阿米诺喹及盐酸盐作为多靶点抑制剂用于肿瘤联合治疗的新用途

1.本发明涉及医药领域，具体涉及一种阿米诺喹(aminoquinol)及盐酸盐作 为多靶点抑制剂并且与其它小分子抑制剂联合用于肿瘤联合治疗的新用途。


背景技术：

2.肺癌是全球范围内发病率最高的恶性肿瘤之一，也是临床上比较严重的一种 恶性肿瘤，病死率在我国城市人口恶性肿瘤中位列第一。临床研究表明，在肺癌 病例中，大约85％都是非小细胞肺癌(non small cell lung cancer,nsclc)病例， 非小细胞肺癌主要包括鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌等。这一类癌症患者的症状 早期并不明显，患者发病存在隐匿性，因此大多数非小细胞肺癌患者在确诊的时 候就已经处于晚期，错过了最佳的治疗时机。此时只能应用放疗或化疗治疗手段 来延缓患者病情的进展，使患者生存周期尽可能延长。目前对非小细胞性肺癌的 治疗为综合治疗，主要包括手术、放化疗和靶向治疗等，但非小细胞肺癌患者5 年的生存率仍低于18％。因此，为肺癌患者寻找新的治疗方法迫在眉睫。
3.egfr(epidermal growth factor receptor)是上皮生长因子(egf)细胞增 殖和信号传导的受体。egfr表达于正常上皮细胞表面，而在一些肿瘤细胞中常 过表达，egfr的过表达和肿瘤细胞的转移、侵润、预后差有关。egfr下游的 信号转导通路主要有两条：一条是pi3k/akt/mtor通路。pi3k/akt/mtor信 号通路是参与调控细胞生长、增殖、分化、凋亡及代谢的重要信号通路，也是在 人类肿瘤中最常发生改变的信号通路之一。该通路控制着肿瘤进程中许多重要的 环节，比如细胞周期、血管生成、肿瘤耐药性，和基因组不稳定性等，因此成为 抗肿瘤治疗的重要靶点。而另一条是ras/raf/mek/erk通路。ras最常见的是 ras的激活型突变。在肿瘤中最常发现的ras突变是第十二位甘氨酸，十三位甘 氨酸或六十一位谷氨酰胺为其他氨基酸残基所取代。导致ras自身的gtp酶活 性下降，使得rasgtp不能变成rasgdp而始终处于gtp结合的状态，造成 ras-raf-mek-erk通路过度激活，从而导致细胞的过度增殖与肿瘤的发生。ras 下游的通路有cdk2,4,6通路。该通路能够调节细胞周期g1期信号通路，包括 的蛋白主要有cdk2,4,6、cyclin e、cyclind、pho-cdk2/4/6等。
4.有文献报道，阿米诺喹原是一种抗寄生虫病的药物，但是经过研究发现，其 对癌细胞有抑制作用。发现了一种阿米诺喹的新用途，通过一系列实验测试阿米 诺喹对皮肤癌细胞系a375和a431的影响。结果表明阿米诺喹为靶点cdk4/6 抑制剂，能增加a375和a431停滞在g1期的细胞数量，减少s期细胞数量； 能提高a375和a431细胞凋亡率；能抑制细胞周期g1期信号通路的cdk2、4、 6，cyclin e，cyclind，pho-cdk2/4/6蛋白表达，具有抗皮肤癌作用，因此，阿 米诺喹能用于制备治疗皮肤癌的抗癌药物。由于阿米诺喹已经是被fda注册过 的用来抗寄生虫病的药物，故能缩短后期的临床实验成本及药物开发的时间，大 大节约了开发一个新的抗癌药物的成本和时间。
5.细胞周期紊乱是恶性肿瘤形成的一个标志，细胞周期蛋白依赖性激酶 (cdks)的
