2-v2)
b-(t
3-v3)
c-(t
4-v4)
d-的连接子，其中a、b、c和d为分别独立的0或1，其中a、b、c和d之和为1-4；
[0016]
t1、t2、t3和t4分别独立选自(c
1-c
12
)烷基、取代(c
1-c
12
)烷基、(eda)w、(peg)n、(aa)
p
、-(cr
13
oh)
h-、哌啶-4-氨基(4ap)和缩醛基、肼、二硫化物和酯，其中，eda为乙二胺基团，peg为聚乙二醇或修饰聚乙二醇，aa为氨基酸残基，其中，w为1-20整数，n为1-30整数，p为1-20整数，h为1-12整数；
[0017]v1
、v2、v3和v4分别独立选自由共价键、-co-、-nr
15-、-nr
15
(ch2)
q-、-nr
15
(c6h4)-、-conr
15-、-nr
15
co-、-c(o)o-、-oc(o)-、-o-、-s-、-s(o)-、-so
2-、-so2nr
15-、-nr
15
so
2-和-p(o)oh-构成的基团，其中，q为1-6整数；
[0018]
每个r
13
独立选自氢、烷基、取代烷基、芳基和取代芳基；
[0019]
每个r
15
独立选自氢、烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、羧基、羧基酯、酰基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、环烷基、取代环烷基、杂环基和取代杂环基；
[0020]
w1为美登素类化合物；以及
[0021]
w2为抗cd37抗体。
[0022]
在某些情况下，所述偶联物包括以下内容，其中：
[0023]
t1选自(c
1-c
12
)烷基和取代(c
1-c
12
)烷基；
[0024]
t2、t3和t4分别独立选自(eda)w、(peg)n、(c
1-c
12
)烷基、取代(c
1-c
12
)烷基、(aa)
p
、-(cr
13
oh)
h-、4-氨基-哌啶(4ap)、缩醛基、肼和酯；以及
[0025]v1
、v2、v3和v4分别独立选自由共价键、-co-、-nr
15-、-nr
15
(ch2)
q-、-nr
15
(c6h4)-、-conr
15-、-nr
15
co-、-c(o)o-、-oc(o)-、-o-、-s-、-s(o)-、-so
2-、-so2nr
15-、-nr
15
so
2-和-p(o)oh-构成的基团；
[0026]
其中：
[0027]
(peg)n为其中n为1-30整数；
[0028]
eda为具有以下结构的乙二胺基团：其中y为1-6整数，r为0
或1；
[0029]
4-氨基-哌啶(4ap)为
[0030]
每个r
12
和r
15
独立选自氢、烷基、取代烷基、聚乙二醇基团、芳基和取代芳基，其中，任何两个相邻的r
12
基团可环形连接形成哌嗪基环；以及
[0031]r13
独立选自氢、烷基、取代烷基、芳基和取代芳基。
[0032]
在某些情况下，所述偶联物包括以下内容，其中：t1、t2、t3和t4以及v1、v2、v3和v4选自下表：
[0033]
[0034][0035]
在某些情况下，所述偶联物包括以下内容，其中：所述连接子l选自以下一种结构：
[0036]
[0037][0038][0039]
其中
[0040]
每个f为独立的0或1-12整数；
[0041]
每个y为独立的0或1-20整数；
[0042]
每个n为独立的0或1-30整数；
[0043]
每个p为独立的0或1-20整数；
[0044]
每个h为独立的0或1-12整数；
[0045]
每个r为独立的氢、烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、烷氧基、取代烷氧基、氨基、取代氨基、羧基、羧基酯、酰基、酸氧基、酰氨基、氨酰基、烷基酰胺、取代烷基酰胺、磺酰基、硫代烷氧基、取代硫代烷氧基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、环烷基、取代环烷基、杂环基和取代杂环基；以及
[0046]
每个r’为独立的氢、氨基酸侧链基团、烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、烷氧基、取代烷氧基、氨基、取代氨基、羧基、羧基酯、酰基、酸氧基、酰氨基、氨酰基、烷基酰胺、取代烷基酰胺、磺酰基、硫代烷氧基、取代硫代烷氧基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、环烷基、取代环烷基、杂环基和取代杂环基。
[0047]
在某些情况下，所述美登素类化合物的公式如下：
[0048][0049]
其中，表示美登素类化合物和l之间的附着点。
[0050]
在某些情况下，所述偶联物包括以下内容，其中：t1为(c
1-c
12
)烷基，v1为-co-，t2为4ap，v2为-co-，t3为(c
1-c
12
)烷基，v3为-co-，t4不存在，v4不存在。
[0051]
在某些情况下，所述连接子l包括以下结构：
[0052][0053]
其中
[0054]
每个f为独立的1-12整数；以及
[0055]
n为1-30整数；
[0056]
在某些情况下，所述抗cd37抗体为igg1抗体。
[0057]
在某些情况下，所述抗cd37抗体为igg1κ抗体。
[0058]
在某些情况下，所述抗cd37抗体包含式(ii)的序列：
[0059]
x1(fgly’)x2z
20
x3z
30
ꢀꢀ
(ii)
[0060]
其中
[0061]
fgly’为式(i)的修饰氨基酸残基；
[0062]z20
为脯氨酸或丙氨酸残基；
[0063]z30
为碱性氨基酸或脂肪族氨基酸；
[0064]
x1可以存在或不存在，存在时可以是任何氨基酸，但条件是当序列位于偶联物n端时，x1存在；以及
[0065]
x2和x3为分别独立的任何氨基酸。
[0066]
在某些情况下，所述序列为l(fgly’)tpsr。
[0067]
在某些情况下，所述偶联物包括以下内容，其中：
[0068]z30
选自r、k、h、a、g、l、v、i和p；
[0069]
x1选自l、m、s和v；以及
[0070]
x2和x3分别独立选自s、t、a、v、g和c。
[0071]
在某些情况下，所述修饰氨基酸残基位于抗cd37抗体重链恒定区的c端。
[0072]
在某些情况下，所述重链恒定区包含式(ii)的序列：
[0073]
x1(fgly’)x2z
20
x3z
30
ꢀꢀ
(ii)
[0074]
其中
[0075]
fgly’为式(i)的修饰氨基酸残基；
[0076]z20
为脯氨酸或丙氨酸残基；
[0077]z30
为碱性氨基酸或脂肪族氨基酸；
[0078]
x1可以存在或不存在，存在时可以是任何氨基酸，但条件是当序列位于偶联物n端时，x1存在；以及
[0079]
x2和x3为分别独立的任何氨基酸，以及
[0080]
其中，所述序列为氨基酸序列slslspg的c端。
[0081]
在某些情况下，所述重链恒定区包含序列spgsl(fgly’)tpsrgs。
[0082]
在某些情况下，所述偶联物包括以下内容，其中：
[0083]z30
选自r、k、h、a、g、l、v、i和p；
[0084]
x1选自l、m、s和v；以及
[0085]
x2和x3分别独立选自s、t、a、v、g和c。
[0086]
在某些情况下，所述修饰氨基酸残基位于抗cd37抗体轻链恒定区。
[0087]
在某些情况下，所述轻链恒定区包含式(ii)的序列：
[0088]
x1(fgly’)x2z
20
x3z
30
ꢀꢀ
(ii)
[0089]
其中
[0090]
fgly’为式(i)的修饰氨基酸残基；
[0091]z20
为脯氨酸或丙氨酸残基；
[0092]z30
为碱性氨基酸或脂肪族氨基酸；
[0093]
x1可以存在或不存在，存在时可以是任何氨基酸，但条件是当序列位于偶联物n端时，x1存在；以及
[0094]
x2和x3为分别独立的任何氨基酸，以及
[0095]
其中，所述序列为序列kvdnal的c端，和/或序列qsgnsq的n端。
[0096]
在某些情况下，所述轻链恒定区包含序列kvdnal(fgly’)tpsrqsgnsq。
[0097]
在某些情况下，所述偶联物包括以下内容，其中：
[0098]z30
选自r、k、h、a、g、l、v、i和p；
[0099]
x1选自l、m、s和v；以及
[0100]
x2和x3分别独立选自s、t、a、v、g和c。
[0101]
在某些情况下，所述修饰氨基酸残基位于抗cd37抗体重链ch1区。
[0102]
在某些情况下，所述重链ch1区包含式(ii)的序列：
[0103]
x1(fgly’)x2z
20
x3z
30
ꢀꢀ
(ii)
[0104]
其中
[0105]
fgly’为式(i)的修饰氨基酸残基；
[0106]z20
为脯氨酸或丙氨酸残基；
[0107]z30
为碱性氨基酸或脂肪族氨基酸；
[0108]
x1可以存在或不存在，存在时可以是任何氨基酸，但条件是当序列位于偶联物n端时，x1存在；以及
[0109]
x2和x3为分别独立的任何氨基酸，以及
[0110]
其中，所述序列为氨基酸序列swnsga的c端，和/或氨基酸序列gvhtfp的n端。
[0111]
在某些情况下，所述重链ch1区包含序列swnsgal(fgly’)tpsrgvhtfp。
[0112]
在某些情况下，所述偶联物包括以下内容，其中：
[0113]z30
选自r、k、h、a、g、l、v、i和p；
[0114]
x1选自l、m、s和v；以及
[0115]
x2和x3分别独立选自s、t、a、v、g和c。
[0116]
在某些情况下，所述修饰氨基酸残基位于抗cd37抗体重链ch2区。
[0117]
在某些情况下，所述修饰氨基酸残基位于抗cd37抗体重链ch3区。
[0118]
在某些情况下，所述抗cd37抗体与包含以下内容的抗cd37抗体竞争与cd37结合：
[0119]
可变重链(vh)多肽，包含
[0120]
包含氨基酸序列gynmn(seq id no:3)的v
h cdr1，
[0121]
包含氨基酸序列nidpyyggttynrkfkg(seq id no:4)的v
h cdr2，以及
[0122]
包含氨基酸序列svgpfds(seq id no:5)的v
h cdr3；以及
[0123]
可变轻链(v
l
)多肽，包含
[0124]
包含氨基酸序列rasenvysyla(seq id no:8)的v
l cdr1，
[0125]
包含氨基酸序列faktlae(seq id no:9)的v
l cdr2，以及
[0126]
包含氨基酸序列qhhsdnpwt(seq id no:10)的v
l cdr3。
[0127]
在某些情况下，所述抗cd37抗体包含：
[0128]
可变重链(vh)多肽，包含
[0129]
包含氨基酸序列gynmn(seq id no:3)的v
h cdr1，
[0130]
包含氨基酸序列nidpyyggttynrkfkg(seq id no:4)的v
h cdr2，以及
[0131]
包含氨基酸序列svgpfds(seq id no:5)的v
h cdr3；以及
[0132]
可变轻链(v
l
)多肽，包含
[0133]
包含氨基酸序列rasenvysyla(seq id no:8)的v
l cdr1，
[0134]
包含氨基酸序列faktlae(seq id no:9)的v
l cdr2，以及
[0135]
包含氨基酸序列qhhsdnpwt(seq id no:10)的v
l cdr3。
[0136]
在某些情况下，所述抗cd37抗体包含：
[0137]
可变重链(vh)多肽，包含与seq id no:2中规定的氨基酸序列具有70％或以上、75％或以上、80％或以上、85％或以上、90％或以上、95％或以上、99％或以上或100％一致性的氨基酸序列；以及
[0138]
可变轻链(v
l
)多肽，包含与seq id no:7中规定的氨基酸序列具有70％或以上、75％或以上、80％或以上、85％或以上、90％或以上、95％或以上、99％或以上或100％一致性的氨基酸序列。
[0139]
本发明各方面包括一种包含本发明所述偶联物以及一种可药用赋形剂的的药物合成物。
[0140]
本发明各方面包括向受试者施用治疗有效量的本发明所述偶联物的方法。
[0141]
本发明各方面包括一种治疗受试者癌症的方法。所述方法包括向受试者施用治疗有效量的药物合成物，所述药物合成物包含本发明所述的偶联物，其中，所述施用可以有效治疗受试者的癌症。
[0142]
在某些情况下，所述癌症为恶性血液病。
[0143]
在某些情况下，所述恶性血液病的特征为恶性b细胞。在某些情况下，特征为恶性b细胞的所述恶性血液病为白血病。在某些情况下，所述白血病为慢性淋巴细胞白血病(cll)。
[0144]
在某些情况下，所述恶性血液病为淋巴瘤。在某些情况下，所述淋巴瘤为非霍奇金淋巴瘤(nhl)。
[0145]
本发明各方面包括一种将药物递送至受试者靶位点的方法。所述方法包括向受试者施用包含本发明所述的偶联物的药物合成物，其中，所述施用可以在受试者靶位点上从偶联物中释放治疗有效量的药物。
[0146]
本发明各方面包括一种包括含甲酰甘氨酸(fgly)残基的抗cd37抗体。
[0147]
在某些情况下，所述抗cd37抗体包含序列：
[0148]
x1(fgly)x2z
20
x3z
30
[0149]
其中
[0150]z20
为脯氨酸或丙氨酸残基；
[0151]z30
为碱性氨基酸或脂肪族氨基酸；
[0152]
x1可以存在或不存在，存在时可以是任何氨基酸，但条件是当序列位于抗体n端时，x1存在；以及
[0153]
x2和x3为分别独立的任何氨基酸。
[0154]
在某些情况下，所述序列为l(fgly)tpsr。
[0155]
在某些情况下，所述抗cd37抗体包括以下内容，其中：
[0156]z30
选自r、k、h、a、g、l、v、i和p；
[0157]
x1选自l、m、s和v；以及
[0158]
x2和x3分别独立选自s、t、a、v、g和c。
[0159]
在某些情况下，所述序列位于抗cd37抗体重链恒定区的c端。
[0160]
在某些情况下，所述重链恒定区包含序列：
[0161]
x1(fgly)x2z
20
x3z
30
[0162]
其中
[0163]z20
为脯氨酸或丙氨酸残基；
[0164]z30
为碱性氨基酸或脂肪族氨基酸；
[0165]
x1可以存在或不存在，存在时可以是任何氨基酸，但条件是当序列位于偶联物n端时，x1存在；以及
[0166]
x2和x3为分别独立的任何氨基酸，
[0167]
其中，所述序列为氨基酸序列slslspg的c端。
[0168]
在某些情况下，所述重链恒定区包含序列spgsl(fgly)tpsrgs。
[0169]
在某些情况下，所述抗cd37抗体包括以下内容，其中：
[0170]z30
选自r、k、h、a、g、l、v、i和p；
[0171]
x1选自l、m、s和v；以及
[0172]
x2和x3分别独立选自s、t、a、v、g和c。
[0173]
在某些情况下，所述fgly残基位于抗cd37抗体轻链恒定区。
[0174]
在某些情况下，所述轻链恒定区包含序列：
[0175]
x1(fgly)x2z
20
x3z
30
ꢀꢀ
(ii)
[0176]
其中
[0177]z20
为脯氨酸或丙氨酸残基；
[0178]z30
为碱性氨基酸或脂肪族氨基酸；
[0179]
x1可以存在或不存在，存在时可以是任何氨基酸，但条件是当序列位于偶联物n端时，x1存在；以及
[0180]
x2和x3为分别独立的任何氨基酸，以及
[0181]
其中，所述序列为序列kvdnal的c端，和/或序列qsgnsq的n端。
[0182]
在某些情况下，所述轻链恒定区包含序列kvdnal(fgly)tpsrqsgnsq。
[0183]
在某些情况下，所述抗cd37抗体包括以下内容，其中：
[0184]z30
选自r、k、h、a、g、l、v、i和p；
[0185]
x1选自l、m、s和v；以及
[0186]
x2和x3分别独立选自s、t、a、v、g和c。
[0187]
在某些情况下，所述fgly残基位于抗cd37抗体重链ch1区。
[0188]
在某些情况下，所述重链ch1区包含序列：
[0189]
x1(fgly)x2z
20
x3z
30
[0190]
其中
[0191]z20
为脯氨酸或丙氨酸残基；
[0192]z30
为碱性氨基酸或脂肪族氨基酸；
[0193]
x1可以存在或不存在，存在时可以是任何氨基酸，但条件是当序列位于偶联物n端时，x1存在；以及
[0194]
x2和x3为分别独立的任何氨基酸，以及
[0195]
其中，所述序列为氨基酸序列swnsga的c端，和/或氨基酸序列gvhtfp的n端。
[0196]
在某些情况下，所述重链ch1区包含序列swnsgal(fgly)tpsrgvhtfp。
[0197]
在某些情况下，所述抗cd37抗体包括以下内容，其中：
[0198]z30
选自r、k、h、a、g、l、v、i和p；
[0199]
x1选自l、m、s和v；以及
[0200]
x2和x3分别独立选自s、t、a、v、g和c。
[0201]
在某些情况下，所述fgly残基位于抗cd37抗体重链ch2区。
[0202]
在某些情况下，所述fgly残基位于抗cd37抗体重链ch3区。
[0203]
在某些情况下，所述抗cd37抗体与包含以下内容的抗cd37抗体竞争与cd37结合：
[0204]
可变重链(vh)多肽，包含
[0205]
包含氨基酸序列gynmn(seq id no:3)的v
h cdr1，
[0206]
包含氨基酸序列nidpyyggttynrkfkg(seq id no:4)的v
h cdr2，以及
[0207]
包含氨基酸序列svgpfds(seq id no:5)的v
h cdr3；以及
[0208]
可变轻链(v
l
)多肽，包含
[0209]
包含氨基酸序列rasenvysyla(seq id no:8)的v
l cdr1，
[0210]
包含氨基酸序列faktlae(seq id no:9)的v
l cdr2，以及
[0211]
包含氨基酸序列qhhsdnpwt(seq id no:10)的v
l cdr3。
[0212]
在某些情况下，所述抗cd37抗体包含：
[0213]
可变重链(vh)多肽，包含
[0214]
包含氨基酸序列gynmn(seq id no:3)的v
h cdr1，
[0215]
包含氨基酸序列nidpyyggttynrkfkg(seq id no:4)的v
h cdr2，以及
[0216]
包含氨基酸序列svgpfds(seq id no:5)的v
h cdr3；以及
[0217]
可变轻链(v
l
)多肽，包含
[0218]
包含氨基酸序列rasenvysyla(seq id no:8)的v
l cdr1，
[0219]
包含氨基酸序列faktlae(seq id no:9)的v
l cdr2，以及
[0220]
包含氨基酸序列qhhsdnpwt(seq id no:10)的v
l cdr3。
[0221]
在某些情况下，所述抗cd37抗体包含：
[0222]
可变重链(vh)多肽，包含与seq id no:2中规定的氨基酸序列具有70％或以上、75％或以上、80％或以上、85％或以上、90％或以上、95％或以上、99％或以上或100％一致性的氨基酸序列；以及
[0223]
可变轻链(v
l
)多肽，包含与seq id no:7中规定的氨基酸序列具有70％或以上、75％或以上、80％或以上、85％或以上、90％或以上、95％或以上、99％或以上或100％一致性的氨基酸序列。
[0224]
本发明各方面包括包含本发明所述抗cd37抗体的细胞。
[0225]
本发明各方面包括编码本发明所述抗cd37抗体的核酸。本发明各方面还包括含所
述核酸的表达载体。本发明各方面还包括含所述核酸或所述表达载体的宿主细胞。
[0226]
本发明各方面包括本发明所述的制造抗cd37抗体的方法。此类方法包括在适合细胞表达抗体的条件下培养包含发明所述的表达载体的细胞，其中产生所述抗体。
附图说明
[0227]
图1(图a)显示了使用标准分子生物技术沿抗体主链在理想位置插入的甲酰甘氨酸生成酶(fge)识别序列。表达后，真核细胞内源性fge催化共有序列中的半胱氨酸转化为甲酰基甘氨酸残基(fgly)。图1(图b)显示了携带醛基(每个抗体2个)的抗体与肼基-异-皮克特-施彭格勒(hips)连接子和有效载荷反应，产生位点特异性偶联adc。图1(图c)显示了hips的化学过程，即通过中间肼离子，然后与亲核吲哚进行分子内烷基化，产生稳定的c-c键。
[0228]
图2显示了本发明实施例所述的在重链c端(ct)与附着在hips-4ap连接子的美登素有效载荷偶联的醛标记抗cd37抗体的疏水相互作用柱(hic)痕迹。
[0229]
图3是本发明实施例所述的在重链c端(ct)与附着在hips-4ap连接子的美登素有效载荷偶联的醛标记抗cd37抗体的分析尺寸排除色谱(sec)分析图。
[0230]
图4显示了本发明实施例所述的在重链c端与附着在daudi细胞中hips-4ap连接子(adc)的美登素有效载荷偶联的醛标记抗cd37抗体的体外细胞毒性数据。
[0231]
图5显示了本发明实施例所述的在重链c端与附着在rl细胞中hips-4ap连接子(adc)的美登素有效载荷偶联的醛标记抗cd37抗体的体外细胞毒性数据。
[0232]
图6显示了本发明实施例所述的在重链c端与附着在ramos-ra细胞中hips-4ap连接子(adc)的美登素有效载荷偶联的醛标记抗cd37抗体的体外细胞毒性数据。
[0233]
图7显示了本发明实施例所述的在重链c端与附着在wsu-dlcl2细胞中hips-4ap连接子(adc)的美登素有效载荷偶联的醛标记抗cd37抗体的体外细胞毒性数据。
[0234]
图8显示了本发明实施例所述的在重链c端与附着在granta 519细胞中hips-4ap连接子(adc)的美登素有效载荷偶联的醛标记抗cd37抗体的体外细胞毒性数据。
[0235]
图9显示了本发明实施例所述的在重链c端与附着在bjab细胞中hips-4ap连接子(adc)的美登素有效载荷偶联的醛标记抗cd37抗体的体外细胞毒性数据。
[0236]
图10显示了本发明实施例所述的在重链c端与附着在dohh-2细胞中hips-4ap连接子(adc)的美登素有效载荷偶联的醛标记抗cd37抗体的体外细胞毒性数据。
[0237]
图11显示了本发明实施例所述的在重链c端与附着在su-dhl-4细胞中hips-4ap连接子(adc)的美登素有效载荷偶联的醛标记抗cd37抗体的体外-4细胞毒性数据。
[0238]
图12显示了本发明实施例所述的在重链c端与附着在raji细胞中hips-4ap连接子(adc)的美登素有效载荷偶联的醛标记抗cd37抗体的体外细胞毒性数据。
[0239]
图13显示了证明本发明实施例所述的在重链c端与附着在dohh-2异种移植模型中hips-4ap连接子(adc)的美登素有效载荷偶联的醛标记抗cd37抗体的体内疗效的数据。
[0240]
图14显示的数据证明了本发明实施例所述的在重链c端与附着在granta 519移植瘤模型中hips-4ap连接子(adc)的美登素有效载荷偶联的醛标记抗cd37抗体的体内疗效。
[0241]
图15a描述了一个位点图，显示了产生醛标记ig多肽的可能修饰位点。上面的序列为igg1轻链多肽保守区的氨基酸序列(seq id no:48)，显示了ig轻链中可能的修饰位点；
下面的序列为ig重链多肽保守区的氨基酸序列(seq id no:43；genbank登录号：aag00909)，显示了ig重链的可能修饰位点。重链和轻链编号基于全长重链和轻链。
[0242]
图15b描述了igg1(seq id no:43)、igg2(seq id no:44)、igg3(seq id no:45)、igg4(seq id no:46)和iga(seq id no:47)的免疫球蛋白重链恒定区的顺序，显示了可以在免疫球蛋白重链中提供醛标记的修饰位点。重链和轻链编号基于全长重链和轻链。
[0243]
图15c描述了免疫球蛋白轻链恒定区的顺序(从上至下为seq id nos:48-52)，显示了可以在免疫球蛋白轻链中提供醛标记的修饰位点。
[0244]
定义
[0245]
除非另有说明，否则下列术语具有以下含义。任何未定义的术语具有本领域公认的含义。
[0246]“烷基”是指具有1-10个碳原子(例如，1-6个碳原子，或1-5或1-4或1-3个碳原子)的单价饱和脂肪族烃基。例如，此术语包括直链和支链烃基，例如，甲基(ch
3-)、乙基(ch3ch
2-)、正丙基(ch3ch2ch
2-)、异丙基((ch3)2ch-)、正丁基(ch3ch2ch2ch
2-)、异丁基((ch3)2chch
2-)、仲丁基((ch3)(ch3ch2)ch-)、叔丁基((ch3)3c-)、正戊基(ch3ch2ch2ch2ch
2-)以及新戊基((ch3)3cch
2-)。
[0247]
术语“取代烷基”是指本发明定义的烷基，其中，烷基链中一个或多个碳原子(c1碳原子除外)可选由杂原子(例如-o-、-n-、-s-、-s(o)
n-(其中n为0-2)、-nr-(其中r为氢或烷基))取代，并具有选自以下几项的1-5个取代基：烷氧基、取代烷氧基、环烷基、取代环烷基、环烯基、取代环烯基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、氨酰基、氨基酰氧基、氧氨酰基、叠氮基、氰基、卤素、羟基、氧基、硫代酮基、羧基、羧基烷基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、硫代杂环氧基、硫醇基、硫代烷氧基、取代硫代烷氧基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基、羟氨基、烷氧氨基、硝基、-so-烷基、-so-芳基、-so-杂芳基、-so
2-烷基、-so
2-芳基、-so
2-杂芳基以及-nrarb，其中，r’和r”可以相同或不同，并且选自氢、可选取代烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、芳基、杂芳基以及杂环基。
[0248]“亚烃基”是指优选具有1-6个、更优选具有1-3个碳原子的直链或支链的二价脂肪族烃基，并可选用一个或多个选自-o-、-nr
10-、-nr
10
c(o)-、-c(o)nr
10-等的基团打断。例如，此术语包括亚甲基(-ch
2-)、乙烯(-ch2ch
2-)、正丙烯(-ch2ch2ch
2-)、异丙基(-ch2ch(ch3)-)、(-c(ch3)2ch2ch
2-)、(-c(ch3)2ch2c(o)-)、(-c(ch3)2ch2c(o)nh-)、(-ch(ch3)ch
2-)等。
[0249]“取代亚烃基”是指1-3个氢由取代基取代(如下文“取代”定义中对碳的描述)的亚烷基。
[0250]
术语“烷烃”是指本发明所定义的烷基和亚烃基。
[0251]
术语“烷基氨基烷基”、“烷基氨基烯基”和“烷基氨基炔基”是指基团r’nhr”，其中r’是本发明定义的烷基，r”是本发明定义的亚烷基、亚烯基或亚炔基。
[0252]
术语“烷芳基”或“芳烷基”是指基团-亚烃基-芳基和-取代亚烃基-芳基，其中本发明定义了亚烃基、取代亚烃基和芳基。
[0253]“烷氧基”是指基团-o-烷基，其中本发明定义了烷基。例如，烷氧基包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基等。术语“烷氧基”是指基团烯基-o-、环烷基-o-、环烯基-o-以及炔基-o-，其中本发明定义了烯基、环烷基、环烯基以及炔基。
[0254]
术语“取代烷氧基”是指基团取代烷基-o-、取代烯基-o-、取代环烷基-o-、取代环烯基-o-以及取代炔基-o-，其中本发明定义了取代烷基、取代烯基、取代环烷基、取代环烯基以及取代炔基。
[0255]
术语“烷氧基氨基”是指基团-nh-烷氧基，其中本发明定义了烷氧基。
[0256]
术语“卤代烷氧基”是指基团烷基-o-，其中，烷基上的一个或多个氢原子已由卤代基取代，例如还包括三氟甲氧基等基团。
[0257]
术语“卤代烷基”是指上述取代烷基，其中，烷基上的一个或多个氢原子已由卤代基取代。此类基团的示例包括但不限于氟烷基，例如三氟甲基、二氟甲基、三氟乙酯等。
[0258]
术语“烷基烷氧基”是指基团-亚烃基-o-烷基、亚烃基-o-取代烷基、取代亚烃基-o-烷基以及取代亚烃基-o-取代烷基，其中本发明定义了烷基、取代烷基、亚烃基和取代亚烃基。
[0259]
术语“烷基硫代烷氧基”是指基团-亚烃基-s-烷基、亚烃基-s-取代烷基、取代亚烃基-s-烷基以及取代亚烃基-s-取代烷基，其中本发明定义了烷基、取代烷基、亚烃基和取代亚烃基。
[0260]“烯基”是指具有2-6个碳原子(优选2-4个碳原子)的直链或支链烃基，并且具有至少一个(优选1-2个)双键不饱和位点。例如，此术语包括双-乙烯基、烯丙基以及丁-3-烯-1-基。此术语包括顺式和反式异构体或这些异构体的混合物。
[0261]
术语“取代烯基”是指本发明定义的具有选自以下几项的1-5个取代基或1-3个取代基的烯基：烷氧基、取代烷氧基、环烷基、取代环烷基、环烯基、取代环烯基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、取代氨基、氨酰基、氨酰氧基、氧氨酰基、叠氮基、氰基、卤素、羟基、氧基、硫代酮基、羧基、羧基烷基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、硫代杂环氧基、硫醇基、硫代烷氧基、取代硫代烷氧基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基、羟氨基、烷氧氨基、硝基、-so-烷基、-so-取代烷基、-so-芳基、-so-杂芳基、-so
2-烷基、-so
2-取代烷基、-so
2-芳基以及-so
2-杂芳基。
[0262]“炔基”是指具有2-6个碳原子(优选2-3个碳原子)的直链或支链单价烃基，并且具有至少1个(优选1-2个)三键不饱和位点。此类炔基的示例包括乙炔基(-c≡ch)和炔丙基(-ch2c≡ch)。
[0263]
术语“取代炔基”是指本发明定义的具有选自以下几项的1-5个取代基或1-3个取代基的炔基：选自烷氧基、取代烷氧基、环烷基、取代环烷基、环烯基、取代环烯基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、取代氨基、氨酰基、氨酰氧基、氧氨酰基、叠氮基、氰基、卤素、羟基、氧基、硫代酮基、羧基、羧基烷基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、硫代杂环氧基、硫醇基、硫代烷氧基、取代硫代烷氧基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基、羟氨基、烷氧氨基、硝基、-so-烷基、-so-取代烷基、-so-芳基、-so-杂芳基、-so
2-烷基、-so
2-取代烷基、-so
2-芳基以及-so
2-杂芳基。
[0264]“炔氧基”是指基团-o-炔基，其中本发明定义了炔基。例如，炔氧基包括乙炔氧基、丙炔氧基等。
[0265]“酰基”是指基团h-c(o)-、烷基-c(o)-、取代烷基-c(o)-、烯基-c(o)-、取代烯基-c(o)-、炔基-c(o)-、取代炔基-c(o)-、环烷基-c(o)-、取代环烷基-c(o)-、环烯基-c(o)-、取代环烯基-c(o)-、芳基-c(o)-、取代芳基-c(o)-、杂芳基-c(o)-、取代杂芳基-c(o)-、杂环
基-c(o)-以及取代杂环基-c(o)-，其中本发明定义了烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、环烷基、取代环烷基、环烯基、取代环烯基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基以及取代杂环基。例如，酰基包括“乙酰”基ch3c(o)-。
[0266]“酰氨基”是指基团-nr
20
c(o)烷基、-nr
20
c(o)取代烷基、n r
20
c(o)环烷基、-nr
20
c(o)取代环烷基、-nr
20
c(o)环烯基、-nr
20
c(o)取代环烯基、-nr
20
c(o)烯基、-nr
20
c(o)取代烯基、-nr
20
c(o)炔基、-nr
20
c(o)取代炔基、-nr
20
c(o)芳基、-nr
20
c(o)取代芳基、-nr
20
c(o)杂芳基、-nr
20
c(o)取代杂芳基、-nr
20
c(o)杂环基以及-nr
20
c(o)取代杂环基，其中，r
20
为氢或烷基，其中本发明定义了烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、环烷基、取代环烷基、环烯基、取代环烯基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基以及取代杂环基。
[0267]“氨基羰基”或术语“氨酰基”是指基团-c(o)nr
21r22
，其中，r
21
和r
22
独立选自由以下几项构成的基团：氢、烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、环烷基、取代环烷基、环烯基、取代环烯基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基以及取代杂环基，其中，r
21
和r
22
可选与氮结合形成杂环基或取代杂环基，其中本发明定义了烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、环烷基、取代环烷基、环烯基、取代环烯基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基以及取代杂环基。
[0268]“氨基羰基氨基”是指基团-nr
21
c(o)nr
22r23
，其中，r
21
、r
22
和r
23
独立选自氢、烷基、芳基或环烷基，或者其中两个r基团连接形成杂环基。
[0269]
术语“烷氧基羰基氨基”是指基团-nrc(o)or，其中，每个r为独立的氢、烷基、取代烷基、芳基、杂芳基或杂环基，其中本发明定义了烷基、取代烷基、芳基、杂芳基和杂环基。
[0270]
术语“酰氧基”是指基团烷基-c(o)o-、取代烷基-c(o)o-、环烷基-c(o)o-、取代环烷基-c(o)o-、芳基-c(o)o-、杂芳基-c(o)o-以及杂环基-c(o)o-，其中本发明定义了烷基、取代烷基、环烷基、取代环烷基、芳基、杂芳基以及杂环基。
[0271]“氨基磺酰基”是指基团-so2nr
21r22
，其中，r
21
和r
22
独立选自由以下几项构成的基团：氢、烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、环烷基、取代环烷基、环烯基、取代环烯基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基以及取代杂环基，其中，r
21
和r
22
可选与氮结合形成杂环基或取代杂环基，并且本发明定义了烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、环烷基、取代环烷基、环烯基、取代环烯基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基以及取代杂环基。
[0272]“磺酰基氨基”是指基团-nr
21
so2r
22
，其中，r
21
和r
22
独立选自由以下几项构成的基团：氢、烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、环烷基、取代环烷基、环烯基、取代环烯基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基以及取代杂环基，其中，r
21
和r
22
可选与原子结合形成杂环基或取代杂环基，其中本发明定义了烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、环烷基、取代环烷基、环烯基、取代环烯基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基以及取代杂环基。
[0273]“芳基(aryl)”或“芳基(ar)”是指具有单环(例如存在于苯基中)或多稠环(可以是也可以不是芳族)的环系统(此类芳环系统的示例包括萘基、蒽基和茚满基)且具有6-18个碳原子的单价芳族碳环基，前提是附着点通过芳环的原子。例如，此术语包括苯基和萘基。除非芳基取代基的定义另有规定，否则此类芳基可选由选自以下几项的1-5个取代基或1-3个取代基所取代：酰氧基、羟基、硫醇基、酰基、烷基、烷氧基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、取
代烷基、取代烷氧基、取代烯基、取代炔基、取代环烷基、取代环烯基、氨基、取代氨基、氨酰基、酰氨基、烷芳基、芳基、芳氧基、叠氮基、羧基、羧基烷基、氰基、卤素、硝基、杂芳基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基、氨酰氧基、氧酰氨基、硫代烷氧基、取代硫代烷氧基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、-so-烷基、-so-取代烷基、-so-芳基、-so-杂芳基、-so
2-烷基、-so
2-取代烷基、-so
2-芳基、-so
2-杂芳基以及三卤甲基。
[0274]“芳氧基”是指基团-o-芳基，其中本发明定义了芳基，包括苯氧基、萘氧基等，也包括本发明定义的可选取代芳基。
[0275]“氨基”是指基团-nh2。
[0276]
术语“取代氨基”是指基团-nrr，其中，每个r独立选自由氢、烷基、取代烷基、环烷基、取代环烷基、烯基、取代烯基、环烯基、取代环烯基、炔基、取代炔基、芳基、杂芳基和杂环基，前提是至少有一个r不为氢。
[0277]
术语“叠氮基”是指基团-n3。
[0278]“羧基(carboxyl)”、“羧基(carboxy)”或“羧酸盐”是指
–
co2h或其盐。
[0279]“羧基酯(carboxyl ester)”或“羧基酯(carboxy ester)”或术语“羧基烷基(carboxyalkyl)”或“羧基烷基(carboxylalkyl)”是指基团-c(o)o-烷基、-c(o)o-取代烷基、-c(o)o-烯基、-c(o)o-取代烯基、-c(o)o-炔基、-c(o)o-取代炔基、-c(o)o-芳基、-c(o)o-取代芳基、-c(o)o-环烷基、-c(o)o-取代环烷基、-c(o)o-环烯基、-c(o)o-取代环烯基、-c(o)o-杂芳基、-c(o)o-取代杂芳基、-c(o)o-杂环基以及-c(o)o-取代杂环基，其中本发明定义了烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、环烷基、取代环烷基、环烯基、取代环烯基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基以及取代杂环基。
[0280]“(羧基酯)氧基”或“碳酸酯”是指基团-o-c(o)o-烷基、-o-c(o)o-取代烷基、-o-c(o)o-烯基、-o-c(o)o-取代烯基、-o-c(o)o-炔基、-o-c(o)o-取代炔基、-o-c(o)o-芳基、-o-c(o)o-取代芳基、-o-c(o)o-环烷基、-o-c(o)o-取代环烷基、-o-c(o)o-环烯基、-o-c(o)o-取代环烯基、-o-c(o)o-杂芳基、-o-c(o)o-取代杂芳基、-o-c(o)o-杂环基以及-o-c(o)o-取代杂芳基，其中本发明定义了烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、环烷基、取代环烷基、环烯基、取代环烯基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基以及取代杂环基。
[0281]“氰基”或“腈”是指基团-cn。
[0282]“环烷基”是指具有单环或多循环环(包括稠环、桥环和螺环系统)且具有3-10个碳原子组成的环烷基。合适的环烷基示例包括金刚烷基、环丙基、环丁基、环戊基、环辛基等。例如，此外环烷基包括单环结构，例如环丙基、环丁基、环戊基、环辛基等，或包括多环结构，例如金刚烷基等。
[0283]
术语“取代环烷基”是指具有选自以下几项的1-5个取代基或1-3个取代基的环烷基：烷基、取代烷基、烷氧基、取代烷氧基、环烷基、取代环烷基、环烯基、取代环烯基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、取代氨基、氨酰基、氨酰氧基、氧氨酰基、叠氮基、氰基、卤素、羟基、氧基、硫代酮基、羧基、羧基烷基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、硫代杂环氧基、硫醇基、硫代烷氧基、取代硫代烷氧基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基、羟氨基、烷氧氨基、硝基、-so-烷基、-so-取代烷基、-so-芳基、-so-杂芳基、-so
2-烷基、-so
2-取代烷基、-so
2-芳基以及-so
2-杂芳基。
[0284]“环烯基”是指由3-10个碳原子组成的非芳香环烷基，具有单环或多环并具有至少一个双键，优选1-2个双键。
[0285]
术语“取代环烯基”是指具有选自以下几项的1-5个取代基或1-3个取代基的环烯基：烷氧基、取代烷氧基、环烷基、取代环烷基、环烯基、取代环烯基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、取代氨基、氨酰基、氨酰氧基、氧氨酰基、叠氮基、氰基、卤素、羟基、酮基、硫代酮基、羧基、羧基烷基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、硫代杂环氧基、硫醇基、硫代烷氧基、取代硫代烷氧基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基、羟氨基、烷氧氨基、硝基、-so-烷基、-so-取代烷基、-so-芳基、-so-杂芳基、-so
2-烷基、-so
2-取代烷基、-so
2-芳基以及-so
2-杂芳基。
[0286]“环炔基”是指由5-10个碳原子组成的非芳香环炔基，具有单环或多环并具有至少一个三键。
[0287]“环烷氧基”是指-o-环烷基。
[0288]“环烯氧基”是指-o-环烯基。
[0289]“卤代”或“卤素”是指氟代、氯代、溴代和碘代。
[0290]“羟基(hydroxy)”或“羟基(hydroxyl)”是指基团-oh。
[0291]“杂芳基”是指具有1-15个碳原子的芳基，例如选自环内氧、氮和硫基团的1-10个碳原子和1-10个杂原子。此类杂芳基可在环系统中具有单环(例如，吡啶基、咪唑基或呋喃基)或多个稠环(例如，在如中氮茚基、喹啉基、苯并呋喃、苯并咪唑基或苯并噻吩基的基团中)，其中，在环系统内至少一个环为芳环。为了满足化合价要求，此类杂芳基环中的任何杂原子可能与或可能不与氢或取代基(例如烷基或本发明所述的其他取代基)结合。在某些实施例中，杂芳基的氮和/或硫环原子可选氧化以提供n-氧化(n
→
o)、亚磺酰基或磺酰基。例如，此术语包括吡啶基、吡咯基、吲哚基、苯硫基和呋喃基。除非杂芳基取代基的定义另有规定，否则此类杂芳基可选由选自以下几项的1-5个取代基或1-3个取代基所取代：酰氧基、羟基、硫醇基、酰基、烷基、烷氧基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、取代烷基、取代烷氧基、取代烯基、取代炔基、取代环烷基、取代环烯基、氨基、取代氨基、氨酰基、酰氨基、烷芳基、芳基、芳氧基、叠氮基、羧基、羧基烷基、氰基、卤素、硝基、杂芳基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基、氨酰氧基、氧酰氨基、硫代烷氧基、取代硫代烷氧基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、-so-烷基、-so-取代烷基、-so-芳基、-so-杂芳基、-so
2-烷基、-so
2-取代烷基、-so
2-芳基、-so
2-杂芳基以及三卤甲基。
[0292]
术语“杂芳烷基”是指基团-亚烃基-杂芳基，其中本发明定义了亚烃基和杂芳基。例如，此术语包括吡啶甲基、吡啶乙基、吲哚甲基等。
[0293]“杂芳氧基”是指-o-杂芳基。
[0294]“杂环(heterocycle)”、“杂环(heterocyclic)”、“杂环烷基”和“杂环基(heterocyclyl)”是指具有单环或多稠环、包括稠环、桥环和螺环系统，并且具有3-20个环原子(包括1-10个杂原子)的饱和或不饱和基团。这些环原子选自氮、硫或氧，其中，在稠环系统中，一个或多个环可以是环烷基、芳基或杂芳基，前提是附着点通过非芳环。在某些实施例中，杂环基的氮和/或硫原子可选氧化以提供n-氧化物、-s(o)-或-so
2-基团。为了满足化合价要求，此类杂环中的任何杂原子可能与或可能不与一个或多个氢或一个或多个取代基(例如烷基或本发明所述的其他取代基)结合。
[0295]
杂环基和杂芳基的示例包括但不限于氮杂环丁烷、吡咯、咪唑、吡唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、吲哚嗪、异吲哚、吲哚、二氢吲哚、吲唑、嘌呤、喹嗪、异喹啉、喹啉、酞嗪、萘基吡啶、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、蝶啶、咔唑、咔啉、菲啶、吖啶、菲咯啉、异噻唑、吩嗪、异恶唑、吩噁嗪、吩噻嗪、咪唑烷、咪唑啉、哌啶、哌嗪、二氢吲哚、邻苯二甲酰亚胺、1,2,3,4-四氢异喹啉、4,5,6,7-四氢苯并[b]噻吩、噻唑、噻唑烷、噻吩、苯并[b]噻吩、吗啉基、硫代吗啉基(也称为硫吗啉基、1,1-二氧代硫代吗啉基、哌啶基、吡咯烷、四氢呋喃基等。
[0296]
除非杂环取代基的定义另有限制，否则此类杂环基可选由选自以下几项的1-5个或1-3个取代基所取代：烷氧基、取代烷氧基、环烷基、取代环烷基、环烯基、取代环烯基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、取代氨基、氨酰基、氨酰氧基、氧氨酰基、叠氮基、氰基、卤素、羟基、氧基、硫代酮基、羧基、羧基烷基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、硫代杂环氧基、硫醇基、硫代烷氧基、取代硫代烷氧基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基、羟氨基、烷氧氨基、硝基、-so-烷基、-so-取代烷基、-so-芳基、-so-杂芳基、-so
2-烷基、-so
2-取代烷基、-so
2-芳基、-so
2-杂芳基以及稠杂环基。
[0297]
术语“杂环氧基”是指基团-o-杂环基。
[0298]
术语“杂环硫”是指基团杂环-s-。
[0299]
术语“杂环烯”是指本发明定义的杂环形成的双自由基。
[0300]
术语“羟氨基”是指基团-nhoh。
[0301]“硝基”是指基团-no2。
[0302]“氧基”是指原子(＝o)。
[0303]“磺酰基”是指基团so
2-烷基、so
2-取代烷基、so
2-烯基、so
2-取代烯基、so
2-环烷基、so
2-取代环烷基、so
2-环烯基、so
2-取代环烯基、so
2-芳基、so
2-取代芳基、so
2-杂芳基、so
2-取代杂芳基、so
2-杂环基以及so
2-取代杂环基，其中本发明定义了烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、环烷基、取代环烷基、环烯基、取代环烯基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基以及取代杂环基。例如，磺酰基包括甲基-so
2-、苯基-so
2-以及4-甲苯基-so
2-。
[0304]“磺酰氧基”是指基团-oso
2-烷基、oso
2-取代烷基、oso
2-烯基、oso
2-取代烯基、oso
2-环烷基、oso
2-取代环烷基、oso
2-环烯基、oso
2-取代环烯基、oso
2-芳基、oso
2-取代芳基、oso
2-杂芳基、oso
2-取代杂芳基、oso
2-杂环基以及oso2取代杂环基，其中本发明定义了烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、环烷基、取代环烷基、环烯基、取代环烯基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基以及取代杂环基。
[0305]
术语“氨基羰基氨基”是指基团-oc(o)nrr，其中，每个r为独立的氢、烷基、取代烷基、芳基、杂芳基或杂环基，其中本发明定义了烷基、取代烷基、芳基、杂芳基和杂环基。
[0306]“硫醇基”是指基团-sh。
[0307]“硫代基”或术语“硫代酮基”是指原子(＝s)。
[0308]“烷基硫醇”或术语“硫代烷氧基”是指基团-s-烷基，其中本发明定义了烷基。在某些实施例中，硫可氧化为-s(o)-。亚砜可作为一个或多个立体异构体存在。
[0309]
术语“取代硫代烷氧基”是指基团-s-取代烷基。
[0310]
术语“硫代芳氧基”是指基团芳基-s-，其中，本发明定义了芳基，包括本发明定义的可选取代芳基。
[0311]
术语“硫代杂芳氧基”是指基团杂芳基-s-，其中，本发明定义了杂芳基，包括本发明定义的可选取代芳基。
[0312]
术语“硫代杂环氧基”是指基团杂环-s-，其中，本发明定义了杂环基，包括本发明定义的可选取代杂环基。
[0313]
除本发明所述外，当用于修饰特定基团或自由基时，术语“取代”也可以指特定基团或自由基的一个或多个氢原子相互独立，由下文定义的相同或不同取代基所取代。
[0314]
除了本发明针对个别术语公开的基团之外，除非另有规定，否则用于取代指定基团或自由基中饱和碳原子上一个或多个氢(一个碳上任意两个氢都可以由＝o、＝nr
70
、＝n-or
70
、＝n2或＝s取代)的取代基为-r
60
、卤代、＝o、-or
70
、-sr
70
、-nr
80r80
、三卤甲基、-cn、-ocn、-scn、-no、-no2、＝n2、-n3、-so2r
70
、-so2o
–m
、-so2or
70
、-oso2r
70
、-oso2o
–m
、-oso2or
70
、-p(o)(o
–
)2(m

