一种一步式多段DNA分子拼接的方法、试剂盒及其应用与流程

一种一步式多段dna分子拼接的方法、试剂盒及其应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，涉及一种一步式多段dna分子拼接的方法、试剂盒及其应用。


背景技术：

2.dna拼接技术是当今生物学基因克隆研究当中最重要的技术方法之一，绝大部分的现代分子生物学与细胞生物学都基于此项技术。上个世纪70年代，cohen等研究者设计了第一个重组dna分子，现主流的dna拼接方法仍然基于原始的酶切连接克隆方法，此方法拥有完善的操作体系，涉及到多种生物技术方法，诸如引物设计、pcr、限制性内切酶酶切、连接转化等。当实际实验步骤过多的时候，对每一步的准确性控制考验每位从业人员，增加了一定的操作难度，这种传统的方法无法满足当今集中化、规模化复杂多样的技术应用要求；例如当小片段基因载体构建时，小片段通过pcr技术制备比较困难，酶切也易出现星星活性，尤其是在酶切回收后易出现粘性末端被降解等情况，所以需要采取小片段退火到载体上的办法避免这些常见问题。
3.基于上述实际规模化的需求，众多强大的dna组装技术不断产生。现有技术利用ii型限制性内切酶先得到合适的dna片段再酶切连接克隆的策略虽好，但由于酶切位点选择有限，在遇到基因克隆表达载体中多片段拼接组装成不同大小的dna片段时，虽然在设计引物时已将限制性内切酶位点序列设计在功能性dna序列两端，以大大降低拼接组装工作后期的复杂程度，但仍存在如下问题：如在平行无缝克隆或多段dna片段组装方面通量低，一次操作只能拼接两条互补序列，如果要进行多个片段的拼接就要用多轮实验来实现，费时、费力，效率低。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术存在的上述缺陷，本发明提供了一种一步式多段dna分子拼接的方法,所述方法包括以下步骤：将待拼接的dna片段f1···fn
、多聚核苷酸激酶和反应缓冲液混合形成混合物，然后将所述混合物进行梯度pcr反应，一步反应获得完整拼接的目标dna；
5.其中，所述反应缓冲液中含有dtt(二硫苏糖醇)；
6.所述待拼接的dna片段f1···fn
中，n表示待拼接的dna片段总数量；fn表示最后一个待拼接的dna片段；fm表示第m个待拼接的dna片段；1《m≤n，2≤n≤20，且m、n均为整数；
7.所述dna片段fm的正义链与dna片段f
m-1
的反义链具有一段重叠的反向互补序列；
8.所述dna片段fm的反义链与dna片段f
m 1
的正义链具有一段重叠的反向互补序列。
9.在一些实施方案中，所述dtt的浓度为8-10mm；优选地，为9mm。
10.在一些实施方案中，所述反应缓冲液还包含变性缓冲液和/或连接缓冲液。
11.在一些实施方案中，所述变性缓冲液中包含edta、c6h5na3o7和na

，所述变性缓冲液的ph值为6-8；优选地，为7.5。
12.所述edta的浓度为1-2mm；优选地，为1.8mm；
13.所述c6h5na3o7的浓度为200-600mm；优选地，为400mm；
14.所述na

的浓度为3-5m；优选地，为4m；
15.在一些实施方案中，所述连接缓冲液中包含mg
2
，所述连接缓冲液的ph值为6-8；优选地，为7.5。
16.所述mg
2
的浓度为8-15mm；优选地，为10mm。
17.在一些实施方案中，所述梯度pcr反应包括以下条件：65～100℃，0-10min高温变性、30-65℃，0-40min退火、4℃保存；优选地，为96℃，5min高温变性、37℃，30min退火、4℃保存。
18.在一些实施方案中，所述重叠的反向互补序列的长度为3-15bp；优选地，为4-10bp；更优选地，为4bp。
19.在一些实施方案中，所述待拼接的dna片段f1···fn
各单链的加入浓度相同，优选地，为0.01-0.03nmol/μl；更优选地，为0.02nmol/μl。
20.在一些实施方案中，所述待拼接的dna片段f1···fn
中，n为待拼接的dna片段总数量，2≤n≤20；优选地，为2≤n≤10；更优选地，为2≤n≤4。
21.在一些实施方案中，所述待拼接的dna片段f1···fn
各单链序列长度为50-120bp；优选地，为80-100bp。
22.本发明方法中采用所述的缓冲液及梯度pcr反应条件，二者协同作用，既可以显著提高多聚核苷酸激酶与待拼接dna片段f1···fn
的结合，进而提高反应效率；又能有效提高一步多段退火的成功率。
23.具体地，本发明所述一步式多段dna分子拼接的方法，包括以下步骤：将待拼接dna片段f1···fn
、多聚核苷酸激酶和反应缓冲液混合形成混合物，然后将所述混合物进行梯度pcr反应获得完整拼接的目标dna。
24.本发明所述方法的反应原理如下：
25.(1)在pcr特定温度环境下，化学合成的两条部分互补的寡核苷酸单链退火，然后延伸形成完整的小双链dna分子，与此同时多聚核苷酸激酶对单链或双链待拼接dna片段f1···fn
的5'末端进行磷酸化，对3'末端进行去磷酸化。
26.(2)本发明方法中，所述反应缓冲液中含有tris-hcl、nacl、c6h5na3o7、edta、mgcl2和dtt，dtt是一种还原剂(中文名为二硫苏糖醇，分子式为c4h
10
o2s2，分子量为154.25)，可以避免酶在高温时被氧化，保证酶在高温反应下的稳定性，实现了变性退火、5'端磷酸化以及拼接技术的整合，实现对多段dna分子片段的一步式拼接(本发明所述一步式多段dna分子拼接法的反应过程原理图具体见图1)。
27.在本发明方法中，dtt的具体作用机制：在dna层面，dtt可作为巯基化dna的还原剂和去保护剂，即抗氧化作用；原因是巯基化dna末端硫原子在液体环境中更趋于形成二聚体，特别是在存在可溶性氧气的环境下，这种二聚体的形成大大降低了诸如dna的生物偶联反应效率；所以在dna溶液中加入dtt，可以降低dna二聚体的形成趋势；在反应混合物中加入一定量的dtt，即可避免单条退火引物二聚体化，让引物彼此退火顺利进行。
28.与此同时，dtt也拥有阻止蛋白质中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间二硫键的功能，即，在蛋白质层面，dtt能够保护二硫键的还原性，即酶分子上的还原性
基团，维持还原性环境，稳定酶的活性；同时dtt还有一定rna酶抑制剂能力，具有抑制rna酶活性的作用。
29.本发明所述一步式多段dna分子拼接的方法中，所用的多聚核苷酸激酶可实现单链或双链目标dna片段的5'末端磷酸化，亦对3'末端进行去磷酸化。任何具有所述功能的多聚核苷酸激酶都可用于本发明，其多聚核苷酸激酶的种类不作具体限定，优选使用金斯瑞或neb公司生产的t4多聚核苷酸激酶(t4 polynucleotide kinase，t4 pnk酶)。
30.本发明创新性地构建一步式多段dna分子拼接的方法，所述方法利用dtt的化学特性结合特异性的pcr温控程序，在实现一步到位的统一操作上，克服了现有技术需要多段dna片段分步操作(如两种反应体系及两种不同温控程序(65～100℃，0-10min高温变性、30-65℃，0-40min退火、4℃保存))带来的不便和可能因反复操作引入的污染导致实验失败的问题。
31.本发明还提供了一种一步式多段dna分子拼接的试剂盒，所述试剂盒包括多聚核苷酸激酶和反应缓冲液，所述反应缓冲液包含dtt。
32.进一步地，所述多聚核苷酸激酶为t4多聚核苷酸激酶，其浓度为8-15units/μl；优选地，为10units/μl。
33.所述dtt的浓度为8-10mm；优选地，为9mm。
34.其中，所述反应缓冲液还包含变性缓冲液和/或连接缓冲液。
35.其中，所述变性缓冲液中包含edta、c6h5na3o7和na