激活与失活维持着细胞周期各时相有序进行。细胞周期蛋白依赖性 激酶cdk4，6是细胞周期g1期前期的关键调节因子，抑制细胞周期蛋白依赖 性激酶cdk4，6可以抑制肿瘤细胞的增生，也为一个很好的肿瘤药物靶点。所 以筛选出可抑制细胞周期蛋白依赖性激酶cdk4，6活性的药物即可抑制肿瘤细 胞的增生，发挥抗肺癌的功效。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种阿米诺喹及盐酸盐用于制备治疗肺癌药物的新 用途，以解决上述背景技术中提出的问题。
7.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
8.一种阿米诺喹及盐酸盐的新用途，所述阿米诺喹盐酸盐为多靶点抑制剂，具 有抗肺癌作用，阿米诺喹及盐酸盐用于制备治疗肺癌的抗癌药物。
9.作为本发明进一步的方案：所述阿米诺喹和阿米诺喹盐酸盐对肺癌细胞系 a549和nci-h520有抗癌效果，用9、7、5、3、1、0.3、0.1、0.03、0.01(μm/l) 浓度的阿米诺喹和阿米诺喹盐酸盐干扰肝癌细胞系a549和nci-h520进行 cck8实验检测，呈现时间为72h，显示剂量依赖性抑制a549和nci-h520增加 效果。
10.作为本发明再进一步的方案：通过流式细胞术检测5μm/l和10μm/l浓度 条件下，阿米诺喹和阿米诺喹盐酸盐干扰肺癌细胞a549和nci-h520，干扰24h 后，阿米诺喹和阿米诺喹盐酸盐增加了a549和nci-h520停滞在g1期的细胞， 呈现时间及剂量依赖性具有增加的趋势，p《0.05，随着g1期细胞数量的增加， s期细胞数量减少。
11.作为本发明再进一步的方案：通过流式细胞技术检测5μm/l和10μm/l浓 度条件下阿米诺喹和阿米诺喹盐酸盐干扰肺癌细胞a549和nci-h520后细胞凋 亡数量，呈现时间分别为48h，阿米诺喹和阿米诺喹盐酸盐增加了细胞的凋亡数 量，显示呈现时间及剂量依赖性具有增加的趋势，p《0.05。
12.作为本发明再进一步的方案：用阿米诺喹和阿米诺喹盐酸盐干扰肺癌细胞 a549和nci-h520，通过western实验检测与促细胞增殖、凋亡耐受信号通路 pi3k/akt/mtor和ras/raf/mek/erk，与细胞周期g1期信号通路cdk2/4/6 等信号通路相关蛋白的表达情况。用阿米诺喹和阿米诺喹盐酸盐干扰肺癌细胞 a549和nci-h520细胞后，对促细胞增殖、凋亡耐受信号通路的egfr、 pho-mtor、mtor、pho-akt、akt和k-ras、b-raf、c-raf、pho-mek、 mek、pho-erk、erk；对调节细胞周期g1期信号通路的cdk2、4、6，cycline、 cyclind、pho-cdk2/4/6、pho-rb、rb等蛋白表达量的变化情况进行检测。结果 显示阿米诺喹和阿米诺喹盐酸盐干扰肺癌细胞a549和nci-h520后，在a549 细胞中，akt/mtor信号通路中egfr、pho-mtor、mtor、pho-akt、akt， raf/mek/erk信号通路中c-raf、pho-mek、mek、pho-erk、erk，cdk2/4/6 信号通路中pho-cdk2/6、cdk2/4/6、cycline、cyclind1、pho-rb、rb蛋白表达 量呈现剂量依赖性下降趋势；k-ras、b-raf和pho-cdk4蛋白表达量没有明显 改变。而在nci-h520细胞中，除egfr、b-raf、cycline、cdk4/6、cyclind1 和rb蛋白表达量呈现剂量依赖性下降趋势外，其他蛋白表达量无明显变化趋势。 阿米诺喹和阿米诺喹盐酸盐对细胞增殖、周期和凋亡都具有抑制作用。