)2、-p(o)(or
70
)o
–m
、-p(o)(or
70
)2、-c(o)r
70
、-c(s)r
70
、-c(nr
70
)r
70
、-c(o)o
–m
、-c(o)or
70
、-c(s)or
70
、-c(o)nr
80r80
、-c(nr
70
)nr
80r80
、-oc(o)r
70
、-oc(s)r
70
、-oc(o)o-m

、-oc(o)or
70
、-oc(s)or
70
、-nr
70
c(o)r
70
、-nr
70
c(s)r
70
、-nr
70
co2–m
、-nr
70
co2r
70
、-nr
70
c(s)or
70
、-nr
70
c(o)nr
80r80
、-nr
70
c(nr
70
)r
70
和-nr
70
c(nr
70
)nr
80r80
，其中，r
60
选自由以下几项构成的基团：可选取代烷基、环烷基、杂烷基、杂环烷基烷基、环烷基烷基、芳基、芳烷基、杂芳基以及杂芳烷基，每个r
70
为独立的氢或r
60
；每个r
80
为独立的r
70
，或者两个r
80
与其所键合的氮原子一起形成五元、六元或七元杂环烷基，所述杂环烷基可选包括1-4个相同或不同的杂原子，这些杂原子选自o、n和s构成的基团，其中n可由-h或c
1-c3烷基取代；每个m

是带有净正电荷的抗衡离子。每个m

可以是独立的碱离子，例如k

、na

、li

；铵离子，例如

n(r
60
)4；或碱土离子，例如[ca
2
]
0.5
、[mg
2
]
0.5
或[ba
2
]
0.5
(“下标0.5表示此类二价碱土离子的一个抗衡离子可以是本发明化合物的离子形式，而另一种是典型的抗衡离子，例如氯离子，或者本发明公开的两个离子化合物可作为此类二价碱土离子的抗衡离子，或者本发明所述的双离子化合物可作为此类二价碱土离子的抗衡离子)。作为具体的示例，-nr
80r80
包括-nh2、-nh-烷基、n-吡咯烷基、n-哌嗪基、4n-甲基-哌嗪-1-基以及n-吗啉基。
[0315]
除本发明所述外，除非另有规定，否则“取代的”烯烃、炔烃、芳基和杂芳基中的不饱和碳原子上的氢取代基为-r
60
、卤代、-o-m

、-or
70
、-sr
70
、-s
–m
、-nr
80r80
、三卤甲基、-cf3、-cn、-ocn、-scn、-no、-no2、-n3、-so2r
70
、-so3–m
、-so3r
70
、-oso2r
70
、-oso3–m
、-oso3r
70
、-po
3-2
(m

)2、-p(o)(or
70
)o
–m
、-p(o)(or
70
)2、-c(o)r
70
、-c(s)r
70
、-c(nr
70
)r
70
、-co2–m
、-co2r
70
、-c(s)or
70
、-c(o)nr
80r80
、-c(nr
70
)nr
80r80
、-oc(o)r
70
、-oc(s)r
70
、-oco2–m
、-oco2r
70
、-oc(s)or
70
、-nr
70
c(o)r
70
、-nr
70
c(s)r
70
、-nr
70
co2–m
、-nr
70
co2r
70
、-nr
70
c(s)or
70
、-nr
70
c(o)nr
80r80
、-nr
70
c(nr
70
)r
70
和-nr
70
c(nr
70
)nr
80r80
，其中，r
60
、r
70
、r
80
和m

的定义如前所述，前提是在取代烯烃或炔烃的情况下，取代基不是-o-m

、-or
70
、-sr
70
或-s
–m
。
[0316]
除本发明个别术语所公开的基团外，除非另有规定，“取代的”杂烷基和杂环烷基中氮原子上的氢取代基为-r
60
、-o-m