13.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过一系列实验测试阿米诺 喹和阿米诺喹盐酸盐对肺癌细胞系a549和nci-h520的影响，表明阿米诺喹和 阿米诺喹盐酸盐
为多靶点抑制剂，能增加a549和nci-h520停滞在g1期的细 胞数量，减少s期细胞数量；能提高a549和nci-h520细胞凋亡率；能抑制细 胞增殖、周期和凋亡相关通路蛋白的表达，发挥抗肺癌作用。因此，阿米诺喹盐 酸盐能用于制备治疗肺癌的抗癌药物；由于阿米诺喹已经是被fda注册过的用 来抗寄生虫病的药物，故缩短了后期的临床实验成本及药物开发的时间，大大节 约了开发一个新的抗癌药物的成本和时间。
附图说明
14.图1为本发明中不同浓度阿米诺喹和阿米诺喹盐酸盐影响肺癌细胞a549、 nci-h520、nci-h460和sk-mes-1细胞增殖曲线图。
15.图2为本发明中不同浓度条件下阿米诺喹和阿米诺喹盐酸盐影响a549和 nci-h520的细胞周期分布柱形图。
16.图3为本发明中不同浓度条件下阿米诺喹和阿米诺喹盐酸盐对a549的细胞凋亡 数量变化图。
17.图4为本发明中不同浓度条件下阿米诺喹和阿米诺喹盐酸盐抑制a549和 nci-h520中egfr、pho-mtor、mtor、pho-akt和akt蛋白表达效果图。
18.图5-9为本发明中不同浓度阿米诺喹抑制a549和nci-h520中egfr、 pho-mtor、mtor、pho-akt和akt蛋白表达柱形图。
19.图10为本发明中不同浓度条件下阿米诺喹和阿米诺喹盐酸盐抑制a549和 nci-h520中k-ras、b-raf、c-raf、pho-mek、mek、pho-erk和erk蛋 白表达效果图。
20.图11-17为本发明中不同浓度阿米诺喹抑制a549和nci-h520中k-ras、b-raf、 c-raf、pho-mek、mek、pho-erk和erk蛋白表达柱形图。
21.图18为本发明中不同浓度条件下阿米诺喹和阿米诺喹盐酸盐抑制a549和 nci-h520中pho-cdk2/4/6、cdk2/4/6、cycline、cyclind1、pho-rb和rb蛋白 表达效果图。
22.图19-28为本发明中不同浓度阿米诺喹抑制a549和nci-h520中pho-cdk2/4/6、 cdk2/4/6、cycline、cyclind1、pho-rb和rb蛋白表达柱形图。
23.图29-30为阿米诺喹与nox4抑制剂、pi3k抑制剂和mtor抑制剂的药物联合 作用。
具体实施方式
24.下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式 不限于此。
25.一种阿米诺喹及盐酸盐的新用途，所述阿米诺喹和阿米诺喹盐酸盐为多靶点 抑制剂，具有抗肺癌作用，阿米诺喹及盐酸盐用于制备治疗肺癌的抗癌药物，该 新用途的具体实验如下。
26.实施例1：
27.用cck8试验检测阿米诺喹和阿米诺喹盐酸盐对肺癌细胞系a549(肺腺癌) 和nci-h520(肺鳞癌)的抗癌效果。刚复苏的肺癌细胞(a549，nci-h520)， 培养1～2代之后，培养至60-80％左右密度，传入96孔板中，4000每孔种细胞， 每孔100μl培养基，每组做4个重复，此时用含0.125％fbs的培养基(50ml1640/dmem基础培养基 62.5μl fbs 500μl青链霉素双抗)饥饿处理24h。处 理24h后，换成正常的完全培养基，并分别加入9、7、5、3、1、0.3、0.1、
0.03、 0.01、0(μm/l)的阿米诺喹和阿米诺喹盐酸盐，药物处理72h。