、-or
70
、-sr
70
、-s-m

、-nr
80r80
、三卤甲基、-cf3、-cn、-no、-no2、-s(o)2r
70
、-s(o)2o-m

、-s(o)2or
70
、-os(o)2r
70
、-os(o)2o-m

、-os(o)2or
70
、-p(o)(o-)2(m

)2、-p(o)(or
70
)o-m

、-p(o)(or
70
)(or
70
)、-c(o)r
70
、-c(s)r
70
、-c(nr
70
)r
70
、-c(o)or
70
、-c(s)or
70
、-c(o)nr
80r80
、-c(nr
70
)nr
80r80
、-oc(o)r
70
、-oc(s)r
70
、-oc(o)or
70
、-oc(s)or
70
、-nr
70
c(o)r
70
、-nr
70
c(s)r
70
、-nr
70
c(o)or
70
、-nr
70
c(s)or
70
、-nr
70
c(o)nr
80r80
、-nr
70
c(nr
70
)r
70
和-nr
70
c(nr
70
)nr
80r80
，其中，r
60
、r
70
、r
80
和m

的定义如前所述。
[0317]
除本发明所述外，在某些实施例中，取代基团具有1、2、3或4个取代基，1、2或3个取代基，1或2个取代基或者1个取代基。
[0318]
应理解的是，在上文定义的所有取代基中，本发明不包括通过采取其进一步取代基定义取代基(例如，由取代芳基作为取代基的取代芳基，其自身由取代芳基所取代，所述取代芳基进一步由取代芳基取代等)而得到的聚合物。在此类情况下，此类取代基的最大数量为三。例如，本发明专门讨论的取代芳基的连续取代仅限于取代芳基-(取代芳基)-取代芳基。
[0319]
除非另有说明，本发明没有明确定义的取代基的命名是通过命名官能团的末端部分，然后命名附着点的相邻官能团来实现的。例如，取代基“芳基烷氧基羰基”是指基团(芳基)-(烷基)-o-c(o)-。
[0320]
对于本发明公开的包含一个或多个取代基的任何基团，应理解的是，此类基团不包含空间上不切实际和/或不可合成的任何取代或取代模式。此外，受试化合物包括由这些化合物的取代而产生的所有立体化学异构体。
[0321]
术语“可药用盐”是指可向患者(例如哺乳动物)施用的盐(对于给定剂量方案，具有哺乳动物可接受的安全性的抗衡离子盐)。此类盐可源自可药用无机或有机碱以及可药用无机或有机酸。“可药用盐”是指化合物的可药用盐，这些盐源自自本领域众所周知的多种有机和无机抗衡离子，例如，包括钠、钾、钙、镁、铵、四烷基铵等；当分子中含有碱性官能团时，还包括有机或无机酸(例如，盐酸盐、氢溴酸盐、甲酸盐、酒石酸盐、苯磺酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐、草酸盐等)的盐类。
[0322]
术语“其盐”是指当酸的质子由阳离子(例如，金属阳离子或有机阳离子等)取代时形成的化合物。在适用的情况下，所述盐是一种可药用盐，尽管这对于不打算施用于患者的中间化合物的盐来说不是必须的。例如，本发明化合物的盐包括那些采用无机或有机酸对化合物进行质子化形成阳离子的盐，其中无机或有机酸的共轭碱作为盐的阴离子成分。
[0323]“溶剂化物”是指溶剂分子与溶质的分子或离子结合形成的复合物。溶剂可以是有机化合物、无机化合物或两者的混合物。一些溶剂示例包括但不限于甲醇、n,n-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二甲亚砜和水。当溶剂为水时，形成的溶剂化物为水合物。
[0324]“立体异构体(stereoisomer)”和“立体异构体(stereoisomers)”是指具有相同原子连接性但在空间中原子排列不同的化合物。立体异构体包括顺反式异构体、e和z异构体、对映异构体和非对映异构体。
[0325]“互变异构体”是指仅在原子的电子键合和/或质子位置不同的分子替代形式，例如烯醇-酮和亚胺-烯胺互变异构体，或含有-n＝c(h)-nh-环原子排列的杂芳基的互变异构形式，例如吡唑、咪唑、苯并咪唑、三唑和四唑。本领域普通技术人员将认识到可能存在其他互变异构环原子排列。
[0326]
应理解的是，术语“或其盐或溶剂化物或立体异构体”旨在包括盐、溶剂化物和立体异构体的所有排列，例如受试化合物的立体异构体的可药用盐的溶剂化物。
[0327]“治疗有效量(pharmaceutically effective amount)”和“治疗有效量(therapeutically effective amount)”是指足以治疗特定障碍或疾病或其一种或多种症状和/或预防障碍或疾病发生的化合物数量。关于致瘤性增生性疾病，治疗有效量包含足以使肿瘤收缩或降低肿瘤生长速率的数量。
[0328]“患者”是指人类或非人类受试者，特别是哺乳动物类受试者。
[0329]
本发明使用的术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指治疗患者(例如哺乳动物(特别是人类))的疾病或病症，包括：(a)预防疾病或病症的发生，例如对受试者进行预防性治疗；(b)改善疾病或病症，例如消除疾病或病症或使患者的疾病或病症消退；(c)抑制疾病或病症，例如减缓或抑制患者疾病或病症的发展；(d)减轻患者疾病或病症的症状。
[0330]
术语“多肽”、“肽”或“蛋白”在本发明中可交替使用以指代任何长度的氨基酸的聚合形式。除非另有明确说明，“多肽”、“肽”或“蛋白”可包括基因编码和非编码的氨基酸，化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸以及具有修饰肽主链的多肽。此术语包括融合蛋白，包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白、具有异源和同源前导序列的融合蛋白、含有至少一个n端甲硫氨酸残基的蛋白(例如，促进重组宿主细胞的产生)；免疫标记蛋白等。
[0331]“天然氨基酸序列”或“亲本氨基酸序列”在本发明中可交替使用指代多肽在修饰前的氨基酸序列，包括修饰的氨基酸残基。
[0332]
术语“氨基酸类似物”、“非天然氨基酸”等可交替使用，并包括在结构和/或整体形状上与天然蛋白中发现的一种或多种氨基酸(例如，ala或a、cys或c、asp或d、glu或e、phe或f、gly或g、his或h、ile或i、lys或k、leu或l、met或m、asn或n、pro或p、gln或q、arg或r、ser或s、thr或t、val或v、trp或w、tyr或y)相似的氨基酸类化合物。氨基酸类似物还包括具有修饰侧链或主链的天然氨基酸。氨基酸类似物还包括具有与天然d型以及l型氨基酸类似物具有相同立体化学的氨基酸类似物。在某些情况下，所述氨基酸类似物共享一个或多个天然氨基酸的主链结构和/或侧链结构，不同之处在于分子中的一个或多个修饰基团。此类修饰可包括但不限于，用原子(例如n)取代相关原子(例如s)、基团(例如甲基或羟基等)或原子(例如cl或br等)添加、基团缺失、共价键(单键取代双键等)取代或其组合。例如，氨基酸类似物可包括α-羟基酸和α-氨基酸等。
[0333]
术语“氨基酸侧链”或“氨基酸的侧链”等可用于指代附着在氨基酸残基(包括天然氨基酸、非天然氨基酸和氨基酸类似物)α-碳上的取代基。在本发明所述的修饰氨基酸和/或偶联物的背景下，氨基酸侧链还可包括氨基酸侧链。
[0334]
术语“碳水化合物”等可用于指代单糖、双糖、低聚糖和多糖的单体单位和/或聚合物。术语糖可用于指代较小的碳水化合物，例如单糖、双糖。术语“碳水化合物衍生物”包括目标碳水化合物的一个或多个官能团被取代(由任何适当的取代基取代)、修饰(使用任何适当的化学方法转化为另一个基团)或不存在(例如由氢消除或取代)的化合物。各种碳水化合物和碳水化合物衍生物可用于或适用于受试化合物和偶联物。
[0335]
术语“抗体”具有最广泛的意义，包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体和多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人源化抗体、单链抗体(例如scfv)、嵌合抗体、抗体片段(例如fab片段)等。抗体能够与靶抗原结合。(janeway，c.，travers，p.，walport，m.，shlomchik(2001)《免疫生物学》，第5版，加兰出版社，纽约)。靶抗原可具有由抗体一个或多个可变区形成的互补性决定区(cdr)识别的一个或多个结合位点，也称为表位。
[0336]
术语“天然抗体”是指抗体重链和轻链由多细胞生物免疫系统产生并配对的抗体。脾脏、淋巴结、骨髓和血清是产生天然抗体的组织示例。例如，从抗原免疫的第一只动物中分离的抗体产生细胞所产生的抗体为天然抗体。
[0337]
术语“人源化抗体”或“人源化免疫球蛋白”是指(例如在框架区、恒定区或cdr中)含有一个或多个氨基酸(由人类抗体中相应位置氨基酸所取代)的非人类(例如小鼠或家兔)抗体。一般来说，与同一抗体的非人源化版本相比，人源化抗体在人类宿主体内产生的免疫反应有所降低。抗体可通过本领域已知的各种技术进行人源化，例如，包括cdr-移植(ep 239,400；pct出版物wo 91/09967；第5,225,539号；第5,530,101号和第5,585,089号美国专利)、镶饰或表面重塑(ep 592,106；ep 519,596；padlan，分子免疫学，28(4/5):489-498(1991)；studnicka等人，蛋白工程，7(6):805-814(1994)；roguska等人，pnas 91:969-973(1994))以及链替换(第5,565,332号美国专利)。在某些实施例中，通过对cdr和框架残基的相互作用进行建模，确定对抗原结合重要的框架残基，并通过序列比较来确定特定位置的不寻常的框架残基，从而确定框架替代(见第5,585,089号美国专利；riechmann等人，自然杂志，332:323(1988))。在第5,750,078号；第5,502,167号；第5,705,154号；第5,770,403号；第5,698,417号；第5,693,493号；第5,558,864号；第4,935,496号和第4,816,567号美国专利以及pct出版物wo 98/45331和wo 98/45332中描述了本发明中考虑使用的其他人源化抗体的方法。在特定实施例中，可以根据us20040086979和us20050033031中规定的方法对受试家兔抗体进行人源化。因此，可使用本领域众所周知的方法对上述抗体进行人源化。
[0338]
术语“嵌合抗体”是指其轻链和重链基因是由属于不同物种的抗体可变区和恒定区基因构建而成(通常通过基因工程)的抗体。例如，小鼠单克隆抗体的基因可变片段可与人类恒定片段连接，如γ1和γ3。治疗性嵌合抗体的示例是由小鼠抗体的可变或抗原结合结构域以及人类抗体的恒定或效应结构域组成的杂合蛋白，但也可以使用其他哺乳动物物种的结构域。
[0339]
一个免疫球蛋白多肽的免疫球蛋白轻链或重链可变区由三个高变区(也称为“互补决定区”或“cdr”)打断的框架区(fr)组成。框架区和cdr的范围已确定(见“具有免疫学重要性的蛋白序列”，e.kabat等人，美国卫生与公众服务部，1991)。抗体的框架区(即成分轻链和重链的组合框架区)用于定位和对齐cdr。cdr主要负责与抗原的表位结合。
[0340]
在本发明中，免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链中的残基编号与kabat等人的“具有免疫学重要性的蛋白序列”(第5版，公共卫生服务部，国家卫生研究院，bethesda，医学博士(1991))中的编号相同，并通过引用明确成为本发明的一部分。
[0341]“亲本ig多肽”为包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列缺少本发明所述的醛标记的恒定区。亲本多肽可包含天然序列恒定区，或者可包含具有预先存在的氨基酸序列修饰的恒定区(例如添加、缺失和/或取代)。
[0342]
在ig多肽的背景下，术语“恒定区”为本领域所熟知，并且是指ig重链或ig轻链的c端区域。ig重链恒定区包括ch1、ch2和ch3结构域(和ch4结构域，其中重链为μ或ε重链)。在天然ig重链中，ch1、ch2、ch3(和ch4，如存在)结构域紧跟在(c端到)重链可变区(vh)之后开始，每个结构域的长度从约100个氨基酸到约130个氨基酸。在天然ig轻链中，恒定区紧跟在(c端到)轻链可变区(v
l
)之后开始，每个结构域的长度从约100个氨基酸到约120个氨基酸。
[0343]
在本发明中，术语“cdr”或“互补决定区”是指在重链和轻链多肽可变区域内发现的非连续抗原结合位点。在《生物化学杂志》(kabat等人)252:6609-6616(1977)；“具有免疫学重要性的蛋白序列”(1991)(kabat等人，美国卫生与人类服务部)；《生物化学杂志》
(chothia等人)196:901-917(1987)；以及《分子生物学杂志》(maccallum等人)262:732-745(1996)中描述了cdr，其中定义包括相互比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而，应用任一定义来指代抗体或移植抗体或其变体的cdr均在本发明定义和使用的术语范围内。下表1列出了包含上述各参考文献所定义的cdr的氨基酸残基作为比较。
[0344]
表1：cdr定义
[0345] kabat1chothia2maccallum
3vh cdr131-3526-3230-35v
h cdr250-6553-5547-58v
h cdr395-10296-10193-101v
l cdr124-3426-3230-36v
l cdr250-5650-5246-55v
l cdr389-9791-9689-96
[0346]1残基编号遵循kabat等人的命名法，同上。
[0347]2残基编号遵循chothia等人的命名法，同上。
[0348]3残基编号遵循maccallum等人的命名法，同上。
[0349]
多肽、肽或蛋白的氨基酸序列所用的“遗传编码”是指氨基酸序列由能够通过编码氨基酸序列的核酸转录和翻译产生的氨基酸残基组成，其中，转录和/或翻译可能发生在细胞或无细胞体外转录/翻译系统中。
[0350]
术语“控制序列”是指在特定的表达系统(例如哺乳动物细胞、细菌细胞、无细胞合成等)中，能够促进可操纵连接的编码序列表达的dna序列。例如，适用于原核生物系统的控制序列包括启动子、可选操纵序列和核糖体结合位点。真核细胞系统可以利用启动子、多聚腺苷酸化信号和增强子。
[0351]
当核酸与另一个核酸序列形成官能关系时，此核酸是“可操纵连接”。例如，如果表达为参与多肽分泌的前蛋白，则前序列或分泌前导的dna与多肽的dna可操纵连接；如果影响序列的转录，则启动子或增强子与编码序列可操纵连接；或者如果核糖体结合位点的位置可以促进翻译的起始，则此位点与编码序列可操纵连接。一般来说，“可操纵连接”是指被连接的dna序列是连续的，而且在分泌前导的情况下是连续的并位于阅读框内。连接通过连接反应或扩增反应完成。根据常规做法，合成的寡核苷酸接合体或连接子可用于连接序列。
[0352]
在本发明中，术语“表达盒”是指可以插入核酸中的核酸片段，通常是dna(例如，通过使用与连接到目标构建体相容的限制位点，或通过同源重组到目标构建体或宿主细胞基因组)。一般而言，核酸片段包含编码目标多肽的多核苷酸，并且表达盒和限制位点的设计可以方便表达盒插入到用于转录和翻译的适当阅读框中。表达盒还可包含促进在宿主细胞(例如哺乳动物宿主细胞)中编码目标多肽的多核苷酸表达的元件。这些元件包括但不限于：启动子、最小启动子、增强子、应答元件、终止子序列、多聚腺苷酸化序列等。
[0353]
在本发明中，术语“分离”是指在一个与化合物自然发生环境不同的环境中的目标化合物。“分离”是指在样品中纳入化合物，这些样品中基本上富集了目标化合物和/或目标化合物在样品中部分或基本纯化。
[0354]
在本发明中，术语“基本纯化”是指从其自然环境中去除并且与其天然相关的其他成分至少60％游离、至少75％游离、至少80％游离、至少85％游离、至少90％游离、至少95％
游离、至少98％游离或超过98％游离的化合物。
[0355]
术语“生理条件”是指包括那些与活细胞相容的条件，例如，与活细胞相容的温度、ph值、盐度等主要水性条件。
[0356]“反应配偶体”是指与另一个反应配偶体发生特异性反应产生反应产物的分子或分子基团。示例性反应配偶体包括硫酸酯酶基序的半胱氨酸或丝氨酸以及甲酰甘氨酸生成酶(fge)，它们反应形成转化的醛标记的反应产物，其中含有甲酰甘氨酸(fgly)代替基序中的半胱氨酸或丝氨酸。其他示例性反应配偶体包括转化的醛标记(例如反应性醛基)的fgly残基的醛和“醛反应的反应配偶体”，其中包含醛反应基和目标基团，并反应形成修饰的醛标记多肽的反应产物，所述多肽具有通过修饰fgly残基与修饰多肽偶联的目标基团。
[0357]“n端”是指具有游离氨基的多肽的末端氨基酸残基，非n端氨基酸残基中的氨基通常形成多肽共价主链的一部分。
[0358]“c端”是指具有游离羧基的多肽的末端氨基酸残基，非c端氨基酸残基中的羧基通常形成多肽共价主链的一部分。
[0359]
多肽或多肽氨基酸序列所用的“内部位点”是指不在n端或c端的多肽区。
[0360]
在进一步描述本发明之前，应理解的是，本发明不限于描述的特定实施例，因为这些实施例可能会有所不同。还应理解的是，本发明使用的术语仅用于描述特定实施例，而非进行限制，因为本发明的范围仅由所附权利要求进行限制。
[0361]
在提供数值范围的情况下，应理解的是，除非上下文另有明确规定，否则本发明包括此范围上限和下限之间的每个干预值(近似到下限的十分之一)以及此规定范围内的任何其他规定或干预值。这些较小范围的上限和下限可独立包括在较小范围内，并且也包括在本发明内，但受规定范围内任何具体排除限制的限制。如果规定范围包括一个或两个限制，本发明还包括排除这些任一或两个限制的范围。
[0362]
应当理解的是，为了清楚起见，还可在单个实施例中组合提供在单独实施例的背景中描述的本发明的某些特征。相反，为了简洁起见，还可单独提供或以任何适当的子组合提供在单个实施例背景中描述的本发明的各种特征。本发明明确包括和公开了与本发明有关的实施例的所有组合，就像每个组合均单独、明确公开一样，只要此类组合包括的主题是稳定化合物的化合物(即可以制备、分离、表征和检测生物活性的化合物)。此外，本发明也明确包括和公开了各种实施例的所有子组合及其元件(例如，描述此类变量的实施例中列出的化学基团的元件)，就像每个此类子组合均单独、明确公开一样。
[0363]
除非另有说明，否则本发明所用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域普通技术人员公知的相同含义。虽然在本发明的实践或测试中也可使用与本发明所述方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但优选方法和材料描述如下。本发明提及的所有出版物通过引用成为本发明的一部分，以公开和描述与引用的出版物相关的方法和/或材料。
[0364]
值得注意的是，在本发明和所附权利要求中，除非内容另有明确说明，否则单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”也包括复数指称对象。还应注意，在起草权利要求时可以排除任何可选要素。因此，本声明旨在作为使用如“仅”、“唯一”等与权利要求要素叙述有关的排他性术语或使用“否定”限制的前提依据。
[0365]
应当理解的是，为了清楚起见，还可在单个实施例中组合提供在单独实施例的背景中描述的本发明的某些特征。相反，为了简洁起见，还可单独提供或以任何适当的子组合
提供在单个实施例的背景中描述的本发明的各种特征。
[0366]
本发明所讨论的出版物仅供在本发明申请提交日期之前公开之用。本发明的任何内容均不应解释为承认由于先前的发明，本发明无权先于此出版物发表。此外，提供的出版日期可能与需要单独确认的实际出版日期不同。
具体实施方式
[0367]
本发明提供了抗cd37抗体-美登素偶联物结构。发明还包括此类偶联物的生产方法以及此类偶联物的使用方法。下文对每个实施例进行了更详细的描述。
[0368]
抗体-药物偶联物
[0369]
本发明提供了偶联物，例如抗体-药物偶联物。“偶联物”是指第一基团(例如抗体)与第二基团(例如药物)稳定结合。例如，美登素偶联物包括与另一基团(例如抗体)稳定结合的美登素(例如美登素活性剂基团)。“稳定结合”是指在标准条件下基团与另一基团或结构相结合。在某些实施例中，第一和第二基团通过一个或多个共价键相互结合。
[0370]
在某些实施例中，所述偶联物为多肽偶联物，包括与第二基团偶联的多肽。在某些实施例中，与多肽偶联的基团可以是各种目标基团中的任何一种，包括但不限于可检测标记、药物、水溶性聚合物或用于将多肽固定到膜或表面上的基团。在某些实施例中，所述偶联物为美登素偶联物，其中多肽与美登素或美登素活性剂基团偶联。“美登素”、“美登素基团”、“美登素活性剂基团”和“美登素类化合物”是指美登素和类似物及其衍生物，以及药物活性美登素基团和/或其部分。与多肽偶联的美登素可以是各种美登素类化合物基团中的任何一种，包括但不限于本发明所述的美登素和类似物及其衍生物。
[0371]
目标基团可以在多肽的任何所需位点上与多肽偶联。因此，本发明提供了在多肽c端处或附近位置偶联基团的修饰多肽。其他示例包括在多肽n端处或附近位置偶联基团的修饰多肽。示例还包括在多肽c端和n端之间位置偶联基团(例如，在多肽内部位点)的修饰多肽。当修饰多肽与两个或以上基团偶联时，也可能存在上述组合。
[0372]
在某些实施例中，本发明的偶联物包括在氨基酸残基α-碳上与多肽的氨基酸残基偶联的美登素。换言之，美登素偶联物包括多肽，其中多肽中一个或多个氨基酸残基的侧链经过修饰附着在美登素上(例如通过本发明所述的连接子附着在美登素上)。例如，美登素偶联物包括多肽，其中多肽中一个或多个氨基酸残基α-碳经过修饰附着在美登素上(例如通过本发明所述的连接子附着在美登素上)。
[0373]
本发明的实施例包括偶联物，其中多肽与一个或多个基团偶联，例如2个基团、3个基团、4个基团、5个基团、6个基团、7个基团、8个基团、9个基团或10个或以上基团。所述基团可以在多肽的一个或多个位点上与多肽偶联。例如，一个或多个基团可与多肽的单个氨基酸残基偶联。在某些情况下，一个基团与多肽的氨基酸残基偶联。在其他实施例中，两个基团可与多肽的相同氨基酸残基偶联。在其他实施例中，第一基团与多肽的第一氨基酸残基偶联，第二基团与多肽的第二氨基酸残基偶联。例如，当多肽在第一氨基酸残基上与第一基团偶联并且在第二氨基酸残基上与两个其他基团偶联时，则可能存在上述组合。也可能存在其他组合，包括但不限于在第一氨基酸残基上与第一和第二基团偶联以及在第二氨基酸残基上与第三和第四基团等。
[0374]
与一个或多个基团偶联的多肽的一个或多个氨基酸残基可以是天然氨基酸、非天
然氨基酸或其组合。例如，所述偶联物可包括与多肽的天然氨基酸残基偶联的基团。在其他情况下，所述偶联物可包括与多肽的非天然氨基酸残基偶联的基团。一个或多个基团可在本发明所述的单个天然或非天然氨基酸残基上与多肽偶联。多肽中一个或多个天然或非天然氨基酸残基可与本发明所述的基团偶联。例如，多肽中两个(或以上)氨基酸残基(例如天然或非天然氨基酸残基)可各自与一个或两个基团偶联，从而修饰多肽中的多个位点。
[0375]
在本发明中，多肽可与一个或多个基团偶联。在某些实施例中，目标基团为化学实体，例如药物或可检测标记。例如，药物(例如美登素)可与多肽偶联，或在其他实施例中，可检测标记可与多肽偶联。因此，例如，本发明的实施例包括但不限于以下内容：多肽和药物的偶联物；多肽和可检测标记的偶联物；两个或多个药物和多肽的偶联物；两个或多个可检测标记和多肽的偶联物等。
[0376]
在某些实施例中，所述多肽和目标基团通过偶联基团偶联。例如，所述多肽和目标基团可与偶联基团各自结合(例如共价结合)，从而通过偶联基团将多肽与目标基团(例如药物，如美登素)间接结合。在某些情况下，所述偶联基团包括肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基化合物，或肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基化合物的衍生物。例如，通过肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基偶联基团将目标基团(例如美登素)与多肽偶联的基本方案见下文基本反应方案。肼基-吲哚基和肼基-吡咯并-吡啶基偶联基团在本发明中也分别指肼基-异-皮克特-施彭格勒(hips)偶联基团和氮杂-肼基-异-皮克特-施彭格勒(azahips)偶联基团。
[0377][0378]
在上述反应方案中，r为与多肽偶联的目标基团(例如美登素)。如上述反应方案所示，包括2-甲酰甘氨酸残基(fgly)的多肽与经过修饰包括偶联基团(例如肼基-吲哚基和肼基-吡咯并-吡啶基偶联基团)的药物(例如美登素)反应，产生附着在偶联基团上的多肽偶联物，从而通过偶联基团将美登素附着在多肽上。
[0379]
在本发明中，所述基团可以是各种基团中的任何一种，包括但不限于化学实体，例如可检测标记或药物(例如美登素类化合物)。r’和r”为分别独立的任何理想取代基，包括但不限于氢、氨基酸侧链基团、烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、烷氧基、取代烷氧基、氨基、取代氨基、羧基、羧基酯、酰基、酸氧基、酰氨基、氨酰基、烷基酰胺、取代烷基酰胺、磺酰基、硫代烷氧基、取代硫代烷氧基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、环烷基、取代环烷基、杂环基和取代杂环基。z可以是cr
11
、nr
12
、n、o或s，其中，r
11
和r
12
分别独立选自上文对r’和r”描述的任何取代基。
[0380]
也可以是其他肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基偶联基团，如本发明所述的偶联物和化合物所示。例如，肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基偶联基团可经过修饰附着在(例如共价附着)连接子上。因此，本发明的实施例包括通过连接子附着在药物(例如美登素)上的肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基偶联基团。本发明详述了可将肼基-吲哚基或
肼基-吡咯并-吡啶基偶联基团与药物(例如美登素)偶联的连接子的各种实施例。
[0381]
在某些实施例中，所述多肽可与目标基团偶联，其中，在与目标基团偶联之前对所述多肽进行修饰。多肽的修饰可产生含有一个或多个适用于与目标基团偶联的反应基。在某些情况下，所述多肽可在一个或多个氨基酸残基上进行修饰，以提供一个或多个适用于与目标基团偶联的反应基(例如包括偶联基团的基团，如上文所述的肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基偶联基团)。例如，多肽可经过修饰包括反应醛基(例如反应醛)。反应醛可包括在“醛标记(aldehyde tag)”或“醛标记(ald-tag)”中，在本发明中是指源自自硫酸酯酶基序(例如l(c/s)tpsr)的氨基酸序列，所述硫酸酯酶基序已通过甲酰甘氨酸生成酶(fge)的作用转化，包含2-甲酰甘氨酸残基(在本发明称为“fgly”)。fge产生的fgly残基可称为“甲酰甘氨酸”。换句话说，本发明使用的术语“醛标记”是指包括“转化的”硫酸酯酶基序的氨基酸序列(即，半胱氨酸或丝氨酸残基通过fge的作用已经转化为fgly的硫酸酯酶基序，例如l(fgly)tpsr)。转化的硫酸酯酶基序可源自包括“未转化的”硫酸酯酶基序的氨基酸序列(即，通过fge半胱氨酸或丝氨酸残基未转化为fgly但能够转化的硫酸酯酶基序，例如序列为l(c/s)tpsr的未转化硫酸酯酶基序)。在甲酰甘氨酸生成酶(fge)对硫酸酯酶基序的作用中使用的“转化”是指硫酸酯酶基序中的半胱氨酸或丝氨酸残基经过生化修饰变为甲酰甘氨酸(fgly)残基(例如，cys变为fgly，或ser变为fgly)。第7,985,783号美国专利和第8,729,232号美国专利描述了醛标记的其他方面及其在位点特异性蛋白修饰中的用途，其中每项专利的公开内容均通过引用成为本发明的一部分。
[0382]
在某些情况下，含有fgly残基的修饰多肽可通过fgly与化合物的反应与目标基团偶联(如上所述，含有肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基偶联基团的化合物)。例如，含有fgly的多肽可在适合提供药物与多肽偶联的条件下，与含有反应配偶体的药物接触。在某些情况下，含有反应配偶体的药物可包括上文所述的肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基偶联基团。例如，美登素可经过修饰包括肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基偶联基团。在某些情况下，本发明详细描述了美登素附着在肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基上，例如通过连接子共价附着在肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基上。
[0383]
在某些实施例中，本发明的偶联物包括具有至少一个修饰氨基酸残基的多肽(例如抗体，如抗cd37抗体)。多肽的修饰氨基酸残基可与含有上述肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基偶联基团的药物(例如美登素)偶联。在某些实施例中，所述多肽(例如抗cd37抗体)的修饰氨基酸残基可源自已转化为上述fgly残基的半胱氨酸或丝氨酸残基。在某些实施例中，所述fgly残基与含有上述肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基偶联基团的药物偶联以提供本发明的偶联物，其中，所述药物通过肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基偶联基团与多肽偶联。在本发明中，术语fgly’是指与目标基团(例如药物，如美登素)偶联的多肽(例如抗cd37抗体)的修饰氨基酸残基。
[0384]
在某些实施例中，所述偶联物包括本发明所述式(i)的至少一个修饰氨基酸残基。例如，所述偶联物包括至少一个具有式(i)侧链的修饰氨基酸残基：
[0385][0386]
其中
[0387]
z为cr4或n；
[0388]
r1选自氢、烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、环烷基、取代环烷基、杂环基和取代杂环基；
[0389]
r2和r3分别独立选自氢、烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、烷氧基、取代烷氧基、氨基、取代氨基、羧基、羧基酯、酰基、酸氧基、酰氨基、氨酰基、烷基酰胺、取代烷基酰胺、磺酰基、硫代烷氧基、取代硫代烷氧基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、环烷基、取代环烷基、杂环基和取代杂环基，或者r2和r3可选环形连接形成五元或六元杂环基；
[0390]
每个r4独立选自氢、卤素、烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、烷氧基、取代烷氧基、氨基、取代氨基、羧基、羧基酯、酰基、酸氧基、酰氨基、氨酰基、烷基酰胺、取代烷基酰胺、磺酰基、硫代烷氧基、取代硫代烷氧基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、环烷基、取代环烷基、杂环基和取代杂环基；
[0391]
l是包含-(t
1-v1)
a-(t
2-v2)
b-(t
3-v3)
c-(t
4-v4)
d-的连接子，其中a、b、c和d为分别独立的0或1，其中a、b、c和d之和为1-4；
[0392]
t1、t2、t3和t4分别独立选自(c
1-c
12
)烷基、取代(c
1-c
12
)烷基、(eda)w、(peg)n、(aa)
p
、-(cr
13
oh)
h-、哌啶-4-氨基(4ap)和缩醛基、肼、二硫化物和酯，其中，eda为乙二胺基团，peg为聚乙二醇或修饰聚乙二醇，aa为氨基酸残基，其中，w为1-20整数，n为1-30整数，p为1-20整数，h为1-12整数；
[0393]v1
、v2、v3和v4分别独立选自由共价键、-co-、-nr
15-、-nr
15
(ch2)
q-、-nr
15
(c6h4)-、-conr
15-、-nr
15
co-、-c(o)o-、-oc(o)-、-o-、-s-、-s(o)-、-so
2-、-so2nr
15-、-nr
15
so
2-和-p(o)oh-构成的基团，其中，q为1-6整数；
[0394]
每个r
13
独立选自氢、烷基、取代烷基、芳基和取代芳基；
[0395]
每个r
15
独立选自氢、烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、羧基、羧基酯、酰基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、环烷基、取代环烷基、杂环基和取代杂环基；
[0396]
w1为美登素类化合物；以及
[0397]
w2为抗cd37抗体。
[0398]
在某些实施例中，z为cr4或n，在某些实施例中，z为cr4。在某些实施例中，z为n。
[0399]
在某些实施例中，r1选自氢、烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、环烷基、取代环烷基、杂环基和取代杂环基。在某些实施例中，r1为氢。在某些实施例中，r1为烷基或取代烷基，例如c
1-6
烷基或c
1-6
取代烷基，或者c
1-4
烷基或c
1-4
取代烷基，或者c
1-3
烷基或c
1-3
取代烷基。在某些实施例中，r1为甲基。在某些实施例中，r1为烯基或取代烯基，例如c
2-6
烯基或c
2-6
取代烯基，或者c
2-4
烯基或c
2-4
取代烯基，或者c
2-3
烯基或c
2-3
取代烯基。在某些实施例中，r1为炔基或取代炔基，例如c
2-6
炔基或c
2-6
取代
炔基，或者c
2-4
炔基或c
2-4
取代炔基，或者c
2-3
炔基或c
2-3
取代炔基。在某些实施例中，r1为芳基或取代芳基，例如c
5-8
芳基或c
5-8
取代芳基，例如c5芳基或c5取代芳基，或者c6芳基或c6取代芳基。在某些实施例中，r1为杂芳基或取代杂芳基，例如c
5-8
杂芳基或c
5-8
取代杂芳基，例如c5杂芳基或c5取代杂芳基，或者c6杂芳基或c6取代杂芳基。在某些实施例中，r1为环烷基或取代环烷基，例如c
3-8
环烷基或c
3-8
取代环烷基，例如c
3-6
环烷基或c
3-6
取代环烷基，或者c
3-5
环烷基或c
3-5
取代环烷基。在某些实施例中，r1为杂环基或取代杂环基，例如c
3-8
杂环基或c
3-8
取代杂环基，例如c
3-6
杂环基或c
3-6
取代杂环基，或者c
3-5
杂环基或c
3-5
取代杂环基。
[0400]
在某些实施例中，r2和r3分别独立选自氢、烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、烷氧基、取代烷氧基、氨基、取代氨基、羧基、羧基酯、酰基、酸氧基、酰氨基、氨酰基、烷基酰胺、取代烷基酰胺、磺酰基、硫代烷氧基、取代硫代烷氧基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、环烷基、取代环烷基、杂环基和取代杂环基，或者r2和r3可选环形连接形成五元或六元杂环基。
[0401]
在某些实施例中，r2选自氢、烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、烷氧基、取代烷氧基、氨基、取代氨基、羧基、羧基酯、酰基、酸氧基、酰氨基、氨酰基、烷基酰胺、取代烷基酰胺、磺酰基、硫代烷氧基、取代硫代烷氧基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、环烷基、取代环烷基、杂环基和取代杂环基。在某些实施例中，r2为氢。在某些实施例中，r2为烷基或取代烷基，例如c
1-6
烷基或c
1-6
取代烷基，或者c
1-4
烷基或c
1-4
取代烷基，或者c
1-3
烷基或c
1-3
取代烷基。在某些实施例中，r2为甲基。在某些实施例中，r2为烯基或取代烯基，例如c
2-6
烯基或c
2-6
取代烯基，或者c
2-4
烯基或c
2-4
取代烯基，或者c
2-3
烯基或c
2-3
取代烯基。在某些实施例中，r2为炔基或取代炔基。在某些实施例中，r2为烷氧基或取代烷氧基。在某些实施例中，r2为氨基或取代氨基。在某些实施例中，r2为羧基或羧基酯。在某些实施例中，r2为酰基或酰氧基。在某些实施例中，r2为酰氨基或氨酰基。在某些实施例中，r2为烷基酰胺或取代烷基酰胺。在某些实施例中，r2为磺酰基。在某些实施例中，r2为硫代烷氧基或取代硫代烷氧基。在某些实施例中，r2为芳基或取代芳基，例如c
5-8
芳基或c
5-8
取代芳基，例如c5芳基或c5取代芳基，或者c6芳基或c6取代芳基。在某些实施例中，r2为杂芳基或取代杂芳基，例如c
5-8
杂芳基或c
5-8
取代杂芳基，例如c5杂芳基或c5取代杂芳基，或者c6杂芳基或c6取代杂芳基。在某些实施例中，r2为环烷基或取代环烷基，例如c
3-8
环烷基或c
3-8
取代环烷基，例如c
3-6
环烷基或c
3-6
取代环烷基，或者c
3-5
环烷基或c
3-5
取代环烷基。在某些实施例中，r2为杂环基或取代杂环基，例如c
3-6
杂环基或c
3-6
取代杂环基，或者c
3-5
杂环基或c
3-5
取代杂环基。
[0402]
在某些实施例中，r3选自氢、烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、烷氧基、取代烷氧基、氨基、取代氨基、羧基、羧基酯、酰基、酸氧基、酰氨基、氨酰基、烷基酰胺、取代烷基酰胺、磺酰基、硫代烷氧基、取代硫代烷氧基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、环烷基、取代环烷基、杂环基和取代杂环基。在某些实施例中，r3为氢。在某些实施例中，r3为烷基或取代烷基，例如c
1-6
烷基或c
1-6
取代烷基，或者c
1-4
烷基或c
1-4
取代烷基，或者c
1-3
烷基或c
1-3
取代烷基。在某些实施例中，r3为甲基。在某些实施例中，r3为烯基或取代烯基，例如c
2-6
烯基或c
2-6
取代烯基，或者c
2-4
烯基或c
2-4
取代烯基，或者c
2-3
烯基或c
2-3
取代烯基。在某些实施例中，r3为炔基或取代炔基。在某些实施例中，r3为烷氧基或取代烷氧基。在某些实施例中，r3为氨基或取代氨基。在某些实施例中，r3为羧基或羧基酯。在某些实施例中，r3为酰基或酰氧基。在某些实施例中，r3为酰氨基或氨酰基。在某些实施例中，r3为烷基酰胺或取代
烷基酰胺。在某些实施例中，r3为磺酰基。在某些实施例中，r3为硫代烷氧基或取代硫代烷氧基。在某些实施例中，r3为芳基或取代芳基，例如c
5-8
芳基或c
5-8
取代芳基，例如c5芳基或c5取代芳基，或者c6芳基或c6取代芳基。在某些实施例中，r3为杂芳基或取代杂芳基，例如c
5-8
杂芳基或c
5-8
取代杂芳基，例如c5杂芳基或c5取代杂芳基，或者c6杂芳基或c6取代杂芳基。在某些实施例中，r3为环烷基或取代环烷基，例如c
3-8
环烷基或c
3-8
取代环烷基，例如c
3-6
环烷基或c
3-6
取代环烷基，或者c
3-5
环烷基或c
3-5
取代环烷基。在某些实施例中，r3为杂环基或取代杂环基，例如c
3-8
杂环基或c
3-8
取代杂环基，例如c
3-6
杂环基或c
3-6
取代杂环基，或者c
3-5
杂环基或c
3-5
取代杂环基。
[0403]
在某些实施例中，r2和r3可选环形连接形成五元或六元杂环基。在某些实施例中，r2和r3可环形连接形成五元或六元杂环基。在某些实施例中，r2和r3可环形连接形成五元杂环基。在某些实施例中，r2和r3可环形连接形成六元杂环基。
[0404]
在某些实施例中，每个r4独立选自氢、卤素、烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、烷氧基、取代烷氧基、氨基、取代氨基、羧基、羧基酯、酰基、酸氧基、酰氨基、氨酰基、烷基酰胺、取代烷基酰胺、磺酰基、硫代烷氧基、取代硫代烷氧基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、环烷基、取代环烷基、杂环基和取代杂环基。
[0405]
下文详述了每个r4的各种可能性。在某些实施例中，r4为氢。在某些实施例中，每个r4为氢。在某些实施例中，r4为卤素，例如f、cl、br或i。在某些实施例中，r4为f。在某些实施例中，r4为cl。在某些实施例中，r4为br。在某些实施例中，r4为i。在某些实施例中，r4为烷基或取代烷基，例如c
1-6
烷基或c
1-6
取代烷基，或者c
1-4
烷基或c
1-4
取代烷基，或者c
1-3
烷基或c
1-3
取代烷基。在某些实施例中，r4为甲基。在某些实施例中，r4为烯基或取代烯基，例如c
2-6
烯基或c
2-6
取代烯基，或者c
2-4
烯基或c
2-4
取代烯基，或者c
2-3
烯基或c
2-3
取代烯基。在某些实施例中，r4为炔基或取代炔基。在某些实施例中，r4为烷氧基或取代烷氧基。在某些实施例中，r4为氨基或取代氨基。在某些实施例中，r4为羧基或羧基酯。在某些实施例中，r4为酰基或酰氧基。在某些实施例中，r4为酰氨基或氨酰基。在某些实施例中，r4为烷基酰胺或取代烷基酰胺。在某些实施例中，r4为磺酰基。在某些实施例中，r4为硫代烷氧基或取代硫代烷氧基。在某些实施例中，r4为芳基或取代芳基，例如c
5-8
芳基或c
5-8
取代芳基，例如c5芳基或c5取代芳基，或者c6芳基或c6取代芳基(例如，苯基或取代苯基)。在某些实施例中，r4为杂芳基或取代杂芳基，例如c
5-8
杂芳基或c
5-8
取代杂芳基，例如c5杂芳基或c5取代杂芳基，或者c6杂芳基或c6取代杂芳基。在某些实施例中，r4为环烷基或取代环烷基，例如c
3-8
环烷基或c
3-8
取代环烷基，例如c
3-6
环烷基或c
3-6
取代环烷基，或者c
3-5
环烷基或c
3-5
取代环烷基。在某些实施例中，r4为杂环基或取代杂环基，例如c
3-8
杂环基或c
3-8
取代杂环基，例如c
3-6
杂环基或c
3-6
取代杂环基，或者c
3-5
杂环基或c
3-5
取代杂环基。
[0406]
在某些实施例中，w1为美登素类化合物。本发明对美登素类化合物作出了进一步描述。
[0407]
在某些实施例中，w2为抗cd37抗体。本发明对用于受试偶联物的抗cd37抗体作出了进一步描述。
[0408]
在某些实施例中，式(i)的化合物包括连接子l。所述连接子可用于将偶联基团与一个或多个目标基团和/或一个或多个多肽结合。在某些实施例中，所述连接子将偶联基团与多肽或化学实体结合。所述连接子可以在任何适当位置与偶联基团(如本发明所述)结合
(例如共价结合)。例如，连接子将肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基偶偶联基团附着在药物(例如美登素)上。可采用肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基偶联基团将连接子(以及药物，例如美登素)偶联到多肽(例如抗cd37抗体)上。例如，可采用偶联基团将连接子(以及药物，例如美登素)与多肽的修饰氨基酸残基(例如抗cd37抗体的fgly残基)偶联，。
[0409]
在某些实施例中，l将偶联基团附着到w1上，因此，偶联基团通过连接子l与w1间接结合。如上所述，w1为美登素类化合物，因此，l将偶联基团附着到美登素类化合物上，例如，偶联基团通过连接子l与美登素类化合物间接结合。
[0410]
在受试偶联物和化合物中可采用任何适当的连接子。在某些实施例中，l包括选自以下几项的基团：烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、烷氧基、取代烷氧基、氨基、取代氨基、羧基、羧基酯、酰氨基、烷基酰胺、取代烷基酰胺、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、环烷基、取代环烷基、杂环基和取代杂环基。在某些实施例中，l包括烷基或取代烷基。在某些实施例中，l包括烯基或取代烯基。在某些实施例中，l包括炔基或取代炔基。在某些实施例中，l包括烷氧基或取代烷氧基。在某些实施例中，l包括氨基或取代氨基。在某些实施例中，l包括羧基或羧基酯。在某些实施例中，l包括酰氨基。在某些实施例中，l包括烷基酰胺或取代烷基酰胺。在某些实施例中，l包括芳基或取代芳基。在某些实施例中，l包括杂芳基或取代杂芳基。在某些实施例中，l包括环烷基或取代环烷基。在某些实施例中，l包括杂环基或取代杂环基。
[0411]
在某些实施例中，l包括聚合物。例如，聚合物可包括聚二醇及其衍生物，包括聚乙二醇、甲氧基聚乙二醇、聚乙二醇均聚物、聚丙二醇均聚物、乙二醇与丙二醇的共聚物(例如，其中均聚物和共聚物未取代或在一端由烷基取代)、聚乙烯醇、聚乙烯基乙醚、聚乙烯吡咯烷酮及其组合等。在某些实施例中，所述聚合物为聚二醇。在某些实施例中，所述聚合物为聚乙二醇。也可以使用其他连接子，如下文更详细描述的偶联物和化合物中所示。
[0412]
在某些实施例中，l是由公式-(l1)
a-(l2)
b-(l3)
c-(l4)
d-表示的一个连接子，其中，l1、l2、l3和l4为分别独立的连接子单位，a、b、c和d为分别独立的0或1，其中，a、b、c和d之和为1-4。
[0413]
在某些实施例中，a、b、c和d之和为1。在某些实施例中，a、b、c和d之和为2。在某些实施例中，a、b、c和d之和为3。在某些实施例中，a、b、c和d之和为4。在某些实施例中，a、b、c和d各为1。在某些实施例中，a、b和c各为1，d为0。在某些实施例中，a和b各为1，c和d各为0。在某些实施例中，a为1，b、c和d各为0。
[0414]
在某些实施例中，l1附着在肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基偶联基团(例如，如上式(i)所示)。在某些实施例中，l2(如存在)附着在w1上。在某些实施例中，l3(如存在)附着在w1上。在某些实施例中，l4(如存在)附着在w1上。
[0415]
在受试连接子中可采用任何适当的连接子单位。目标连接子单位包括但不限于聚合物单位，例如，聚乙二醇、聚乙烯和聚丙烯酸酯、氨基酸残基、基于碳水化合物的聚合物或碳水化合物残基及其衍生物、多核苷酸、烷基、芳基、杂环基、其组合及其取代形式。在某些实施例中，每个l1、l2、l3和l4(如存在)包括独立选自聚乙二醇、修饰聚乙二醇、氨基酸残基、烷基、取代烷基、芳基、取代方剂和二胺的一个或多个基团(例如，包含亚烃基二胺的一个连接基团)。
[0416]
在某些实施例中，l1(如存在)包括聚乙二醇、修饰聚乙二醇、氨基酸残基、烷基、取
代烷基、芳基、取代芳基或二胺。在某些实施例中，l1包括聚乙二醇。在某些实施例中，l1包括修饰聚乙二醇。在某些实施例中，l1包括氨基酸残基。在某些实施例中，l1包含烷基或取代烷基。在某些实施例中，l1包括芳基或取代芳基。在某些实施例中，l1包括二胺(例如，包含亚烃基二胺的连接子)。
[0417]
在某些实施例中，l2(如存在)包括聚乙二醇、修饰聚乙二醇、氨基酸残基、烷基、取代烷基、芳基、取代芳基或二胺。在某些实施例中，l2包括聚乙二醇。在某些实施例中，l2包括修饰聚乙二醇。在某些实施例中，l2包括氨基酸残基。在某些实施例中，l2包括烷基或取代烷基。在某些实施例中，l2包括芳基或取代芳基。在某些实施例中，l2包括二胺(例如，包含亚烃基二胺的连接子)。
[0418]
在某些实施例中，l3(如存在)包括聚乙二醇、修饰聚乙二醇、氨基酸残基、烷基、取代烷基、芳基、取代芳基或二胺。在某些实施例中，l3包括聚乙二醇。在某些实施例中，l3包含修饰聚乙二醇。在某些实施例中，l3包括氨基酸残基。在某些实施例中，l3包括烷基或取代烷基。在某些实施例中，l3包括芳基或取代芳基。在某些实施例中，l3包括二胺(例如，包含亚烃基二胺的连接子)。
[0419]
在某些实施例中，l4(如存在)包括聚乙二醇、修饰聚乙二醇、氨基酸残基、烷基、取代烷基、芳基、取代芳基或二胺。在某些实施例中，l4包括聚乙二醇。在某些实施例中，l4包括修饰聚乙二醇。在某些实施例中，l4包括氨基酸残基。在某些实施例中，l4包括烷基或取代烷基。在某些实施例中，l4包括芳基或取代芳基。在某些实施例中，l4包括二胺(例如，包含亚烃基二胺的连接子)。
[0420]
在某些实施例中，l为包含-(l1)
a-(l2)
b-(l3)
c-(l4)
d-的连接子，其中：
[0421]-(l1)
a-为-(t
1-v1)
a-；
[0422]-(l2)
b-为-(t
2-v2)
b-；
[0423]-(l3)
c-为-(t
3-v3)
c-；以及
[0424]-(l4)
d-为-(t
4-v4)
d-，
[0425]
其中，t1、t2、t3和t4(如存在)为系链基团；
[0426]v1
、v2、v3和v4(如存在)为共价键或连接官能团；以及
[0427]
a、b、c和d为分别独立的0或1，其中，a、b、c和d之和为1-4。
[0428]
如上所述，在某些实施例中，l1附着在肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基偶联基团(例如，如上式(i)所示)上。因此，在某些实施例中，t1附着在肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基偶联基团(例如，如上式(i)所示)上。在某些实施例中，v1附着在w1(美登素类化合物)上。在某些实施例中，l2(如存在)附着在w1上。因此，在某些实施例中，t2(如存在)附着在w1上，或者v2(如存在)附着在w1上。在某些实施例中，l3(如存在)附着在w1上。因此，在某些实施例中，t3(如存在)附着在w1上，或者v3(如存在)附着在w1上。在某些实施例中，l4(如存在)附着在w1上。因此，在某些实施例中，t4(如存在)附着在w1上，或者v4(如存在)附着在w1上。
[0429]
对于系链基团t1、t2、t3和t4，在受试连接子中可采用任何适当的系链基团。在某些实施例中，t1、t2、t3和t4分别包括独立选自(c
1-c
12
)烷基、取代(c
1-c
12
)烷基、(eda)w、(peg)n、(aa)
p
、-(cr
13
oh)
h-、哌啶-4-氨基(4ap)和缩醛基、二硫化物、肼和酯的一个或多个基团，其中，w为1-20整数，n为1-30整数，p为1-20整数，h为1-12整数；
[0430]
在某些实施例中，当a、b、c和d之和为2且t
1-v1、t
2-v2、t
3-v3或t
4-v4中的一个为
(peg)
n-co时，则n不为6。例如，在某些情况下，所述连接子可具有以下结构：
[0431][0432]
其中，n不为6。
[0433]
在某些实施例中，当a、b、c和d之和为2且t
1-v1、t
2-v2、t
3-v3或t
4-v4中的一个为(c
1-c
12
)烷基-nr
15
时，则(c
1-c
12
)烷基不为c
5-烷基。例如，在某些情况下，所述连接子可具有以下结构：
[0434][0435]
其中，g不为4。
[0436]
在某些实施例中，所述系链基团(例如，t1、t2、t3和/或t4)包括(c
1-c
12
)烷基或取代(c
1-c
12
)烷基。在某些实施例中，(c
1-c
12
)烷基为包括1-12个碳原子的直链或支链烷基，例如1-10个碳原子、或1-8个碳原子、或1-6个碳原子、或1-5个碳原子、或1-4个碳原子或1-3个碳原子。在某些情况下，(c
1-c
12
)烷基可以是烷基或取代烷基，例如，c
1-c
12
烷基或c
1-c
10
烷基或c
1-c6烷基或c
1-c3烷基。在某些情况下，(c
1-c
12
)烷基为c
2-烷基。例如，(c
1-c
12
)烷基可能为亚烃基或取代亚烃基，例如，c
1-c
12
亚烃基或c
1-c
10
亚烃基或c
1-c6亚烃基或c
1-c3亚烃基。在某些情况下，(c
1-c
12
)烷基为c
2-亚烃基。
[0437]
在某些实施例中，取代(c
1-c
12