28.培养72h后，使用cck-8试剂盒进行实验，放入多功能酶标仪进行检测， 观察其od450的吸光值用于检测细胞药物敏感性实验，将数据统计汇表。所有 实验平行重复三次。用graphpad prime 8软件计算出其ic50值，其中a549细胞 阿米诺喹处理后ic50为4.060μm/l，阿米诺喹盐酸盐处理后ic50为3.657μm/l； nci-h520细胞阿米诺喹处理后ic50为4.823μm/l，阿米诺喹盐酸盐处理后ic50 为4.310μm/l。阿米诺喹和阿米诺喹盐酸盐干扰肺癌细胞系a549和nci-h520 的cck8实验检测结果表明，呈现时间(72h)及剂量(0、0.01、0.03、0.1、0.3、 1、3、5、7、9μm/l)依赖性抑制增加效果，阿米诺喹盐酸盐与阿米诺喹的抑制 效果相当。如图1所示。
29.实施例2：
30.为了观察阿米诺喹和阿米诺喹盐酸盐对肺癌细胞的抑制效果，进行了细胞周 期的检测：
31.1)细胞前处理。细胞(a549，nci-h520)培养至70-80％左右密度，传入 6孔板中，此时培养基用含0.125％fbs的饥饿培养基，按照a549细胞16万/孔， nci-h520细胞14万/孔种细胞，饥饿处理24h后，换成正常的完全培养基并分 别加入0μm、5μm、10μm的阿米诺喹和阿米诺喹盐酸盐处理48h。
32.2)收集细胞。处理48h之后，消化细胞计数，取1
×
106细胞，预冷的pbs 洗涤2次(2000rpm，5min离心)，加入500μl的70％乙醇，于4℃固定至少 12h。
33.3)流式细胞仪分析。
①
计算所需要的染色工作液体积，每样本500μl工作 液孵育；临用前将rnase a：pi工作液按1：9体积配制成染色工作液。
②
2000rpm， 5min离心收集细胞后，用500μl pbs洗细胞除去乙醇。
③
加入提前配制好的 500μl pi/rnase a染色工作液，室温避光30-60min。
④
上机检测，记录激发波长 488nm处红色荧光。
34.通过用流式细胞术检测在不同浓度条件下(0、5、10μm/l)的阿米诺喹和阿 米诺喹盐酸盐，干扰肺癌细胞a549和nci-h520后细胞周期分布情况。对于a549 细胞，与对照组相比阿米诺喹和阿米诺喹盐酸盐大大的增加了停滞在g1期的细 胞，且呈现剂量依赖性增加的趋势(p《0.05)，同时结果显示，随着g1期细胞 数量的增加同时伴随着s和g2期细胞数量的减少；而nci-h520细胞无明显变 化。如图2所示。
35.实施例3：
36.为了观察阿米诺喹和阿米诺喹盐酸盐对肺癌细胞的抑制效果，进行了细胞凋 亡的检测：
37.1)细胞前处理。细胞(a549，nci-h520)培养至70-80％左右密度，传入 6孔板中，此时培养基用含0.125％fbs的饥饿培养基，按照a549细胞16万/孔， nci-h520细胞14万/孔种细胞，在37℃、5％co2培养箱中饥饿处理24h后，换 成正常的完全培养基并分别加入0、5、10μm的阿米诺喹和阿米诺喹盐酸盐处理 72h。
38.2)流式细胞仪检测。消化细胞(收集上清)，计数，取1
×
106细胞至1.5mlep管中。预冷的pbs洗涤2次(1000rpm，5min离心)。加入100μl 1
×
annexinv buffer重悬细胞。设置阴性组(即只有细胞，未做任何处理)，单标fitc组 (加5μl fitc染料)，单标pi组(加5μl pi染料)，实验组(加入5μl fitc 5μlpi)。室温避光15min，加入400μl buffer混匀，避光待测。用flowjo软件对 得到的结果进行分析。