)烷基为包括1-12个碳原子的直链或支链取代烷基，例如1-10个碳原子、或1-8个碳原子、或1-6个碳原子、或1-5个碳原子、或1-4个碳原子或1-3个碳原子。在某些情况下，取代(c
1-c
12
)烷基可能为取代烷基，例如，取代c
1-c
12
烷基或取代c
1-c
10
烷基或取代c
1-c6烷基或取代c
1-c3烷基。在某些情况下，取代(c
1-c
12
)烷基为取代c
2-烷基。例如，取代(c
1-c
12
)烷基可能是取代亚烃基，例如，取代c
1-c
12
亚烃基或取代c
1-c
10
亚烃基或取代c
1-c6亚烃基或取代c
1-c3亚烃基。在某些情况下，取代(c
1-c
12
)烷基为取代c
2-亚烃基。
[0438]
在某些实施例中，所述系链基团(例如，t1、t2、t3和/或t4)包括乙二胺(eda)基团，例如，含有系链的eda。在某些实施例中，(eda)w包括一个或多个eda基团，例如，其中w为1-50整数，例如，1-40、1-30、1-20、1-12或1-6，例如1、2、3、4、5或6)。连接的乙二胺(eda)基团可选在一个或多个适当位置由任何适当的取代基取代，例如，烷基、取代烷基、酰基、取代酰基、芳基或取代芳基。在某些实施例中，所述eda基团由以下结构表示：
[0439][0440]
其中，y为1-6整数，r为0或1，每个r
12
独立选自氢、卤素、烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、烷氧基、取代烷氧基、氨基、取代氨基、羧基、羧基酯、酰基、酸氧基、酰氨基、氨酰基、烷基酰胺、取代烷基酰胺、磺酰基、硫代烷氧基、取代硫代烷氧基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、环烷基、取代环烷基、杂环基和取代杂环基。在某些实施例中，y为1、2、3、4、5或6。在某些实施例中，y为1，r为0。在某些实施例中，y为1，r为1。在某些实施例
中，y为2，r为0。在某些实施例中，y为2，r为1。在某些实施例中，每个r
12
独立选自氢、烷基、取代烷基、芳基和取代芳基。在某些实施例中，eda的任何两个相邻的r
12
基团可以环形连接，形成哌嗪基环。在某些实施例中，y为1，两个相邻的r
12
基团为烷基，环形连接形成哌嗪基环。在某些实施例中，y为1，相邻的r
12
基团选自氢、烷基(例如甲基)和取代烷基(例如，低级烷基-oh，如乙基-oh或丙基-oh)。
[0441]
在某些实施例中，所述系链基团包括4-氨基-哌啶(4ap)基团(在本发明中也称为哌啶-4-氨基，p4a)。4ap基团可选在一个或多个适当位置由任何适当的取代基取代，例如，烷基、取代烷基、聚乙二醇基团、酰基、取代酰基、芳基或取代芳基。在某些实施例中，所述4ap基团由以下结构表示：
[0442][0443]
其中，r
12
选自氢、烷基、取代烷基、聚乙二醇基团(例如，聚乙二醇或修饰聚乙二醇)、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、烷氧基、取代烷氧基、氨基、取代氨基、羧基、羧基酯、酰基、酸氧基、酰氨基、氨酰基、烷基酰胺、取代烷基酰胺、磺酰基、硫代烷氧基、取代硫代烷氧基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、环烷基、取代环烷基、杂环基和取代杂环基。在某些实施例中，r
12
为聚乙二醇基团。在某些实施例中，r
12
为羧基修饰聚乙二醇。
[0444]
在某些实施例中，r
12
包括由以下公式表示的聚乙二醇基团：(peg)k，可由以下结构表示：
[0445][0446]
其中，k为1-20整数，例如1-18、或1-16、或1-14、或1-12、或1-10、或1-8、或1-6、或1-4、或1或2，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在某些情况下，k为2。在某些实施例中，r
17
选自oh、cooh或coor，其中，r选自烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、环烷基、取代环烷基、杂环基和取代杂环基。在某些实施例中，r
17
为cooh。
[0447]
在某些实施例中，系链基团(例如，t1、t2、t3和/或t4)包括(peg)n，其中(peg)n为聚乙二醇或修饰聚乙二醇连接单位。在某些实施例中，(peg)n由以下结构表示：
[0448][0449]
其中，n为1-50整数，例如1-40、1-30、1-20、1-12或1-6，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在某些情况下，n为2。在某些情况下，n为3。在某些情况下，n为6。在某些情况下，n为12。
[0450]
在某些实施例中，系链基团(例如，t1、t2、t3和/或t4)包括(aa)
p
，其中aa为氨基酸残基。可使用任何适当的氨基酸。目标氨基酸包括但不限于l-和d-氨基酸、天然氨基酸，例如20种主要α氨基酸和β氨基酸中的任何一种，非天然氨基酸(例如氨基酸类似物)，例如非天然α氨基酸或非天然β氨基酸等。在某些实施例中，p为1-50整数，例如1-40、1-30、1-20、1-12或1-6，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在某些实施例中，p为1。在某些实施例中，p为2。
[0451]
在某些实施例中，系链基团(例如，t1、t2、t3和/或t4)包括由公式-(cr
13
oh)
h-表示的一个基团，其中，h为0或n为1-50整数，例如1-40、1-30、1-20、1-12或1-6，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。在某些实施例中，h为1。在某些实施例中，h为2。在某些实施例中，r
13
选自氢、烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、烷氧基、取代烷氧基、氨基、取代氨基、羧基、羧基酯、酰基、酸氧基、酰氨基、氨酰基、烷基酰胺、取代烷基酰胺、磺酰基、硫代烷氧基、取代硫代烷氧基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、环烷基、取代环烷基、杂环基和取代杂环基。在某些实施例中，r
13
为氢。在某些实施例中，r
13
为烷基或取代烷基，例如c
1-6
烷基或c
1-6
取代烷基，或者c
1-4
烷基或c
1-4
取代烷基，或者c
1-3
烷基或c
1-3
取代烷基。在某些实施例中，r
13
为烯基或取代烯基，例如c
2-6
烯基或c
2-6
取代烯基，或者c
2-4
烯基或c
2-4
取代烯基，或者c
2-3
烯基或c
2-3
取代烯基。在某些实施例中，r
13
为炔基或取代炔基。在某些实施例中，r
13
为烷氧基或取代烷氧基。在某些实施例中，r
13
为氨基或取代氨基。在某些实施例中，r
13
为羧基或羧基酯。在某些实施例中，r
13
为酰基或酰氧基。在某些实施例中，r
13
为酰氨基或氨酰基。在某些实施例中，r
13
为烷基酰胺或取代烷基酰胺。在某些实施例中，r
13
为磺酰基。在某些实施例中，r
13
为硫代烷氧基或取代硫代烷氧基。在某些实施例中，r
13
为芳基或取代芳基，例如c
5-8
芳基或c
5-8
取代芳基，例如c5芳基或c5取代芳基，或者c6芳基或c6取代芳基。在某些实施例中，r
13
为杂芳基或取代杂芳基，例如c
5-8
杂芳基或c
5-8
取代杂芳基，例如c5杂芳基或c5取代杂芳基，或者c6杂芳基或c6取代杂芳基。在某些实施例中，r
13
为环烷基或取代环烷基，例如c
3-8
环烷基或c
3-8
取代环烷基，例如c
3-6
环烷基或c
3-6
取代环烷基，或者c
3-5
环烷基或c
3-5
取代环烷基。在某些实施例中，r
13
为杂环基或取代杂环基，例如c
3-8
杂环基或c
3-8
取代杂环基，例如c
3-6
杂环基或c
3-6
取代杂环基，或者c
3-5
杂环基或c
3-5
取代杂环基。
[0452]
在某些实施例中，r
13
独立选自氢、烷基、取代烷基、芳基和取代芳基。在这些实施例中，烷基、取代烷基和取代芳基如上述r
13
所述。
[0453]
对于连接官能团v1、v2、v3和v4，在受试连接子中可采用任何适当的连接官能团。目标连接官能团包括但不限于氨基、羰基、酰氨基、氧羰基、羧基、磺酰基、亚砜、磺酰氨基、氨基磺酰基、硫代、氧基、磷酸、磷酰胺酯、硫代磷酰胺酯等。在某些实施例中，v1、v2、v3和v4分别独立选自共价键、-co-、-nr
15-、-nr
15
(ch2)
q-、-nr
15
(c6h4)-、-conr
15-、-nr
15
co-、-c(o)o-、-oc(o)-、-o-、-s-、-s(o)-、-so
2-、-so2nr
15-、-nr
15
so
2-和-p(o)oh-，其中，q为1-6整数；在某些实施例中，q为1-6整数(例如，1、2、3、4、5或6)。在某些实施例中，q为1。在某些实施例中，q为2。
[0454]
在某些实施例中，每个r
15
独立选自氢、烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、烷氧基、取代烷氧基、氨基、取代氨基、羧基、羧基酯、酰基、酸氧基、酰氨基、氨酰基、烷基酰胺、取代烷基酰胺、磺酰基、硫代烷氧基、取代硫代烷氧基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、环烷基、取代环烷基、杂环基和取代杂环基。
[0455]
下文详述了每个r
15
的各种可能性。在某些实施例中，r
15
为氢。在某些实施例中，每个r
15
为氢。在某些实施例中，r
15
为烷基或取代烷基，例如c
1-6
烷基或c
1-6
取代烷基，或者c
1-4
烷基或c
1-4
取代烷基，或者c
1-3
烷基或c
1-3
取代烷基。在某些实施例中，r
15
为烯基或取代烯基，例如c
2-6
烯基或c
2-6
取代烯基，或者c
2-4
烯基或c
2-4
取代烯基，或者c
2-3
烯基或c
2-3
取代烯基。在某些实施例中，r
15
为炔基或取代炔基。在某些实施例中，r
15
为烷氧基或取代烷氧基。在某些实施例中，r
15
为氨基或取代氨基。在某些实施例中，r
15
为羧基或羧基酯。在某些实施例中，r15
为酰基或酰氧基。在某些实施例中，r
15
为酰氨基或氨酰基。在某些实施例中，r
15
为烷基酰胺或取代烷基酰胺。在某些实施例中，r
15
为磺酰基。在某些实施例中，r
15
为硫代烷氧基或取代硫代烷氧基。在某些实施例中，r
15
为芳基或取代芳基，例如c
5-8
芳基或c
5-8
取代芳基，例如c5芳基或c5取代芳基，或者c6芳基或c6取代芳基。在某些实施例中，r
15
为杂芳基或取代杂芳基，例如c
5-8
杂芳基或c
5-8
取代杂芳基，例如c5杂芳基或c5取代杂芳基，或者c6杂芳基或c6取代杂芳基。在某些实施例中，r
15
为环烷基或取代环烷基，例如c
3-8
环烷基或c
3-8
取代环烷基，例如c
3-6
环烷基或c
3-6
取代环烷基，或者c
3-5
环烷基或c
3-5
取代环烷基。在某些实施例中，r
15
为杂环基或取代杂环基，例如c
3-8
杂环基或c
3-8
取代杂环基，例如c
3-6
杂环基或c
3-6
取代杂环基，或者c
3-5
杂环基或c
3-5
取代杂环基。
[0456]
在某些实施例中，每个r
15
独立选自氢、烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、羧基、羧基酯、酰基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、环烷基、取代环烷基、杂环基和取代杂环基。在这些实施例中，氢、烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、羧基、羧基酯、酰基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、环烷基、取代环烷基、杂环基、和取代杂环基如上述r
15
所述。
[0457]
在某些实施例中，所述系链基团包括缩醛基、二硫化物、肼或酯。在某些实施例中，所述系链基团包括缩醛基。在某些实施例中，所述系链基团包括二硫化物。在某些实施例中，所述系链基团包括肼。在某些实施例中，所述系链基团包括酯。
[0458]
如上所述，在某些实施例中，l是包含-(t
1-v1)
a-(t
2-v2)
b-(t
3-v3)
c-(t
4-v4)
d-的连接子，其中，a、b、c和d为分别独立的0或1，其中，a、b、c和d之和为1-4。
[0459]
在某些实施例中，在受试连接子中：
[0460]
t1选自(c
1-c
12
)烷基和取代(c
1-c
12
)烷基；
[0461]
t2、t3和t4分别独立选自(c
1-c
12
)烷基、取代(c
1-c
12
)烷基、(eda)w、(peg)n、(aa)p、-(cr
13
oh)h-、4
‑‑
氨基-哌啶(4ap)、缩醛基、二硫化物、肼和酯；以及
[0462]v1
、v2、v3和v4分别独立选自共价键、-co-、-nr
15-、-nr
15
(ch2)
q-、-nr
15
(c6h4)-、-conr
15-、-nr
15
co-、-c(o)o-、-oc(o)-、-o-、-s-、-s(o)-、-so
2-、-so2nr
15-、-nr
15
so
2-和-p(o)oh-，其中，q为1-6整数；
[0463]
其中：
[0464]
(peg)n为其中n为1-30整数；
[0465]
eda为具有以下结构的乙二胺基团：
[0466]
其中y为1-6整数，r为0或1；
[0467]
4-氨基-哌啶(4ap)为
[0468]
aa为氨基酸残基，其中p为1-20整数；以及
[0469]
每个r
15
和r
12
独立选自氢、烷基、取代烷基、芳基和取代芳基，其中，任何两个相邻的r
12
基团可环形连接形成哌嗪基环；以及
[0470]r13
独立选自氢、烷基、取代烷基、芳基和取代芳基。
[0471]
在某些实施例中，t1、t2、t3和t4以及v1、v2、v3和v4选自下表(例如，下表中的一行)：
[0472]
表2
[0473][0474][0475]
nr
15-，t3为(peg)n，v3为-co-，t4不存在，v4不存在。
[0496]
在某些实施例中，t1为(c
1-c
12
)烷基，v1为-so
2-，t2为(c
1-c
12
)烷基，v2为-co-，t3不存在，v3不存在，t4不存在，v4不存在。
[0497]
在某些实施例中，t1为(c
1-c
12
)烷基，v1为-conr
15-，t2为(c
1-c
12
)烷基，v2不存在，t3为(cr
13
oh)h，v3为-conr
15-，t4不存在，v4不存在。
[0498]
在某些实施例中，t1为(c
1-c
12
)烷基，v1为-co-，t2为(aa)
p
，v2为-nr
15-，t3为(peg)n，v3为-co-，t4为(aa)
p
，v4为-nr
15-。
[0499]
在某些实施例中，t1为(c
1-c
12
)烷基，v1为-co-，t2为(aa)
p
，v2为-nr
15-，t3为(peg)n，v3为-p(o)oh-，t4为(aa)
p
，v4不存在。
[0500]
在某些实施例中，t1为(c
1-c
12
)烷基，v1为-co-，t2为(eda)w，v2不存在，t3为(aa)
p
，v3不存在，t4不存在，v4不存在。
[0501]
在某些实施例中，t1为(c
1-c
12
)烷基，v1为-co-，t2为(eda)w，v2为-co-，t3为(cr
13
oh)h，v3为-conr
15-，t4为(c
1-c
12
)烷基，v4为-co(aa)
p-。
[0502]
在某些实施例中，t1为(c
1-c
12
)烷基，v1为-conr
15-，t2为(c
1-c
12
)烷基，v2为-nr
15-，t3不存在，v3为-co-，t4不存在，v4不存在。
[0503]
在某些实施例中，t1为(c
1-c
12
)烷基，v1为-conr
15-，t2为(c
1-c
12
)烷基，v2为-nr
15-，t3不存在，v3为-co-，t4为(c
1-c
12
)烷基，v4为-nr
15-。
[0504]
在某些实施例中，t1为(c
1-c
12
)烷基，v1为-co-，t2为(eda)w，v2为-co-，t3为(cr
13
oh)h，v3为-conr
15-，t4为(peg)n，v4为-co(aa)
p-。
[0505]
在某些实施例中，t1为(c
1-c
12
)烷基，v1为-co-，t2为4ap，v2为-co-，t3为(c
1-c
12
)烷基，v3为-co-，t4为(aa)
p
，v4不存在。
[0506]
在某些实施例中，t1为(c
1-c
12
)烷基，v1为-co-，t2为4ap，v2为-co-，t3为(c
1-c
12
)烷基，v3为-co-，t4不存在，v4不存在。
[0507]
在某些实施例中，所述连接子由以下结构表示：
[0508]
[0509][0510][0511]
在上述连接子结构的某些实施例中，每个f为独立的0或1-12整数；每个y为独立的
0或1-20整数；每个n为独立的0或1-30整数；每个p为独立的0或1-20整数；每个h为独立的0或1-12整数；每个r为独立的氢、烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、烷氧基、取代烷氧基、氨基、取代氨基、羧基、羧基酯、酰基、酸氧基、酰氨基、氨酰基、烷基酰胺、取代烷基酰胺、磺酰基、硫代烷氧基、取代硫代烷氧基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、环烷基、取代环烷基、杂环基和取代杂环基；每个r’为独立的氢、氨基酸侧链、烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、烷氧基、取代烷氧基、氨基、取代氨基、羧基、羧基酯、酰基、酸氧基、酰氨基、氨酰基、烷基酰胺、取代烷基酰胺、磺酰基、硫代烷氧基、取代硫代烷氧基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、环烷基、取代环烷基、杂环基和取代杂环基。在上述连接子结构的某些实施例中，每个f为独立的0、1、2、3、4、5或6；每个y为独立的0、1、2、3、4、5或6；每个n为独立的0、1、2、3、4、5或6；每个p为独立的0、1、2、3、4、5或6；以及每个h为独立的0、1、2、3、4、5或6。在上述连接子结构的某些实施例中，每个r为独立的氢、甲基或-(ch2)
m-oh，其中，m为1、2、3或4(例如2)。
[0512]
在连接子l的某些实施例中，t1为(c
1-c
12
)烷基，v1为-co-，t2为4ap，v2为-co-，t3为(c
1-c
12
)烷基，v3为-co-，t4不存在，v4不存在。在某些实施例中，t1为乙烯，v1为-co-，t2为4ap，v2为-co-，t3为乙烯，v3为-co-，t4不存在，v4不存在。在某些实施例中，t1为乙烯，v1为-co-，t2为4ap，v2为-co-，t3为乙烯，v3为-co-，t4不存在，v4不存在，其中，t2(例如4ap)具有以下结构。
[0513][0514]
其中
[0515]r12
为聚乙二醇基团(例如，聚乙二醇或修饰聚乙二醇)。
[0516]
在某些实施例中，所述连接子l包括以下结构：
[0517][0518]
其中
[0519]
每个f为独立的1-12整数；以及
[0520]
n为1-30整数；
[0521]
在某些实施例中，f为1。在某些实施例中，f为2。在某些实施例中，一个f为2，一个f为1。
[0522]
在某些实施例中，n为1。
[0523]
在某些实施例中，上述连接子结构的左侧附着在肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基偶联基团上，上述连接子结构的右侧附着在美登素上。
[0524]
在受试化合物和偶联物中可采用上述结构中列出的任何化学实体、连接子和偶联基团。
[0525]
有关肼基-吲哚基和肼基-吡咯并-吡啶基化合物和偶联物的制备方法的其他发明见2013年3月11日提交的第2014/0141025号美国专利申请公开说明、2014年11月26日提交的第2015/0157736号美国专利申请公开说明，其中每项专利的公开内容均通过引用成为本发明的一部分。
[0526]
抗cd37抗体
[0527]
如上所述，受试偶联物可包含抗作为取代基w2的cd37抗体，其中抗cd37抗体经过修饰包括2-甲酰基甘氨酸(fgly)残基。在本发明中，可通过其标准名称、标准三个字母缩写和/或标准一个字母缩写来指代氨基酸，例如：丙氨酸或ala或a；半胱氨酸或cys或c；天冬氨酸或asp或d；谷氨酸或glu或e；苯基丙氨酸或phe或f；甘氨酸或gly或g；组氨酸或his或h；异亮氨酸或ile或i；赖氨酸或lys或k；亮氨酸或leu或l；甲硫氨酸或met或m；天冬酰胺或asn或n；脯氨酸或pro或p；谷氨酰胺或gln或q；精氨酸或arg或r；丝氨酸或ser或s；苏氨酸或thr或t；缬氨酸或val或v；色氨酸或trp或w；以及酪氨酸或tyr或y。
[0528]
在某些情况下，合适的抗cd37抗体与cd37多肽特异性结合，其中表位包含cd37抗原内的氨基酸残基。下表3描述了人类cd37多肽(uniprotkb-p11049)的氨基酸序列。
[0529]
表3-人类cd37氨基酸序列(uniprotkb-p11049)
[0530][0531][0532]
cd37表位可由多肽形成，所述多肽与表3所述人类cd37氨基酸序列的约200个氨基酸至约281个氨基酸的连续段具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％的氨基酸序列一致性。
[0533]“cd37抗原”或“cd37多肽”可包含与表3所述人类cd37氨基酸序列的约200个氨基酸至约281个氨基酸的连续段具有至少约75％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％的氨基酸序列一致性。
[0534]
在某些情况下，合适的抗cd37抗体表现出与cd37的高亲和力结合。例如，在某些情况下，合适的抗cd37抗体与cd37结合，亲和力至少约10-7
m、至少约10-8
m、至少约10-9
m、至少约10-10
m、至少约10-11
m、至少约10-12
m或大于10-12
m。在某些情况下，合适的抗cd37抗体与cd37上的表位结合，亲和力约10-7
m-约10-8
m、约10-8
m-约10-9
m、约10-9
m-约10-10
m、约10-10
m-约10-11
m,、约10-11
m-约10-12
m或大于10-12
m。
[0535]
在某些情况下，合适的抗cd37抗体与第二抗cd37抗体(例如，k7153a或ags67e)竞争与cd37内的表位结合，和/或与第二抗cd37抗体(例如，k7153a或ags67e)结合到cd37内的相同表位。在某些情况下，与第二抗cd37抗体竞争与cd37内的表位结合的抗cd37抗体也与第二抗cd37抗体(例如，k7153a或ags67e)结合到相同的表位。在某些情况下，与第二抗cd37抗体竞争与cd37内的表位结合的抗cd37抗体与第二抗cd37抗体(例如，k7153a或ags67e)结合的表位重叠的表位结合。在某些情况下，所述抗cd37抗体为人源化抗体。
[0536]
根据某些实施例，本发明所述的偶联物包含与cd37特异性结合并与抗cd37抗体竞争与cd37结合的抗cd37抗体，所述抗体包含：
[0537]
可变重链(vh)多肽，包含
[0538]
包含氨基酸序列gynmn(seq id no:3)的v
h cdr1，
[0539]
包含氨基酸序列nidpyyggttynrkfkg(seq id no:4)的v
h cdr2，以及
[0540]
包含氨基酸序列svgpfds(seq id no:5)的v
h cdr3；以及
[0541]
可变轻链(v
l
)多肽，包含
[0542]
包含氨基酸序列rasenvysyla(seq id no:8)的v
l cdr1，
[0543]
包含氨基酸序列faktlae(seq id no:9)的v
l cdr2，以及
[0544]
包含氨基酸序列qhhsdnpwt(seq id no:10)的v
l cdr3。
[0545]
在某些实施例中，本发明所述的偶联物包含抗cd37抗体，所述抗体包含：
[0546]
可变重链(vh)多肽，包含
[0547]
包含氨基酸序列gynmn(seq id no:3)的v
h cdr1，
[0548]
包含氨基酸序列nidpyyggttynrkfkg(seq id no:4)的v
h cdr2，以及
[0549]
包含氨基酸序列svgpfds(seq id no:5)的v
h cdr3；以及
[0550]
可变轻链(v
l
)多肽，包含
[0551]
包含氨基酸序列rasenvysyla(seq id no:8)的v
l cdr1，
[0552]
包含氨基酸序列faktlae(seq id no:9)的v
l cdr2，以及
[0553]
包含氨基酸序列qhhsdnpwt(seq id no:10)的v
l cdr3。
[0554]
根据某些实施例，本发明所述的偶联物包含抗cd37抗体，所述抗体包含：
[0555]
可变重链(vh)多肽，包含与seq id no:2中规定的氨基酸序列具有70％或以上、75％或以上、80％或以上、85％或以上、90％或以上、95％或以上、99％或以上或100％一致性的氨基酸序列；以及
[0556]
可变轻链(v
l
)多肽，包含与seq id no:7中规定的氨基酸序列具有70％或以上、75％或以上、80％或以上、85％或以上、90％或以上、95％或以上、99％或以上或100％一致性的氨基酸序列。
[0557]
使用本领域已知的竞争结合试验可以轻松测定第一抗体是否与第二抗体“竞争”与cd37结合。例如，可以通过抗体竞争试验识别竞争抗体。例如，第一抗体的样本可与固相载体结合。然后，加入疑似能够与此类第一抗体竞争的第二抗体样本。对两个抗体中的一个进行标记。如果标记的抗体和未标记的抗体与cd37上独立和分散的位点结合，则无论是否存在可疑的竞争抗体，标记的抗体都将结合相同的水平。然而，如果相互作用位点相同或重叠，未标记的抗体将竞争，与cd37结合的标记抗体量将降低。如果未标记的抗体存在过多，则将结合的标记抗体(如有)很少。
[0558]
就本发明而言，竞争抗体是将抗体与cd37的结合降低约50％或以上、约60％或以上、约70％或以上、约80％或以上、约85％或以上、约90％或更多、约95％或以上或约99％或以上的抗体。进行此类竞争试验的详细程序在本领域是众所周知的，详情见例如，harlow和lane，抗体，实验室手册，冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港，1988，567-569，1988，isbn0-87969-314-2。此类试验可以使用纯化抗体进行定量。可以通过滴定一种抗体来建立标准曲线，即相同的抗体用于标记和竞争抗体。可以对未标记的竞争抗体抑制标记抗体与孔板结合的能力进行滴定。可以对结果进行绘制，并比较达到理想结合抑制程度的必要浓度。
[0559]
根据某些实施例，本发明所述的偶联物包含抗cd37抗体，所述抗体包含重链多肽，所述轻链多肽包含的氨基酸序列与表4所示的重链多肽具有70％或以上、75％或以上、80％或以上、85％或以上、90％或以上、95％或以上、99％或以上或100％的一致性。在某些实施例中，此类抗cd37抗体包含表4所示的v
h cdr1、v
h cdr2和v
h cdr3。
[0560]
根据某些实施例，本发明所述的偶联物包含抗cd37抗体，所述抗体包含轻链多肽，所述轻链多肽包含的氨基酸序列与表4所示的轻链多肽具有70％或以上、75％或以上、80％或以上、85％或以上、90％或以上、95％或以上、99％或以上或100％的一致性。在某些实施例中，此类抗cd37抗体包含表4所示的v
l cdr1、v
l cdr2和v
l cdr3。
[0561]
根据某些实施例，本发明所述的偶联物包含抗cd37抗体，所述抗体包含重链多肽，所述重链多肽包含的氨基酸序列与表4所示的重链多肽具有70％或以上、75％或以上、80％或以上、85％或以上、90％或以上、95％或以上、99％或以上或100％的一致性；轻链多肽包含的氨基酸序列与表4所示的轻链多肽具有70％或以上、75％或以上、80％或以上、85％或以上、90％或以上、95％或以上、99％或以上或100％的一致性。在某些实施例中，此类抗cd37抗体包含表4所示的v
h cdr1、v
h cdr2、v
h cdr3、v
l cdr1、v
l cdr2和v
l cdr3。
[0562]
本发明的抗cd37示例的重链多肽、vh多肽、v
h cdr、轻链多肽、v
l
多肽和v
l cdr的氨基酸序列如下表4所示(按kabat所述cdr用粗体表示，可变区用下划线表示)。
[0563]
表4
–
抗cd37抗体氨基酸序列示例
[0564][0565]
根据某些实施例，本发明所述的偶联物包含抗cd37抗体，所述抗体包含重链多肽，所述重链多肽包含的氨基酸序列与表4(seq id no:1)所示的重链多肽具有70％或以上、75％或以上、80％或以上、85％或以上、90％或以上、95％或以上、99％或以上或100％的一致性；其中，所述抗体包含l234a取代、l235a取代或两者(例如，l234a取代和l235a取代)，其中，位置234和235符合eu编号系统。edelman等人，(1969)，《美国国家科学院院刊》，63:78-85。符合eu编号系统的残基l234和l235在表4中用粗体和斜体表示。在某些实施例中，此类抗cd37抗体与包含表4所示的v
h cdr1、v
h cdr2、v
h cdr3、v
l cdr1、v
l cdr2和v
l cdr3抗体竞争与cd37结合。在某些实施例中，此类抗cd37抗体包含表4所示的v
h cdr1、v
h cdr2、v
h cdr3、v
l cdr1、v
l cdr2和v
l cdr3。
[0566]
在某些实施例中，所述抗cd37抗体为igg1抗体。例如，在某些方面，所述抗cd37抗体为igg1κ抗体。
[0567]
在某些方面，所述抗cd37抗体为基于表4所示抗体的含fgly’的抗体。例如，在某些实施例中，所述抗体为表4所示抗体的衍生物，其中，抗体和衍生物之间的区别在于衍生物中存在一个或多个fgly’残基(或可选地，相关fge识别序列氨基酸)在表4的氨基酸序列中，可变区用下划线表示，cdr用粗体表示。在此示例中，重链c端的斜体残基取代了标准igg1重链c端的赖氨酸残基。斜体残基中带下划线的残基(lctpsr)构成醛标记，其中c在重链表达
后通过fge转化为fgly残基。斜体残基中不带下划线的残基为与标准igg1重链序列不同的其他残基。
[0568]
在某些实施例中，所述抗cd37抗体包含抗cd37抗体k7153a的一个、两个、三个、四个、五个或全部六个互补决定区(cdr)。在某些方面，所述抗cd37抗体包含抗cd37抗体ags67e的一个、两个、三个、四个、五个或全部六个互补决定区(cdr)。
[0569]
在某些方面，所述抗cd37抗体为基于表4所示抗体的含fgly’的抗体。例如，在某些实施例中，所述抗体为表4所示抗体的衍生物，其中，抗体和衍生物之间的区别在于衍生物中存在一个或多个fgly’残基(或可选地，相关fge识别序列氨基酸)表4提供了一个实施例所述的核酸和氨基酸序列，所述序列基于达克珠单抗的抗体示例。在表4的氨基酸序列中，可变区用下划线表示，cdr用粗体表示。在此示例中，基于达克珠单抗的抗体，重链c端的斜体残基取代标准igg1重链c端的赖氨酸残基。斜体残基中带下划线的残基(lctpsr)构成醛标记，其中c在重链表达后通过fge转化为fgly残基。斜体残基中不带下划线的残基为不同于标准igg1重链序列的其他残基。
[0570]
适用于受试偶联物的抗cd37抗体在某些情况下会抑制在其表面表达(例如过表达)cd37的人肿瘤细胞(例如恶性b细胞)的增殖，其中抑制发生在体外、体内或体外和体内两者。例如，在某些情况下，适用于受试偶联物的抗cd37抗体能够抑制在其表面表达(例如过表达)cd37的人肿瘤细胞的增殖至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或超过80％，例如至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％。
[0571]
本发明各方面进一步包括本发明所述的任何抗体的未偶联版本。
[0572]
修饰的恒定区序列
[0573]
如上所述，抗cd37抗体的氨基酸序列经过修饰包括硫酸酯酶基序，所述硫酸酯酶基序包含能够通过甲酰甘氨酸生成酶(fge)在体内(例如，在细胞中翻译含有醛标记的蛋白时)或体外(例如，通过在无细胞系统中接触含有醛标记的蛋白和fge)转化(氧化)为2-甲酰基甘氨酸(fgly)残基的丝氨酸或半胱氨酸残基。此类硫酸酯酶基序在本发明中也称为fge修饰位点。
[0574]
硫酸酯酶基序
[0575]
醛标记的最小硫酸酯酶基序的长度通常为5或6个氨基酸残基，长度通常不超过6个氨基酸残基。ig多肽的硫酸酯酶基序至少为5或6个氨基酸残基，例如长度为5-16、6-16、5-15、6-15、5-14、6-14、5-13、6-13、5-12、6-12、5-11、6-11、5-10、6-10、5-9、6-9、5-8或6-8个氨基酸残基，以定义长度小于16、15、14、13、12、11、10、9、8或7个氨基酸残基的硫酸酯酶基序。
[0576]
在某些实施例中，目标多肽包括已插入、缺失、取代(替换)相对于天然氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基，例如2个或以上、或3个或以上、或4个或以上、或5个或以上、或6个或以上、或7个或以上、或8个或以上、或9个或以上、或10个或以上、或11个或以上、或12个或以上、或13个或以上、或14个或以上、或15个或以上、或16个或以上、或17个或以上、或18个或以上、或19个或以上、或20个或以上氨基酸残基，以提供多肽中硫酸酯酶基序的序列。在某些实施例中，所述多肽包括相对于多肽的天然氨基酸序列而言少于20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个氨基酸序列的氨基酸残基的修饰(插入、添加、缺
失和/或取代/替换)。当多肽(例如抗cd37抗体)的天然氨基酸序列包含所需硫酸酯酶基序的一个或多个残基时，可以减少残基修饰的总数，例如，通过对天然氨基酸残基侧翼的氨基酸残基进行位点特异性修饰(插入、添加、缺失、取代/替换)，以提供所需硫酸酯酶基序的序列。在某些实施例中，将目标抗cd37多肽的天然氨基酸序列的修饰程度最小化，以最大限度地减少插入、缺失、取代(替换)或添加(例如，在n端或c端上)的氨基酸残基数量。将目标抗cd37多肽的氨基酸序列修饰程度最小化可以最大限度地减少此类修饰对抗cd37功能和/或结构的影响。
[0577]
应注意的是，虽然特定目标醛标记是包含至少一个最小硫酸酯酶基序(也称为“共有硫酸酯酶基序”)的醛标记，但很容易理解的是，本发明考虑且包括了较长的醛标记，并且可以在本发明的合成物和方法中找到用途。因此，醛标记可包含5或6个残基的最小硫酸酯酶基序，也可以更长，包含可在基序的n端和/或c端侧由额外的氨基酸残基侧接的最小硫酸酯酶基序。例如，醛标记可以是5或6个氨基酸残基，也可以是超过5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或以上氨基酸残基的氨基酸序列。
[0578]
醛标记可存在于ig重链c端处或附近，例如，醛标记可存在于天然野生型ig重链c端的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸内。醛标记可存在于ig重链的ch1结构域内。醛标记可存在于ig重链的ch2结构域内。醛标记可存在于ig重链的ch3结构域内。醛标记可存在于ig轻链恒定区内，例如，在κ轻链恒定区或λ轻链恒定区。
[0579]
在某些实施例中，所述硫酸酯酶基序可以为下式：
[0580]
x1z
10
x2z
20
x3z
30
ꢀꢀ
(i’)
[0581]
其中
[0582]z10
为半胱氨酸或丝氨酸(也可以用(c/s)表示)；
[0583]z20
为脯氨酸或丙氨酸残基(也可以用(p/a)表示)；
[0584]z30
为碱性氨基酸(例如，精氨酸(r)，也可以是赖氨酸(k)或组氨酸(h)，例如赖氨酸)，或脂肪族氨基酸(丙氨酸(a)、甘氨酸(g)、亮氨酸(l)、缬氨酸(v)、异亮氨酸(i)或脯氨酸(p)，例如a、g、l、v或i；
[0585]
x1可以存在或不存在，当存在时，可以为氨基酸，例如脂肪族氨基酸、含硫氨基酸或不带电的极性氨基酸(即除了芳香族氨基酸或带电氨基酸)，例如l、m、v、s或t，例如l、m、s或v，但前提是当硫酸酯酶基序位于目标多肽的n端时，x1存在；以及
[0586]
x2和x3可以为任何独立氨基酸，但通常为脂肪族氨基酸、不带电的极性氨基酸或含硫氨基酸(即除了芳香族氨基酸或带电氨基酸)，例如s、t、a、v、g或c，例如s、t、a、v或g。
[0587]
对抗cd37重链和/或轻链的氨基酸序列进行修饰，以提供式x1z
10
x2z
20
x3z
30
的至少5个氨基酸序列，其中
[0588]z10
为半胱氨酸或丝氨酸；
[0589]z20
为脯氨酸或丙氨酸残基；
[0590]z30
为脂肪族氨基酸或碱性氨基酸；
[0591]
x1可以存在或不存在，当存在时，可以是任何氨基酸，但前提是当异源硫酸酯酶基序位于多肽的n端时，x1存在；
[0592]
x2和x3为分别独立的任何氨基酸，
[0593]
其中，所述序列位于ig恒定区的溶剂可及环区中或附近，其中，所述序列不在ig重
链的c端。
[0594]
通常选择的硫酸酯酶基序能够由选择的fge转化，例如，存在于表达醛标记多肽的宿主细胞中的fge或在无细胞体外方法中与醛标记多肽接触的fge。
[0595]
例如，如果fge为真核fge(例如哺乳动物fge，包括人类fge)，则硫酸酯酶基序的公式为：
[0596]
x1cx2px3z
30
ꢀꢀ
(i”)
[0597]
其中
[0598]
x1可以存在或不存在，当存在时，可以为氨基酸，例如脂肪族氨基酸、含硫氨基酸或不带电的极性氨基酸(即除了芳香族氨基酸或带电氨基酸)，例如l、m、s或v，但前提是当硫酸酯酶基序位于目标多肽的n端时，x1存在；
[0599]
x2和x3可以为任何独立氨基酸，例如，脂肪族氨基酸、含硫氨基酸或不带电的极性氨基酸，(即除了芳香族氨基酸或带电氨基酸)，例如s、t、a、v、g或c，例如s、t、a、v或g；以及
[0600]z30
为碱性氨基酸(例如，精氨酸(r)，也可以是赖氨酸(k)或组氨酸(h)，例如赖氨酸)，或脂肪族氨基酸(丙氨酸(a)、甘氨酸(g)、亮氨酸(l)、缬氨酸(v)、异亮氨酸(i)或脯氨酸(p)，例如a、g、l、v或i。
[0601]
硫酸酯酶基序的具体示例包括lctpsr(seq id no:12)、mctpsr(seq id no:13)、vctpsr(seq id no:14)、lcspsr(seq id no:15)、lcapsr(seq id no:16)、lcvpsr(seq id no:17)、lcgpsr(seq id no:18)、ictpar(seq id no:19)、lctpsk(seq id no:20)、mctpsk(seq id no:21)、vctpsk(seq id no:22)、lcspsk(seq id no:23)、lcapsk(seq id no:24)、lcvpsk(seq id no:25)、lcgpsk(seq id no:26)、lctpsa(seq id no:27)、ictpaa(seq id no:28)、mctpsa(seq id no:29)、vctpsa(seq id no:30)、lcspsa(seq id no:31)、lcapsa(seq id no:32)、lcvpsa(seq id no:33)和lcgpsa(seq id no:34)。
[0602]
含fgly序列
[0603]
当fge作用于修饰的抗cd37重链和/或轻链时，将硫酸酯酶基序中的丝氨酸或半胱氨酸修饰为fgly。因此，含fgly的硫酸酯酶基序可以为下式：
[0604]
x1(fgly)x2z
20
x3z
30
ꢀꢀ
(i
”’
)
[0605]
其中
[0606]
fgly为甲酰甘氨酸残基；
[0607]z20
为脯氨酸或丙氨酸残基(也可以用(p/a)表示)；
[0608]z30
为碱性氨基酸(例如，精氨酸(r)，也可以是赖氨酸(k)或组氨酸(h)，通常为赖氨酸)，或脂肪族氨基酸(丙氨酸(a)、甘氨酸(g)、亮氨酸(l)、缬氨酸(v)、异亮氨酸(i)或脯氨酸(p)，例如a、g、l、v或i；
[0609]
x1可以存在或不存在，当存在时，可以为氨基酸，例如脂肪族氨基酸、含硫氨基酸或不带电的极性氨基酸(即除了芳香族氨基酸或带电氨基酸)，例如l、m、v、s或t，例如l、m或v，但前提是当硫酸酯酶基序位于目标多肽的n端时，x1存在；以及
[0610]
x2和x3可以为任何独立氨基酸，例如，脂肪族氨基酸、含硫氨基酸或不带电的极性氨基酸，(即除了芳香族氨基酸或带电氨基酸)，例如s、t、a、v、g或c，例如s、t、a、v或g。
[0611]
如上所述，含有fgly残基的修饰多肽可通过fgly与药物(如上所述，含有肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基偶联基团的药物)反应产生含有fgly'的硫酸酯酶基序而与药
物(例如美登素类化合物)偶联。在本发明中，术语fgly’是指与药物(例如美登素类化合物)偶联的硫酸酯酶基序的修饰氨基酸残基(例如式(i)的修饰氨基酸残基)。因此，含fgly’的硫酸酯酶基序可以为下式：
[0612]
x1(fgly’)x2z
20
x3z
30
ꢀꢀ
(ii)
[0613]
其中
[0614]
fgly’为式(i)的修饰氨基酸残基；
[0615]z20
为脯氨酸或丙氨酸残基(也可以用(p/a)表示)；
[0616]z30
为碱性氨基酸(例如，精氨酸(r)，也可以是赖氨酸(k)或组氨酸(h)，通常为赖氨酸)，或脂肪族氨基酸(丙氨酸(a)、甘氨酸(g)、亮氨酸(l)、缬氨酸(v)、异亮氨酸(i)或脯氨酸(p)，例如a、g、l、v或i；
[0617]
x1可以存在或不存在，当存在时，可以为氨基酸，例如脂肪族氨基酸、含硫氨基酸或不带电的极性氨基酸(即除了芳香族氨基酸或带电氨基酸)，例如l、m、v、s或t，例如l、m或v，但前提是当硫酸酯酶基序位于目标多肽的n端时，x1存在；以及
[0618]
x2和x3可以为任何独立氨基酸，例如，脂肪族氨基酸、含硫氨基酸或不带电的极性氨基酸，(即除了芳香族氨基酸或带电氨基酸)，例如s、t、a、v、g或c，例如s、t、a、v或g。
[0619]
在某些实施例中，式(i)中的修饰氨基酸残基位于抗cd37抗体重链恒定区的c端。在某些情况下，所述重链恒定区包含式(ii)的序列：
[0620]
x1(fgly’)x2z
20
x3z
30
ꢀꢀ
(ii)
[0621]
其中
[0622]
fgly’为式(i)的修饰氨基酸残基；
[0623]z20
为脯氨酸或丙氨酸残基(也可以用(p/a)表示)；
[0624]z30
为碱性氨基酸(例如，精氨酸(r)，也可以是赖氨酸(k)或组氨酸(h)，通常为赖氨酸)，或脂肪族氨基酸(丙氨酸(a)、甘氨酸(g)、亮氨酸(l)、缬氨酸(v)、异亮氨酸(i)或脯氨酸(p)，例如a、g、l、v或i；
[0625]
x1可以存在或不存在，当存在时，可以为氨基酸，例如脂肪族氨基酸、含硫氨基酸或不带电的极性氨基酸(即除了芳香族氨基酸或带电氨基酸)，例如l、m、v、s或t，例如l、m或v，但前提是当硫酸酯酶基序位于目标多肽的n端时，x1存在；
[0626]
x2和x3可以为任何独立氨基酸，例如，脂肪族氨基酸、含硫氨基酸或不带电的极性氨基酸，(即除了芳香族氨基酸或带电氨基酸)，例如s、t、a、v、g或c，例如s、t、a、v或g；以及
[0627]
其中，所述序列为氨基酸序列qkslslspgk的c端，其中，所述序列可包括1、2、3、4、5或5-10个氨基酸，在天然野生型重ig链恒定区中不存在这些氨基酸。
[0628]
在某些实施例中，所述重链恒定区包含在ig重链c端的序列slslspgsl(fgly’)tpsrgs(seq id no:35)，例如，代替天然slslspgk(seq id no:36)序列。
[0629]
在某些实施例中，式(i)中的修饰氨基酸残基位于抗cd37抗体轻链恒定区。在某些实施例中，所述轻链恒定区包含式(ii)的序列：
[0630]
x1(fgly’)x2z
20
x3z
30
ꢀꢀ
(ii)
[0631]
其中
[0632]
fgly’为式(i)的修饰氨基酸残基；
[0633]z20
为脯氨酸或丙氨酸残基(也可以用(p/a)表示)；
[0634]z30
为碱性氨基酸(例如，精氨酸(r)，也可以是赖氨酸(k)或组氨酸(h)，通常为赖氨酸)，或脂肪族氨基酸(丙氨酸(a)、甘氨酸(g)、亮氨酸(l)、缬氨酸(v)、异亮氨酸(i)或脯氨酸(p)，例如a、g、l、v或i；
[0635]
x1可以存在或不存在，当存在时，可以为氨基酸，例如脂肪族氨基酸、含硫氨基酸或不带电的极性氨基酸(即除了芳香族氨基酸或带电氨基酸)，例如l、m、v、s或t，例如l、m或v，但前提是当硫酸酯酶基序位于目标多肽的n端时，x1存在；
[0636]
x2和x3可以为任何独立氨基酸，例如，脂肪族氨基酸、含硫氨基酸或不带电的极性氨基酸，(即除了芳香族氨基酸或带电氨基酸)，例如s、t、a、v、g或c，例如s、t、a、v或g；以及
[0637]
其中，所述序列为氨基酸序列kvdnal(seq id no:37)的c端，和/或氨基酸序列qsgnsq(seq id no:38)的n端。
[0638]
在某些实施例中，所述轻链恒定区包含序列kvdnal(fgly’)tpsrqsgnsq(seq id no:39)。
[0639]
在某些实施例中，式(i)中的修饰氨基酸残基位于抗cd37抗体重链ch1区。在某些实施例中，所述重链ch1区包含式(ii)的序列：
[0640]
x1(fgly’)x2z
20
x3z
30
ꢀꢀ
(ii)
[0641]
其中
[0642]
fgly’为式(i)的修饰氨基酸残基；
[0643]z20
为脯氨酸或丙氨酸残基(也可以用(p/a)表示)；
[0644]z30
为碱性氨基酸(例如，精氨酸(r)，也可以是赖氨酸(k)或组氨酸(h)，通常为赖氨酸)，或脂肪族氨基酸(丙氨酸(a)、甘氨酸(g)、亮氨酸(l)、缬氨酸(v)、异亮氨酸(i)或脯氨酸(p)，例如a、g、l、v或i；
[0645]
x1可以存在或不存在，当存在时，可以为氨基酸，例如脂肪族氨基酸、含硫氨基酸或不带电的极性氨基酸(即除了芳香族氨基酸或带电氨基酸)，例如l、m、v、s或t，例如l、m或v，但前提是当硫酸酯酶基序位于目标多肽的n端时，x1存在；
[0646]
x2和x3可以为任何独立氨基酸，例如，脂肪族氨基酸、含硫氨基酸或不带电的极性氨基酸，(即除了芳香族氨基酸或带电氨基酸)，例如s、t、a、v、g或c，例如s、t、a、v或g；以及
[0647]
其中，所述序列为氨基酸序列swnsga(seq id no:40)的c端，和/或氨基酸序列gvhtfp(seq id no:41)的n端。
[0648]
在某些实施例中，所述重链ch1区包含序列swnsgal(fgly’)tpsrgvhtfp(seq id no:42)。
[0649]
修饰位点
[0650]
如上所述，抗cd37抗体的氨基酸序列经过修饰包括硫酸酯酶基序，所述硫酸酯酶基序包含能够通过fge在体内(例如，在细胞中翻译含有醛标记的蛋白时)或体外(例如，通过在无细胞系统中接触含有醛标记的蛋白和fge)转化(氧化)为fgly残基的丝氨酸或半胱氨酸残基。用于产生本发明所述偶联物的抗cd37多肽包括至少一个ig恒定区，例如，一个ig重链恒定区(例如，至少一个ch1结构域；至少一个ch1和一个ch2结构域；一个ch1、一个ch2和一个ch3结构域；或一个ch1、一个ch2、一个ch3和一个ch4结构域)或一个ig轻链恒定区。此类ig多肽在本发明中称为“目标ig多肽”或“目标抗cd37抗体”或“目标抗cd37 ig多肽”。
[0651]
引入硫酸酯酶基序的抗cd37抗体的位点可以是任何适当的位点。如上所述，在某
些情况下，将目标抗cd37多肽的天然氨基酸序列的修饰程度最小化，从而最大限度地减少插入、缺失、取代(替换)和/或添加(例如，在n端或c端上)的氨基酸残基数量。将目标抗cd37多肽的氨基酸序列修饰程度最小化可以最大限度地减少此类修饰对抗cd37功能和/或结构的影响。
[0652]
抗cd37抗体重链恒定区可包括任何重链同种型的ig恒定区、非天然ig重链恒定区(包括共有ig重链恒定区)。ig恒定区经过修饰包括一个醛标记，其中，所述醛标记存在于ig恒定区的溶剂可及环区中或附近。可通过插入和/或取代1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个氨基酸或16个以上的氨基酸来修饰ig恒定区，以提供上述硫酸酯酶基序氨基酸序列。
[0653]
在某些情况下，醛标记的抗cd37抗体包含一个醛标记的ig重链恒定区(例如，至少一个ch1结构域；至少一个ch1和一个ch2结构域；一个ch1、一个ch2和一个ch3结构域；或一个ch1、一个ch2、一个ch3和一个ch4结构域)。醛标记ig重链恒定区包括iga、igm、igd、ige、igg1、igg2、igg3或igg4同种型重链或任何异型变体的重链恒定区序列，例如人类重链恒定区序列或小鼠重链恒定区序列、杂合重链恒定区、合成重链恒定区或共有重链恒定区等，经过修饰包括至少一个硫酸酯酶基序，所述硫酸酯酶基序可通过fge修饰产生fgly修饰的ig多肽。本领域已知ig重链的异型变体。见jefferis和lefranc(2009)《单株抗体(mab)》1:4。
[0654]
在某些情况下，醛标记的抗cd37抗体包含醛标记的ig轻链恒定区。醛标记ig轻链恒定区可包括κ轻链、λ轻链的恒定区序列，例如人类κ或λ轻链恒定区、杂合轻链恒定区、合成轻链恒定区或共有轻链恒定区序列等，经过修饰包括至少一个硫酸酯酶基序，所述硫酸酯酶基序可通过fge修饰产生fgly修饰的抗cd37抗体多肽。示例性恒定区包括人类γ1和γ3区。除硫酸酯酶基序外，修饰的恒定区可具有野生型氨基酸序列，或者具有与野生型氨基酸序列至少70％相同(例如，至少80％、至少90％或至少95％相同)的氨基酸序列。
[0655]
在某些实施例中，所述硫酸酯酶基序位于ig多肽重链c端以外的位置。如上所述，分离的醛标记抗cd37多肽可包含修饰为包括上述硫酸酯酶基序的重链恒定区，其中硫酸酯酶基序位于抗cd37多肽重链恒定区的表面可及环区中或附近。
[0656]
在某些情况下，对靶点抗cd37免疫球蛋白进行修饰以包括上述硫酸酯酶基序，其中，所述修饰包括一个或多个氨基酸残基插入、缺失和/或取代。在某些实施例中，所述硫酸酯酶基序位于igg1重链恒定区内或附近，对应于一个或多个：1)氨基酸122-127；2)氨基酸137-143；3)氨基酸155-158；4)氨基酸163-170；5)氨基酸163-183；6)氨基酸179-183；7)氨基酸190-192；8)氨基酸200-202；9)氨基酸199-202；10)氨基酸208-212；11)氨基酸220-241；12)氨基酸247-251；13)氨基酸257-261；14)氨基酸269-277；15)氨基酸271-277；16)氨基酸284-285；17)氨基酸284-292；18)氨基酸289-291；19)氨基酸299-303；20)氨基酸309-313；21)氨基酸320-322；22)氨基酸329-335；23)氨基酸341-349；24)氨基酸342-348；25)氨基酸356-365；26)氨基酸377-381；27)氨基酸388-394；28)氨基酸398-407；29)氨基酸433-451；以及30)氨基酸446-451；其中，所述氨基酸编号基于人igg1的氨基酸编号。
[0657]
在某些情况下，对靶点抗cd37免疫球蛋白进行修饰以包括上述硫酸酯酶基序，其中，所述修饰包括一个或多个氨基酸残基插入、缺失和/或取代。在某些实施例中，所述硫酸酯酶基序位于igg1重链恒定区内或附近，对应于一个或多个：1)氨基酸1-6；2)氨基酸16-22；3)氨基酸34-47；4)氨基酸42-49；5)氨基酸42-62；6)氨基酸34-37；7)氨基酸69-71；8)氨