39.通过流式细胞技术检测0、5、10(μm/l)浓度条件下，阿米诺喹和阿米诺 喹盐酸盐干扰肺癌细胞a549和nci-h520后细胞凋亡数量，呈现时间为72h。 实验结果表明，与未处理组相较，阿米诺喹和阿米诺喹盐酸盐处理组都能大大的 增加细胞的凋亡数量，且呈剂量(0μm/l、5μm/l、10μm/l)依赖性增加的趋势 (p《0.05)；而且阿米诺喹盐酸盐和阿米诺喹原药的促肺癌细胞凋亡效果相当；阿 米诺喹盐酸盐和阿米诺喹处理之后，a549(肺腺癌)细胞比nci-h520(肺鳞癌) 细胞凋亡程度更高，说明a549细胞比nci-h520细胞对阿米诺喹药物更敏感。
40.如图3所示。
41.实施例4：
42.用阿米诺喹和阿米诺喹盐酸盐干扰肺癌细胞a549和nci-h520，通过 western bloting实验检测akt/mtor信号通路、raf/mek/erk信号通路、 cdk2/4/6信号通路蛋白表达情况。阿米诺喹和阿米诺喹盐酸盐干扰肺癌细胞 a549和nci-h520细胞后，观察各信号通路的egfr、pho-mtor、mtor、 pho-akt、akt；k-ras、b-raf、c-raf、pho-mek、mek、pho-erk、erk； pho-cdk2/4/6、cdk2/4/6、cycline、cyclind1、pho-rb、rb等蛋白表达量的变 化情况。具体实验步骤如下：
43.1)提取细胞总蛋白
44.2)sds-page电泳
45.3)半干式转膜
46.4)免疫印迹，检验marker是否已转至膜上(或丽春红染色)以判定转膜效 果。转膜结束，tbst清洗膜后，5％脱脂奶粉(tbst配制)室温摇动2h。裁膜， 加一抗多克隆抗体(1:1000)，4℃封闭过夜。tbst漂洗3次，每次10min。加二 抗(1:5000)，室温摇动1h。tbst漂洗3次，每次10min。
47.5)ecl检测
48.6)结果分析：阿米诺喹和阿米诺喹盐酸盐干扰肺癌细胞a549和nci-h520 后，在a549细胞中，akt/mtor信号通路中egfr、pho-mtor、mtor、 pho-akt、akt，raf/mek/erk信号通路中c-raf、pho-mek、mek、pho-erk、 erk，cdk2/4/6信号通路中pho-cdk2/6、cdk2/4/6、cycline、cyclind1、pho-rb 和rb蛋白表达量呈现剂量依赖性下降趋势；k-ras、b-raf和pho-cdk4蛋白 表达量没有明显改变。而在nci-h520细胞中，除egfr、b-raf、cycline、cdk4/6、 cyclind1和rb蛋白表达量呈现剂量依赖性下降趋势外，其他蛋白表达量无明显 变化趋势。如图4-28所示。
49.以上实验表明，阿米诺喹和阿米诺喹盐酸盐对egfr信号通路和cdk信号 通路都具有抑制作用，而且两者的抑制效果相当。对肺腺癌细胞系a549抑制效 果更明显，而对肺鳞癌nci-h520细胞系中，只有部分蛋白具有抑制效果。阿米 诺喹和阿米诺喹盐酸盐都有强烈的抗肺癌作用，而与阿米诺喹原药相比，阿米诺 喹盐酸盐溶解性更好，因此阿米诺喹盐酸盐能用于制备治疗肺癌的抗癌药物。由 于阿米诺喹已经是被fda注册过的用来抗寄生虫病的药物，因此大大缩短了后 期的临床实验成本及药物开发时间，节约了开发一个新的抗癌药物的成本和时 间，其应用意义显著。
50.上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施 方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗 旨的前提下
做出各种变化。