基酸79-81；9)氨基酸78-81；10)氨基酸87-91；11)氨基酸100-121；12)氨基酸127-131；13)氨基酸137-141；14)氨基酸149-157；15)氨基酸151-157；16)氨基酸164-165；17)氨基酸164-172；18)氨基酸169-171；19)氨基酸179-183；20)氨基酸189-193；21)氨基酸200-202；22)氨基酸209-215；23)氨基酸221-229；24)氨基酸22-228；25)氨基酸236-245；26)氨基酸217-261；27)氨基酸268-274；28)氨基酸278-287；29)氨基酸313-331；以及30)氨基酸324-331；其中，所述氨基酸编号基于图15b所示的seq id no:43(人igg1恒定区)中规定的人igg1的氨基酸编号。
[0658]
igg1重链的示例性表面可及环区包括：1)astkgp(seq id no:53)；2)kstsggt(seq id no:54)；3)pepv(seq id no:55)；4)nsgaltsg(seq id no:56)；5)nsgaltsgvhtfpavlqssgl(seq id no:57)；6)qssgl(seq id no:58)；7)vtv；8)qty；9)tqty(seq id no:59)；10)hkpsn(seq id no:60)；11)epkscdkthtcppcpapellgg(seq id no:61)；12)fppkp(seq id no:62)；13)isrtp(seq id no:63)；14)dvshedpev(seq id no:64)；15)shedpev(seq id no:65)；16)dg；17)dgvevhnak(seq id no:66)；18)hna；19)qynst(seq id no:67)；20)vltvl(seq id no:68)；21)gke；22)nkalpap(seq id no:69)；23)skakgqpre(seq id no:70)；24)kakgqpr(seq id no:71)；25)ppsrkeltkn(seq id no:72)；26)ypsdi(seq id no:73)；27)ngqpenn(seq id no:74)；28)tppvldsdgs(seq id no:75)；29)healhnhytqkslslspgk(seq id no:76)；和30)slspgk(seq id no:77)。
[0659]
在某些情况下，对靶点免疫球蛋白进行修饰以包括上述硫酸酯酶基序，其中，所述修饰包括一个或多个氨基酸残基插入、缺失和/或取代。在某些实施例中，所述硫酸酯酶基序位于igg2重链恒定区内或附近，对应于一个或多个：1)氨基酸1-6；2)氨基酸13-24；3)氨基酸33-37；4)氨基酸43-54；5)氨基酸58-63；6)氨基酸69-71；7)氨基酸78-80；8)87-89；9)氨基酸95-96；10)114-118；11)122-126；12)134-136；13)144-152；14)159-167；15)175-176；16)184-188；17)195-197；18)204-210；19)216-224；20)231-233；21)237-241；22)252-256；23)263-269；24)273-282；25)氨基酸299-302；其中，所述氨基酸编号基于图15b所述的seq id no:44(人igg2)中规定的氨基酸序列编号。
[0660]
igg2重链的示例性表面可及环区包括：1)astkgp(seq id no:78)；2)pcsrstsestaa(seq id no:79)；3)fpepv(seq id no:80)；4)sgaltsgvhtfp(seq id no:81)；5)qssgly(seq id no:82)；6)vtv；7)tqt；8)hkp；9)dk；10)vagps(seq id no:83)；11)fppkp(seq id no:84)；12)rtp；13)dvshedpev(seq id no:85)；14)dgvevhnak(seq id no:86)；15)fn；16)vltvv(seq id no:87)；17)gke；18)nkglpap(seq id no:88)；19)sktkgqpre(seq id no:89)；20)pps；21)mtknq(seq id no:90)；22)ypsdi(seq id no:91)；23)ngqpenn(seq id no:92)；24)tppmldsdgs(seq id no:93)；25)gnvf(seq id no:94)；和26)healhnhytqkslslspgk(seq id no:95)。
[0661]
在某些情况下，对靶点免疫球蛋白进行修饰以包括上述硫酸酯酶基序，其中，所述修饰包括一个或多个氨基酸残基插入、缺失和/或取代。在某些实施例中，所述硫酸酯酶基序位于igg3重链恒定区内或附近，对应于一个或多个：1)氨基酸1-6；2)氨基酸13-22；3)氨基酸33-37；4)氨基酸43-61；5)氨基酸71；6)氨基酸78-80；7)87-91；8)氨基酸97-106；9)111-115；10)147-167；11)173-177；16)185-187；13)195-203；14)210-218；15)226-227；16)238-239；17)246-248；18)255-261；19)267-275；20)282-291；21)氨基酸303-307；22)氨基
酸313-320；23)氨基酸324-333；24)氨基酸350-352；25)氨基酸359-365；以及26)氨基酸372-377；其中，所述氨基酸编号基于图15b所示的seq id no:45(人igg3)中规定的氨基酸序列编号。
[0662]
igg3重链的示例性表面可及环区包括：1)astkgp(seq id no:96)；2)pcsrstsggt(seq id no:97)；3)fpepv(seq id no:98)；4)sgaltsgvhtfpavlqssg(seq id no:99)；5)v；6)tqt；7)hkpsn(seq id no:100)；8)rvelktplgd(seq id no:101)；9)cprcpkp(seq id no:102)；10)pkscdtpppcprcpapellgg(seq id no:103)；11)fppkp(seq id no:104)；12)rtp；13)dvshedpev(seq id no:105)；14)dgvevhnak(seq id no:106)；15)yn；16)vl；17)gke；18)nkalpap(seq id no:107)；19)sktkgqpre(seq id no:108)；20)ppsreemtkn(seq id no:109)；21)ypsdi(seq id no:110)；22)ssgqpenn(seq id no:111)；23)tppmldsdgs(seq id no:112)；24)gni；25)healhnr(seq id no:113)；和26)slspgk(seq id no:114)。
[0663]
在某些情况下，对靶点免疫球蛋白进行修饰以包括上述硫酸酯酶基序，其中，所述修饰包括一个或多个氨基酸残基插入、缺失和/或取代。在某些实施例中，所述硫酸酯酶基序位于igg4重链恒定区内或附近，对应于一个或多个：1)氨基酸1-5；2)氨基酸12-23；3)氨基酸32-36；4)氨基酸42-53；5)氨基酸57-62；6)氨基酸68-70；7)氨基酸77-79；8)氨基酸86-88；9)氨基酸94-95；10)氨基酸101-102；11)氨基酸108-118；12)氨基酸122-126；13)氨基酸134-136；14)氨基酸144-152；15)氨基酸159-167；16)氨基酸175-176；17)氨基酸185-186；18)氨基酸196-198；19)氨基酸205-211；20)氨基酸217-226；21)氨基酸232-241；22)氨基酸253-257；23)氨基酸264-265；24)269-270；25)氨基酸274-283；26)氨基酸300-303；27)氨基酸399-417；其中，所述氨基酸编号基于图15b所示的seq id no:46(人igg4)中规定的氨基酸序列编号。
[0664]
igg4重链的示例性表面可及环区包括：1)stkgp(seq id no:115)；2)pcsrstsestaa(seq id no:116)；3)fpepv(seq id no:117)；4)sgaltsgvhtfp(seq id no:118)；5)qssgly(seq id no:119)；6)vtv；7)tkt；8)hkp；9)dk；10)yg；11)cpapeflggps(seq id no:120)；12)fppkp(seq id no:121)；13)rtp；14)dvsqedpev(seq id no:122)；15)dgvevhnak(seq id no:123)；16)fn；17)vl；18)gke；19)nkglpss(seq id no:124)；20)skakgqprep(seq id no:125)；21)ppsqeemtkn(seq id no:126)；22)ypsdi(seq id no:127)；23)ng；24)nn；25)tppvldsdgs(seq id no:128)；26)gnvf(seq id no:129)；和27)healhnhytqkslslslgk(seq id no:130)。
[0665]
在某些情况下，对靶点免疫球蛋白进行修饰以包括上述硫酸酯酶基序，其中，所述修饰包括一个或多个氨基酸残基插入、缺失和/或取代。在某些实施例中，所述硫酸酯酶基序位于iga重链恒定区内或附近，对应于一个或多个：1)氨基酸1-13；2)氨基酸17-21；3)氨基酸28-32；4)氨基酸44-54；5)氨基酸60-66；6)氨基酸73-76；7)氨基酸80-82；8)氨基酸90-91；9)氨基酸123-125；10)氨基酸130-133；11)氨基酸138-142；12)氨基酸151-158；13)氨基酸165-174；14)氨基酸181-184；15)氨基酸192-195；16)氨基酸199；17)氨基酸209-210；18)氨基酸222-245；19)氨基酸252-256；20)氨基酸266-276；21)氨基酸293-294；22)氨基酸301-304；23)氨基酸317-320；24)氨基酸329-353；其中，所述氨基酸编号基于图15b所示的seq id no:47(人iga)中规定的氨基酸序列编号。
[0666]
iga重链的示例性表面可及环区包括：1)asptspkvfplsl(seq id no:131)；2)
qpdgn(seq id no:132)；3)vqgffpqepl(seq id no:133)；4)sgqgvtarnfp(seq id no:134)；5)sgdlytt(seq id no:135)；6)patq(seq id no:136)；7)gks；8)yt；9)chp；10)hrpa(seq id no:137)；11)llgse(seq id no:138)；12)glrdasgv(seq id no:139)；13)ssgksavqgp(seq id no:140)；14)gcys(seq id no:141)；15)caep(seq id no:142)；16)pe；17)sgntfrpevhllpppseelalnel(seq id no:143)；18)argfs(seq id no:144)；19)qgsqelpreky(seq id no:145)；20)av；21)aaed(seq id no:146)；22)heal(seq id no:147)；和23)idrlagkpthvnvsvvmaevdgtcy(seq id no:148)。
[0667]
硫酸酯酶基序可位于此类ig重链修饰位点的一个或多个氨基酸序列内或邻近。例如，可以在一个或多个氨基酸序列处修饰ig重链多肽(例如，其中修饰包括一个或多个氨基酸残基插入、缺失和/或取代)，从而在这些修饰位点的相邻位置和n端和/或相邻位置和c端提供硫酸酯酶基序。可替代地或另外，可以在一个或多个氨基酸序列处修饰ig重链多肽(例如，其中修饰包括一个或多个氨基酸残基的插入、缺失和/或取代)，从而在ig重链修饰位点的任何两个残基之间提供硫酸酯酶基序。在某些实施例中，ig重链多肽经过修饰包括两个硫酸酯酶基序，这两个硫酸酯酶基序可以彼此相邻，也可以由一个、两个、三个、四个或更多(例如，约1-约25个、约25-约50个、约50-约100个或以上)氨基酸分开。可替代地或另外，当天然氨基酸序列提供硫酸酯酶基序的一个或多个氨基酸残基时，可对ig重链多肽氨基酸序列的修饰位点的选择氨基酸残基进行修饰(例如，其中修饰包括一个或多个氨基酸的插入、缺失和/或取代)，以便提供修饰位点的硫酸酯酶基序。
[0668]
因此，可对表面可及环区的氨基酸序列进行修饰，以提供硫酸酯酶基序，其中修饰包括插入、缺失和/或取代。例如，如果修饰位于ch1结构域，则表面可及环区可具有氨基酸序列nsgaltsg(seq id no:149)，醛标记序列可以为nsgalctpsrg(seq id no:150)，例如，其中nsgaltsg(seq id no:151)序列的“ts”残基替换为“ctpsr,”(seq id no:152)，则硫酸酯酶基序具有序列lctpsr(seq id no:153)。作为另一示例，如果修饰位于ch2结构域，则表面可及环区可具有氨基酸序列nkalpap(seq id no:154)，醛标记序列可以为nlctpsrap(seq id no:155)，例如，如果nkalpap(seq id no:156)序列的“kal”残基替换为“lctpsr,”(seq id no:157)，硫酸酯酶基序具有序列lctpsr(seq id no:158)。作为另一示例，如果修饰位于ch2/ch3结构域，则表面可及环区可具有氨基酸序列kakgqpr(seq id no:159)，醛标记序列可以为kakglctpsr(seq id no:160)，例如，如果kakgqpr(seq id no:161)序列的“gqp”残基替换为“lctps,”(seq id no:162)，硫酸酯酶基序具有序列lctpsr(seq id no:163)。
[0669]
如上所述，分离的醛标记抗cd37多肽可包含修饰为包括上述硫酸酯酶基序的轻链恒定区，其中硫酸酯酶基序位于ig多肽轻链恒定区的表面可及环区中或附近。
[0670]
在某些情况下，对靶点免疫球蛋白进行修饰以包括上述硫酸酯酶基序，其中，所述修饰包括一个或多个氨基酸残基插入、缺失和/或取代。在某些实施例中，所述ig轻链恒定区内或附近，对应于一个或多个：1)氨基酸130-135；2)氨基酸141-143；3)氨基酸150；4)氨基酸162-166；5)氨基酸163-166；6)氨基酸173-180；7)氨基酸186-194；8)氨基酸211-212；9)氨基酸220-225；10)氨基酸233-236；其中，所述氨基酸编号基于图15c所示的人κ轻链的氨基酸编号。在某些情况下，对靶点免疫球蛋白进行修饰以包括上述硫酸酯酶基序，其中，所述修饰包括一个或多个氨基酸残基插入、缺失和/或取代。在某些实施例中，所述ig轻链
恒定区内或附近，对应于一个或多个：1)氨基酸1-6；2)氨基酸12-14；3)氨基酸21；4)氨基酸33-37；5)氨基酸34-37；6)氨基酸44-51；7)氨基酸57-65；8)氨基酸83-83；9)氨基酸91-96；10)氨基酸104-107；其中，所述氨基酸编号基于图15c所示的seq id no:48(人κ轻链)。
[0671]
ig轻链的示例性表面可及环区(例如，人κ轻链)包括：1)rtvaap(seq id no:164)；2)pps；3)gly(例如，见图15c所示的人κ轻链序列中第150位的gly)；4)yprea(seq id no:165)；5)prea(seq id no:166)；6)dnalqsgn(seq id no:167)；7)teqdskdst(seq id no:168)；8)hk；9)hqglss(seq id no:169)；以及10)rgec(seq id no:170)。
[0672]
igλ轻链的示例性表面可及环区包括qpkaap(seq id no:171)、pps、nk、dfypgav(seq id no:172)、dsspvkag(seq id no:173)、ttp、sn、hks、eg和aptecs(seq id no:174)。
[0673]
在某些情况下，对靶点免疫球蛋白进行修饰以包括上述硫酸酯酶基序，其中，所述修饰包括一个或多个氨基酸残基插入、缺失和/或取代。在某些实施例中，所述大鼠ig轻链恒定区内或附近，对应于一个或多个：1)氨基酸1-6；2)氨基酸12-14；3)氨基酸121-22；4)氨基酸31-37；5)氨基酸44-51；6)氨基酸55-57；7)氨基酸61-62；8)氨基酸81-83；9)氨基酸91-92；10)氨基酸102-105；其中，所述氨基酸编号基于图15c所示的seq id no:52中规定的的大鼠轻链的氨基酸编号。
[0674]
在某些情况下，在抗cd37重链恒定区的ch1区引入硫酸酯酶基序。在某些情况下，在抗cd37重链c端(例如，在1-10个氨基酸内)中或附近引入硫酸酯酶基序。在某些情况下，在轻链恒定区中引入硫酸酯酶基序。
[0675]
在某些情况下，在抗cd37重链恒定区的ch1区引入硫酸酯酶基序，例如，在igg1重链氨基酸序列的121-219个氨基酸中。例如，在某些情况下，在以下氨基酸序列中引入硫酸酯酶基序：astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkve(seq id no:175)。例如，在某些实施例中，将氨基酸序列galtsgvh(seq id no:176)修饰为galctpsrgvh(seq id no:177)，其中，硫酸酯酶基序为lctpsr(seq id no:178)。
[0676]
在某些情况下，在抗cd37重链c端中或附近引入硫酸酯酶基序，例如在抗cd37重链c端的1个氨基酸、2个氨基酸(aa)、3aa、4aa、5aa、6aa、7aa、8aa、9aa或10aa内引入硫酸酯酶基序。作为一个非限制性示例，抗cd37重链的c端赖氨酸残基可替换为氨基酸序列slctpsrgs(seq id no:179)。
[0677]
在某些情况下，在抗cd37抗体的轻链恒定区引入硫酸酯酶基序。作为一个非限制性示例，在某些情况下，在抗cd37抗体的轻链恒定区引入硫酸酯酶基序，其中，所述硫酸酯酶基序为kvdnal(seq id no:180)的c端或qsgnsq(seq id no:181)的n端。例如，在某些情况下，所述硫酸酯酶基序为lctpsr(seq id no:`82)，所述抗cd37轻链包含氨基酸序列kvdnallctpsrqsgnsq(seq id no:183)。
[0678]
与多肽偶联的药物
[0679]
本发明提供了药物-多肽偶联物。药物示例包括小分子药物，例如癌症化疗剂。例如，当多肽为对肿瘤细胞具有特异性的抗体(或其片段)时，所述抗体可以如本发明所述进行修饰，以包括修饰的氨基酸，所述氨基酸随后与癌症化疗剂偶联，例如微管影响剂。在某些实施例中，药物为具有抗增殖活性的微管影响剂，例如美登素类化合物。在某些实施例中，所述药物为美登素类化合物，其结构如下：
[0680][0681]
其中，表示式(i)中美登素类化合物和连接子l之间的附着点。“附着点”是指符号表示式(i)中美登素类化合物的n和连接子l之间的键。例如，在式(i)中，w1为美登素类化合物，例如上述结构中的美登素类化合物，其中，表示美登素类化合物和连接子l之间的附着点。在某些实施例中，上述美登素类化合物结构可称为脱酰基美登素。
[0682]
如上所述，在某些实施例中，l是由公式-(l1)
a-(l2)
b-(l3)
c-(l4)
d-表示的一个连接子，其中，l1、l2、l3和l4为分别独立的连接子单位。在某些实施例中，l1附着在偶联基团上，例如，肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基偶联基团(例如，如上式(i)所示)。在某些实施例中，l2(如存在)附着在w1(美登素类化合物)上。在某些实施例中，l3(如存在)附着在w1(美登素类化合物)上。在某些实施例中，l4(如存在)附着在w1(美登素类化合物)上。
[0683]
如上所述，在某些实施例中，所述连接子-(l1)
a-(l2)
b-(l3)
c-(l4)
d-由公式-(t
1-v1)
a-(t
2-v2)
b-(t
3-v3)
c-(t
4-v4)
d-表示，其中，a、b、c和d为分别独立的0或1，其中，a、b、c和d之和为1-4。在某些实施例中，如上所述，l1附着在肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基偶联基团(例如，如上式(i)所示)上。因此，在某些实施例中，t1附着在肼基-吲哚基或肼基-吡咯并-吡啶基偶联基团(例如，如上式(i)所示)上。在某些实施例中，v1附着在w1(美登素类化合物)上。在某些实施例中，如上所述，l2(如存在)附着在w1(美登素类化合物)上。因此，在某些实施例中，t2(如存在)附着在w1(美登素类化合物)上，或者v2(如存在)附着在w1(美登素类化合物)上。在某些实施例中，如上所述，l3(如存在)附着在w1(美登素类化合物)上。因此，在某些实施例中，t3(如存在)附着在w1(美登素类化合物)上，或者v3(如存在)附着在w1(美登素类化合物)上。在某些实施例中，如上所述，l4(如存在)附着在w1(美登素类化合物)上。因此，在某些实施例中，t4(如存在)附着在w1(美登素类化合物)上，或者v4(如存在)附着在w1(美登素类化合物)上。
[0684]
本发明的实施例包括多肽(例如抗cd37抗体)与一个或多个药物基团(例如美登素类化合物)偶联的偶联物，例如2个药物基团、3个药物基团、4个药物基团、5个药物基团、6个药物基团、7个药物基团、8个药物基团、9个药物基团或10个或以上药物基团。在本发明中，所述药物基团可以在多肽的一个或多个位点上与多肽偶联。在某些实施例中，所述偶联物的平均药物抗体比(dar)(摩尔比)为0.1-10、或0.5-10、或1-10，例如1-9、或1-8、或1-7、或1-6、或1-5、或1-4、或1-3、或1-2。在某些实施例中，所述偶联物的平均dar为1-2，例如1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2。在某些实施例中，所述偶联物的平均dar为1.5-2。在某些实施例中，所述偶联物的平均dar为1.75-1.85。在某些实施例中，所述偶联物的平均dar为1.8。平均是指算术平均值。
[0685]
制剂
[0686]
可以采用多种不同方式配制本发明的偶联物。一般来说，当偶联物为多肽-药物偶联物时，所述偶联物的配制方式与多肽偶联的药物、待治疗的病症和待使用的给药途径相适应。
[0687]
在某些实施例中，提供了一种包含本发明任何偶联物和可药用赋形剂的药物合成物。
[0688]
所述偶联物(例如多肽-药物偶联物)可以为任何适当的剂型，例如可药用盐的形式，并且可配制为用于任何适当给药途径，例如口服、局部或肠胃外给药。当偶联物为液体注射剂时(例如在那些静脉内给药或直接向组织给药的实施例中)，所述偶联物可以为即用剂型，或为由可药用载体和赋形剂组成的可重组的储存稳定粉末或液体。
[0689]
配制偶联物的方法可以改编自现成方法。例如，偶联物可以在药物合成物中提供，所述药物合成物包含治疗有效量的偶联物和可药用载体，例如盐水。药物合成物可选包括其他添加剂(例如，缓冲液、稳定剂、防腐剂等)。在某些实施例中，所述制剂适用于对哺乳动物给药，例如适用于向人类给药的制剂。
[0690]
治疗方法
[0691]
本发明的多肽-药物偶联物可用于治疗受试者中可通过施用母体药物(例如，与多肽偶联前的药物)进行治疗的病症或疾病。
[0692]
在某些实施例中，提供的方法包括向受试者施用有效量的本发明任何偶联物。
[0693]
在某些方面，提供了将药物传递到受试者体内靶位点的方法，所述方法包括向受试者施用药物合成物(包括本发明所述的偶联物)，其中所述施用可以在受试者靶位点上从偶联物中释放治疗有效量的药物。
[0694]“治疗”是指至少实现了与折磨宿主的病症相关的症状的改善，其中改善在广义上是指至少降低与治疗病症相关的参数幅度，例如症状。因此，治疗还包括病理状态或至少与之相关的症状得到完全抑制的情况，例如，防止发生或停止(例如终止)，从而使宿主不再遭受此病症或至少是此病症的症状折磨。因此，治疗包括：(i)预防，即降低出现临床症状的风险，包括预防疾病发展到有害状态；(ii)抑制，即阻止临床症状的发展或进一步发展，例如，减轻或完全抑制活动性疾病；和/或(iii)缓解，即使临床症状消退。
[0695]
待治疗的受试者可以是需要治疗的个体，其中待治疗的宿主是可以使用母体药物治疗的个体。因此，各种受试者可能使用本发明公开的多肽-药物偶联物进行治疗。通常，此类受试者为“哺乳动物”，其中人类是值得关注的。其他受试者可以包括家养宠物(例如，狗和猫)、家畜(例如，牛、猪、山羊、马等)、啮齿动物(例如，小鼠、豚鼠和大鼠，如疾病的动物模型)以及非人灵长类动物(例如，黑猩猩和猴子)。
[0696]
最初可以根据剂量指导和/或母体药物的给药方案来确定施用的多肽-药物偶联物量。一般来说，多肽-药物偶联物可实现结合药物的靶向递送和/或延长的血清半衰期，从而在给药方案中提供减少剂量或减少给药中的至少一种。因此，在与本发明的多肽-药物偶联物偶联之前，多肽-药物偶联物可以在给药方案中提供相对于母体药物的减少剂量和/或减少给药。
[0697]
此外，如上所述，因为多肽-药物偶联物可以实现药物递送的受控化学计量，可以根据每个多肽-药物偶联物提供的药物分子数量来计算多肽-药物偶联物的剂量。
[0698]
在某些实施例中，施用了多剂量的多肽-药物偶联物。多肽-药物偶联物的给药频
率可以根据各种因素中的任一因素而变化，例如，症状的严重程度，受试者的病症等。例如，在某些实施例中，多肽-药物偶联物每月给药一次、每月给药两次、每月给药三次、每隔一周给药、每周一次给药(qwk)、每周两次给药、每周三次给药、每周四次给药、每周五次给药、每周六次给药、每隔一天给药、每天给药(qd/od)、每天两次给药(bds/bid)或每天三次给药(tds/tid)等。
[0699]
癌症的治疗方法
[0700]
本发明提供的方法包括将本发明的偶联物递送至患有癌症的个体。这些方法可用于治疗多种癌症，包括癌、肉瘤、白血病和淋巴瘤。在癌症情况下，术语“治疗”包括以下一项或多项(例如每一项)：减少实体瘤的生长、抑制癌细胞的复制、减少整体肿瘤负荷以及改善与癌症相关的一种或多种症状。
[0701]
可使用受试方法治疗的癌包括但不限于食管癌、肝细胞癌、基底细胞癌(一种皮肤癌)、鳞状细胞癌(各种组织)、膀胱癌，包括移行细胞癌(一种膀胱恶性肿瘤)、支气管癌、结肠癌、大肠癌、胃癌、肺癌、包括肺小细胞癌和非小细胞癌、肾上腺皮质癌、甲状腺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、肾细胞癌、原位导管癌或胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞癌、胚胎性癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、成骨性癌、上皮性癌以及鼻咽癌等。
[0702]
可使用受试方法治疗的肉瘤包括但不限于纤维肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、骨原性肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤以及其他软组织肉瘤。
[0703]
可使用受试方法治疗的其他实体瘤包括但不限于胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、成神经细胞瘤和视网膜胚细胞瘤。
[0704]
可使用受试方法治疗的白血病包括但不限于a)慢性骨髓增生综合征(多潜能造血干细胞的肿瘤疾病)；b)急性髓系白血病(多潜能造血干细胞或血统潜能受限的造血细胞的肿瘤性转化)；c)慢性淋巴细胞白血病(cll；免疫不成熟和功能不全的小淋巴细胞的克隆增殖)，包括b细胞cll、t细胞cll淋巴球性白血病以及毛细胞白血病；以及d)急性淋巴细胞白血病(以成淋巴细胞聚集为特征)。可以使用受试方法治疗的淋巴瘤包括但不限于b细胞淋巴瘤(例如伯基特淋巴瘤)；霍奇金淋巴瘤；非霍奇金b细胞淋巴瘤等。
[0705]
在某些方面，提供了将药物传递到受试者体内靶位点的方法，此类方法包括向受试者施用治疗有效量的药物合成物(包括本发明所述的偶联物)，其中所述施用可以有效治疗受试者的癌症。在某些实施例中，所述癌症为恶性血液病。相关恶性血液病包括但不限于特征为恶性b细胞的恶性血液病。特征为恶性b细胞的恶性血液病的非限制性示例包括白血病(例如，慢性淋巴细胞白血病(cll))和淋巴瘤(例如，非霍奇金淋巴瘤(nhl))。当所述淋巴瘤为nhl时，在某些方面，所述nhl为复发性和/或难治性非霍奇金淋巴瘤。
[0706]
示例
[0707]
为了向本领域的普通技术人员完整公开和说明如何进行和使用本发明，提出了以下示例，这些示例并不会限制发明人所认为的发明范围，也不表示以下实验是全部或唯一进行的实验。我们努力确保所用数字的准确性(例如，数量、温度等)，但应考虑到一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则份数为重量份，分子量为重量平均分子量，温度为摄氏度，
压力为大气压或接近大气压。“平均”是指算术平均值。可以使用标准缩写，例如，bp，碱基对；kb，千碱基；pl，皮升；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；kb，千碱基；bp，碱基对；nt，核苷酸；i.m.，肌肉注射；i.p.，腹腔注射；s.c.，皮下注射等。
[0708]
一般合成过程
[0709]
有许多通用参考文献提供了用于合成本发明合成物的公认化学合成方案和条件(见smith和march，《march的高级有机化学：反应、机理与结构》，第五版，wiley-interscience出版社，2001；或vogel，《实用有机化学教材，包括定性有机分析》，第四版，纽约：朗文出版社，1978)。
[0710]
本发明所述的化合物可通过本领域已知的任何纯化方案进行纯化，包括色谱法，例如hplc、制备薄层色谱法、快速柱色谱法和离子交换色谱法。可使用任何适当的固定相，包括正相和反相以及离子树脂。在某些实施例中，公开的合成物通过硅胶和/或氧化铝色谱法纯化。见《现代液相色谱介绍》，第2版，l.r.snyder和j.j.kirkland编辑，约翰威立出版有限公司；1979；和《薄层色谱法》，e.stahl编辑，施普林格出版公司，纽约，1969。
[0711]
在制备受试化合物的任何过程中，可能需要和/或希望保护相关分子上的敏感基或反应基。这可以通过标准作业中所述的常用保护团体来实现，例如j.f.w.mcomie，《有机化学中的保护基》，普莱南出版公司，伦敦和纽约，1973；t.w.greene和p.g.m.wuts，《有机合成中的保护基》，第三版，威利出版社，纽约，1999；《多肽》，第3卷(编辑：e.gross和j.meienhofer)，学术出版社，伦敦和纽约，1981；《有机化学方法》，houben-weyl，第4版，第15/l卷，georg thieme出版社，斯图加特，1974；h.-d.jakubke和h.jescheit，《氨基酸、肽、蛋白》，化学出版社，weinheim，迪尔菲尔德海滩和巴塞尔，1982；和/或jochen lehmann，《碳水化合物化学：单糖及其衍生物》，georg thieme出版社，斯图加特，1974。可使用本领域已知的方法在适当的后续阶段去除保护基。
[0712]
可通过各种不同的合成路线使用市售起始材料和/或通过常规合成方法制备的起始材料来合成受试化合物。以下方面描述了可用于合成本发明公开的化合物的多种合成路线的示例。
[0713]
示例1
[0714]
如下所示，根据方案1合成一种含有4-氨基-哌啶(4ap)基团的连接子。
[0715]
方案1
[0716][0717]
(9h-芴-9-基)甲基4-氧代哌啶-1-羧酸盐(200)的合成
[0718]
在含有磁力搅拌棒的100ml圆底烧瓶中加入哌啶-4-酮盐酸盐(1.53g，10mmol)、芴甲氧羰酰氯(2.58g，10mmol)、碳酸钠(3.18g，30mmol)、二氧六环(20ml)和水(2ml)。反应混合物在室温下搅拌1小时。混合物用etoac(100ml)稀释并用水(1
×
100ml)提取。有机层经na2so4干燥、过滤并减压浓缩。产生的材料在真空中干燥，得到白色固体化合物200(3.05g，产率95％)。
[0719]1h nmr(cdcl3)δ7.78(d,2h,j＝7.6),7.59(d,2h,j＝7.2),7.43(t,2h,j＝7.2),7.37(t,2h,j＝7.2),4.60(d,2h,j＝6.0),4.28(t,2h,j＝6.0),3.72(br,2h),3.63(br,2h),2.39(br,2h),2.28(br,2h)。
[0720]
ms(esi)m/z：[m h]
c20h20
no3计算值322.4；发现值322.2。
[0721]
(9h-芴-9-基)甲基4-((2-(2-(3-(叔丁氧基)-3-氧代丙氧基)乙氧基)乙基)氨基)哌啶-1-羧酸盐(201)的合成
[0722]
在含有磁力搅拌棒的干燥闪烁瓶中加入哌啶酮200(642mg，2.0mmol)、h2n-peg
2-co2叔丁基(560mg，2.4mmol)、分子筛(活性粉末，500mg)和1,2-二氯乙烷(5ml)。混合物在室温下搅拌1小时。在反应混合物中加入三乙酰氧基硼氢化钠(845mg，4.0mmol)。混合物在室温下搅拌5天。产生的混合物用etoac稀释。用饱和nahco3(1
×
50ml)和卤水(1
×
50ml)冲洗有机层，在na2so4上干燥、过滤并减压浓缩，得到油状化合物201，然后继续进行，无需进一步纯化。
[0723]
13-(1-(((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)哌啶-4-基)-2,2-二甲基-4,14-二氧-3,7,10-三氧杂-13-氮杂十七烷-17-羧酸(202)的合成
[0724]
在含有磁力搅拌棒的干燥闪烁瓶中加入上一步中的n-芴甲氧羰基-哌啶-4-氨基-peg
2-co2叔丁基(201)、琥珀酸酐(270mg，2.7mmol)和二氯甲烷(5ml)。混合物在室温下搅拌18小时。在etoac和饱和nahco3之间分配反应混合物。用etoac(3x)提取水层。用hcl(1m)酸化水层，直至ph值～3。用dcm提取(3
×
)水层。组合有机层经na2so4干燥、过滤并减压浓缩。反应混合物经c18快速色谱纯化(用0.1％乙酸洗脱10-100％mecn/水)。减压浓缩含有产物的部分，然后与甲苯(3
×
50ml)共沸以去除残余乙酸，得到534mg(42％，2步)白色固体化合物202。
[0725]1h nmr(dmso-d6)δ11.96(br,1h),7.89(d,2h,j＝7.2),7.63(d,2h,j＝7.2),7.42(t,2h,j＝7.2),7.34(t,2h,j＝7.2),4.25-4.55(m,3h),3.70-4.35(m,3h),3.59(t,2h,j＝6.0),3.39(m,5h),3.35(m,3h),3.21(br,1h),2.79(br,2h),2.57(m,2h),2.42(q,4h,j＝6.0),1.49(br,3h),1.37(s,9h)。
[0726]
ms(esi)m/z：[m h]
c35h47
n2o9计算值639.3；发现值639.2。
[0727]
(2s)-1-(((14s,16s,33s,2r,4s,10e,12e,14r)-8
6-氯代-1
4-羟基-85,14-二甲氧基-33,2,7,10-四甲基-12,6-二氧-7-氮杂-1(6,4)-噁嗪类-3(2,3)-环氧类-8(1,3)-苯胺环十四烷-10,12-二亚乙基三胺-4-基)氧基)-2,3-二甲基-1,4,7-三氧-8-(哌啶-4-基)-11,14-二氧杂-3,8-二氮杂十七烷-17-羧酸(203)的合成
[0728]
向酯202(227mg，0.356mmol)、二异丙基乙胺(174μl，1.065mmol)、n-脱酰基美登素124(231mg，0.355mmol)的2ml dmf溶液中加入pyaop(185mg，0.355mmol)。溶液搅拌30分钟。在反应混合物中加入哌啶(0.5ml)，再搅拌20分钟。原反应混合物经c18反向色谱纯化(使用0-100％乙腈:水的梯度)，得到203.2mg(55％，2步)的化合物203。
[0729]
17-(叔丁基)1-((14s,16s,33s,2r,4s,10e,12e,14r)-8
6-氯代-1
4-羟基-85,14-二甲氧基-33,2,7,10-四甲基-12,6-二氧-7-氮杂-1(6,4)-噁嗪类-3(2,3)-环氧类-8(1,3)-苯胺环十四烷-10,12-二亚乙基三胺-4-基)(2s)-8-(1-(3-(2-((2-(((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)-1,2-二甲肼基)甲基)-1h-吲哚-1-基)氯丙酰)哌啶-4-基)-2,3-二甲基-4,7-二氧-11,14-二氧杂-3,8-二氮杂十七烷二酸(204)的合成
[0730]
将哌啶203(203.2mg，0.194mmol)、酯12(126.5mg，0.194mmol)、2,4,6-三甲基吡啶(77μl，0.582mmol)、hoat(26.4mg，0.194mmol)的1ml dmf溶液搅拌30分钟。原反应混合物经c18反向色谱纯化(使用0-100％乙腈:水和0.1％甲酸的梯度)，得到280.5mg(产率97％)的化合物204。
[0731]
ms(esi)m/z：[m h]
c81h106
cln8o
18
计算值1513.7；发现值1514.0。
[0732]
(2s)-8-(1-(3-(2-((2-(((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)-1,2-二甲基肼基)甲基)-1h-吲哚-1-基)氯丙酰)哌啶-4-基)-1-(((14s,16s,33s,2r,4s,10e,12e,14r)-8
6-氯代-1
4-羟基-85,14-二甲氧基-33,2,7,10-四甲基-12,6-二氧-7-氮杂-1(6,4)-噁嗪类-3(2,3)-环氧类-8(1,3)-苯胺环十四烷-10,12-二亚乙基三胺-4-基)氧基)-2,3-二甲基1,4,7-三氧-11,14-二氧杂-3,8-二氮杂十七烷-17-羧酸(205)的合成
[0733]
向化合物204(108mg，0.0714mmol)的500μl无水dcm溶液中加入357μl 1m sncl4的dcm溶液。将异质混合物搅拌1小时，然后经c18反相色谱纯化(使用0-100％乙腈:水和0.1％甲酸的梯度)，得到78.4mg(产率75％)的化合物205。
[0734]
ms(esi)m/z：[m-h]-c
77h96
cln8o
18
计算值1455.7；发现值1455.9。
氮杂十七烷-17-羧酸(212)
[0747]
在含有磁力搅拌棒的干燥闪烁瓶中加入叔丁基4-((2-(2-(3-(叔丁氧基)-3-氧代丙氧基)乙氧基)乙基)氨基)哌啶-1-羧酸盐211(220mg，0.5mmol)、琥珀酸酐(55mg，0.55mmol)、4-(二甲氨基)吡啶(5mg，0.04mmol)和二氯甲烷(3ml)。混合物在室温下搅拌24小时。反应混合物经快速色谱部分纯化(洗脱50-100％etoac/己烷)，得到117mg清油化合物212，然后继续进行，无需进一步表征。
[0748]
ms(esi)m/z：[m h]
c25h45
n2o9计算值517.6；发现值517.5。
[0749]
17-(叔丁基)1-((14s,16s,33s,2r,4s,10e,12e,14r)-8
6-氯代-1
4-羟基-85,14-二甲氧基-33,2,7,10-四甲基-12,6-二氧-7-氮杂-1(6,4)-噁嗪类-3(2,3)-环氧类-8(1,3)-苯胺环十四烷-10,12-二亚乙基三胺-4-基)(2s)-8-(1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-基)-2,3-二甲基-4,7-二氧-11,14-二氧杂-3,8-二氮杂十七烷二酸(213)的合成
[0750]
在含有磁力搅拌棒的干燥闪烁瓶中加入13-(1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-基)-2,2-二甲基-4,14-二氧-3,7,10-三氧杂-13-氮杂十七烷-17-羧酸212(55mg，0.1mmol)、n-脱酰基美登素124(65mg，0.1mmol)、hatu(43mg，0.11mmol)、dmf(1ml)和二氯甲烷(0.5ml)。混合物在室温下搅拌8小时。反应混合物经c18快速色谱直接纯化(洗脱5-100％mecn/水)，得到18mg(16％)白色薄膜化合物213。
[0751]
ms(esi)m/z：[m h]
c57h87
cln5o
17
计算值1148.6；发现值1148.7。
[0752]
(2s)-1-(((14s,16s,33s,2r,4s,10e,12e,14r)-8
6-氯代-1
4-羟基-85,14-二甲氧基-33,2,7,10-四甲基-12,6-二氧-7-氮杂-1(6,4)-噁嗪类-3(2,3)-环氧类-8(1,3)-苯胺环十四烷-10,12-二亚乙基三胺-4-基)氧基)-2,3-二甲基-1,4,7-三氧-8-(哌啶-4-基)-11,14-二氧杂-3,8-二氮杂十七烷-17-羧酸(214)的合成
[0753]
在含有磁力搅拌棒的干燥闪烁瓶中加入美登素类化合物213(31mg，0.027mmol)和二氯甲烷(1ml)。溶液冷却至0℃，然后加入四氯化锡(1.0m的二氯甲烷溶液，0.3ml，0.3mmol)。反应混合物在0℃下搅拌1小时。反应混合物经c18快速色谱直接纯化(洗脱5-100％mecn/水)，得到16mg(60％)白色固体化合物214(16mg，产率60％)。
[0754]
ms(esi)m/z：[m h]
c48h71
cln5o
15
计算值992.5；发现值992.6。
[0755]
(2s)-8-(1-(3-(2-((2-(((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)-1,2-二甲基肼基)甲基)-1h-吲哚-1-基)氯丙酰)哌啶-4-基)-1-(((14s,16s,33s,2r,4s,10e,12e,14r)-8
6-氯代-1
4-羟基-85,14-二甲氧基-33,2,7,10-四甲基-12,6-二氧-7-氮杂-1(6,4)-噁嗪类-3(2,3)-环氧类-8(1,3)-苯胺环十四烷-10,12-二亚乙基三胺-4-基)氧基)-2,3-二甲基1,4,7-三氧-11,14-二氧杂-3,8-二氮杂十七烷-17-羧酸(215)的合成
[0756]
在含有磁力搅拌棒的干燥闪烁瓶中加入美登素类化合物214(16mg，0.016mmol)、(9h-芴-9-基)甲基1,2-二甲基-2-((1-(3-氧代-3-(全氟苯氧基)丙基)-1h-吲哚-2-基)甲基)肼-1-羧酸盐(5)(13mg，0.02mmol)、dipea(8μl，0.05mmol)和dmf(1ml)。溶液在室温下搅拌18小时。反应混合物经c18快速色谱直接纯化(洗脱5-100％mecn/水)，得到18mg(77％)白色固体化合物215。
[0757]
ms(esi)m/z：[m h]
c77h98
cln8o
18
计算值1457.7；发现值1457.9。
[0758]
(2s)-1-(((14s,16s,33s,2r,4s,10e,12e,14r)-8
6-氯代-1
4-羟基-85,14-二甲氧基-33,2,7,10-四甲基-12,6-二氧-7-氮杂-1(6,4)-噁嗪类-3(2,3)-环氧类-8(1,3)-苯胺环
十四烷-10,12-二亚乙基三胺-4-基)氧基)-8-(1-(3-(2-((1,2-二甲基肼基)甲基)-1h-吲哚-1-基)氯丙酰)哌啶-4-基)-2,3-二甲基-1,4,7-三氧-11,14-二氧杂-3,8-二氮杂十七烷-17-羧酸(216)的合成
[0759]
在含有磁力搅拌棒的干燥闪烁瓶中加入美登素类化合物215(18mg，0.012mmol)、哌啶(20μl，0.02mmol)和dmf(1ml)。溶液在室温下搅拌20分钟。反应混合物经c18快速色谱直接纯化(洗脱1-60％mecn/水)，得到15mg(98％)白色固体化合物216(在本发明中也称为hips-4ap-美登素或hips-4-氨基-哌啶-美登素)。
[0760]
ms(esi)m/z：[m h]
c62h88
cln8o
16
计算值1235.6；发现值1236.0。
[0761]
示例3
[0762]
实验程序
[0763]
通则
[0764]
进行实验制备位点特异性的抗体-药物偶联物(adc)。此示例中使用的抗体包括以下重链和轻链：具有表4(seq id no:1)中规定的氨基酸序列的重链，但包括符合eu编号系统的氨基酸取代l234a和l235a；以及具有表4(seq id no:6)中规定的氨基酸序列的轻链。位点特异性adc的制备包括将甲酰甘氨酸(fgly)(一种非天然氨基酸)纳入蛋白序列中。要安装fgly(图1)，使用标准分子生物克隆技术，在抗体重链或轻链保守区的预期位置插入一个短共有序列cxpxr，其中x为丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸或甘氨酸。这种“标记”构建体是在共表达甲酰甘氨酸生成酶(fge)的细胞中重组产生的，此甲酰甘氨酸生成酶将标记内的半胱氨酸共翻译转化为fgly残基，从而产生醛官能团(在本发明中也称为醛标记)。醛官能团作为生物正交偶联的化学方法。使用肼基-异-皮克特-施彭格勒(hips)连接反应将有效载荷(例如药物，如细胞毒素(例如美登素))与fgly连接，在细胞毒素有效载荷和抗体之间形成稳定的共价c-c键。此c-c键预计对adc在循环和fcrn再循环(例如，蛋白酶、低ph值和还原剂)过程中遇到的生理相关条件是稳定的。可以在不同位置产生带有醛标记的抗体。进行实验测试在重链c端(ct)插入醛标记的效果。对通过hips连接子与美登素有效载荷偶联产生的adc进行生物物理和功能表征。
[0765]
标记抗体的克隆、表达和纯化
[0766]
使用标准分子生物技术将醛标记序列插入抗cd37抗体的重链c端(ct)。对于小规模生产，用人类fge表达构建体转染cho-s细胞，并使用fge过表达细胞池来瞬时生产抗体。对于大规模生产，使用gpex技术(catalent有限公司，新泽西州萨默塞特市)生成过表达人类fge的克隆细胞系(gpex)。然后，使用fge克隆来生成大量稳定的抗体表达细胞池。使用蛋白a色谱法在条件培养基中纯化抗体(mabselect，ge医疗保健生命科学公司，宾夕法尼亚州匹兹堡市)。急速冰冻纯化的抗体并在-80℃温度下储存备用。
[0767]
生物偶联、纯化和hplc分析
[0768]
c端醛标记的αcd37抗体(15mg/ml)与附着在hips-4ap连接子(8mol，当量药物:抗体)上的美登素有效载荷在37℃下在含有0.85％dma的20mm柠檬酸钠、50mm nacl(ph 5.5)中偶联72小时。通过切向流动过滤去除游离药物(24个透析体积)，移动到20mm柠檬酸钠、50mm nacl(ph 5.5)中。
[0769]
为了确定最终产物的药物抗体比(dar)，通过分析hic(tosoh#14947)检查adc，其中流动相a：1.5m硫酸铵、25mm磷酸钠(ph 7.0)以及流动相b：25％异丙醇、18.75mm磷酸钠
(ph 7.0)。为了确定聚集，使用分析尺寸排除色谱法(sec；tosoh#08541)分析样品，其中流动相为300mm nacl、25mm磷酸钠(ph 6.8)。
[0770]
结果
[0771]
经过修饰在重链c端(ct)含有醛标记的αcd37抗体与附着在hips-4ap连接子上的美登素有效载荷偶联。完成后，在缓冲液更换期间通过切向流动过滤去除剩余的游离药物。这些反应的产率较高，接近定量偶联效率，总产率》95％。产生的adc的药物抗体比(dar)为1.79-1.89，以单体为主。图2和3显示了由hic测定的dar和由sec测定的单体完整性的代表性adc。
[0772]
图2显示了在重链c端(ct)与附着在hips-4ap连接子的美登素有效载荷偶联的醛标记抗cd37抗体的疏水相互作用柱(hic)痕迹。图2表明由hic测定的dar为1.84。
[0773]
图3是在重链c端(ct)与附着在hips-4ap连接子的美登素有效载荷偶联的醛标记抗cd37抗体的分析尺寸排除色谱(sec)分析图。如图3所示，分析sec表明最终产物为98.2％单体。
[0774]
体外细胞毒性
[0775]
cd37阳性b细胞淋巴瘤细胞系、daudi、rl、ramos-ra、wsu-dlcl2、granta 519、bjab、dohh-2、su-dhl-4和raji获取自atcc或dsmz细胞库。细胞按供应商推荐的方式保存在培养基中。接种前24小时，传代细胞以确保对数期生长。在接种当天，将5000个细胞/孔接种到100μl正常生长培养基的96孔板上。用20μl稀释的分析物以不同浓度处理细胞，并将孔板在37℃和5％co2的环境中培养。5天后，加入100μl/孔的cell titer-glo试剂(promega)，并使用molecular devices spectramax m5读板器测量发光度。采用graphpad prism软件进行数据分析。
[0776]
结果
[0777]
抗cd37 hips-4ap-美登素偶联物对所测试的9个细胞系中的8个细胞系表现出较强的(次纳摩尔)体外细胞毒性，其活性与游离美登素的活性相当。
[0778]
图4-12分别显示了daudi、rl、ramos-ra、wsu-dlcl2、granta 519、bjab、dohh-2、su-dhl-4和raji细胞系的结果。
[0779]
异种移植研究
[0780]
dohh-2异种移植
[0781]
方法：雌性cb17/scid小鼠(8只/组)经皮下接种dohh-2细胞。当肿瘤平均达到166mm3时开始治疗，在此期间，动物经静脉注射单独载体或以1、3或10mg/kg的速率注射单剂量的抗cd37 hips-4ap-美登素偶联物。其他两个治疗组每周以10mg/kg的剂量施用抗cd37hips-4ap-美登素偶联物或偶联的同种型对照adc，共施用四次(qwk
×
4)。每周两次监测动物的体重和肿瘤大小。当肿瘤达到2000mm3时，对动物实施安乐死。
[0782]
结果：载体对照组到终点的中位时间为33天；因此，在当天计算肿瘤生长抑制(tgi％)。tgi％由以下公式定义：
[0783]
tgi(％)＝(tv
对照
组-tv
治疗
组)/tv
对照
×
100
[0784]
接受抗cd37 hips-4ap-美登素偶联物的动物在1、3和10mg/kg的单剂量下分别表现出61％、68％和95％的tgi。对于后一个剂量组，8个肿瘤中有6个表现出完全消退，其中4个肿瘤完全消退持续到研究结束(36天)。数据如图13所示。
[0785]
granta 519异种移植
[0786]
方法：雌性nod/scid小鼠(6只/组)经皮下接种granta 519细胞。当肿瘤平均达到175mm3时开始治疗，在此期间，动物经静脉注射单独载体或以10mg/kg的速率注射单剂量的抗cd37(无美登素有效载荷)或以3或10mg/kg的速率注射抗cd37 hips-4ap-美登素偶联物。每周两次监测动物的体重和肿瘤大小。当肿瘤达到2000mm3时，对动物实施安乐死。
[0787]
结果：载体对照组到终点的中位时间为24天；因此，在当天计算肿瘤生长抑制(tgi％)。tgi％由以下公式定义：
[0788]
tgi(％)＝(tv
对照
组-tv
治疗
组)/tv
对照
×
100。
[0789]
接受抗cd37 hips-4ap-美登素偶联物的动物在3和10mg/kg的单剂量下分别表现出69％和100％的tgi。对于后一个剂量组，8个肿瘤中全部表现出完全消退，所有肿瘤完全消退持续到研究结束(31天)。数据如图14所示。
[0790]
虽然本发明已参考特定实施例进行了描述，但本领域技术人员应理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对发明内容进行更改并用等同内容替代。此外，可以对本发明的内容进行大量修改，使特定情况、材料、合成物、工艺、工艺步骤或步骤适应本发明目的、精神和范围。所有此类修改应在本发明所附权利要求的范围内。