，所述反应缓冲液的ph值为6-8；优选地，为7.5。
36.所述edta的浓度为1-2mm；优选地，为1.8mm。
37.所述c6h5na3o7的浓度为200-600mm；优选地，为400mm。
38.所述na

的浓度为3-5m；优选地，为4m。
39.其中，所述连接缓冲液中包含mg
2
，所述反应缓冲液的ph值为6-8；优选地，为7.5。
40.所述mg
2
的浓度为8-15mm；优选地，为10mm。
41.其中，所述多聚核苷酸激酶对待拼接dna片段f1···fn
的5'末端进行磷酸化，对3'末端进行去磷酸化。
42.所述待拼接的dna片段f1···fn
中，n表示待拼接的dna片段总数量；fn表示最后一个待拼接的dna片段；fm表示第m个待拼接的dna片段；1《m≤n，2≤n≤20，且m、n均为整数；
43.所述待拼接dna片段fm的正义链与dna片段f
m-1
的反义链具有一段重叠的反向互补序列；
44.所述待拼接dna片段fm的反义链与dna片段f
m 1
的正义链具有一段重叠的反向互补序列。
45.所述待拼接dna片段f1···fn
各单链的加入浓度相同，优选地，为0.01-0.03nmol/μl；更优选地，为0.02nmol/μl。
46.所述待拼接的dna片段f1···fn
各单链长度为50-120bp；优选地，为80-100bp。
47.所述待拼接的dna片段f1···fn
中，n为待拼接的dna片段总数量，2≤n≤20；优选地，为2≤n≤10；更优选地，为2≤n≤4。
48.所述重叠的反向互补序列的长度为3-15bp；优选地，为4-10bp；更优选地，为4bp。
49.本发明还提供了上述方法或试剂盒在基因合成中的应用。
50.其中，所述基因包括普通基因和难度基因。
51.所述难度基因包括反向重复导致的发夹结构、高低gc序列和/或poly结构等pcr难以扩增而导致的合成低效的基因。
52.本发明中，难度基因是指：指基因序列中含有但不限于反向重复导致的发夹结构、高低gc序列或poly结构等pcr难以扩增而导致的合成低效的基因。
53.本发明中，反向互补是指：指通过碱基配对原则关联的核苷酸序列。例如，序列“5
’‑
a-t-g-3
’”
与序列“5
’‑
c-a-t-3
’”
反向互补。
54.本发明中，正义链(sense strand)和反义链(antisense strand)是指：指两条互补的dna中一套携带编号蛋白质信息的链称为正义链，其与rna序列相同。另一条与之互补的链称为反义链。正义链本身不一定具有生物学活性，其重要功能之一是稳定反义链或防止其降解。在本发明中“正义链”和“反义链”仅仅是指dna片段的两条互补链，无关核酸的序列或功能。正义链和反义链不完全重叠，在其5'端处具有3-15个(优选4、5、6、7、8、9或10个)额外的碱基，从而形成粘性末端。因此，在相应的反义链中，5'端的3-15个(优选4、5、6、7、8、9或10个)碱基同样不具有反向互补碱基，也形成粘性末端；更优选地，正义链的前4个碱基形成粘性末端，在其反义链中不具有互补碱基。在本发明中当后一个待拼接的dna片段的正义链与前一个待拼接的dna片段的反义链粘性末端具有4、5、6、7、8、9或10个(优选4个)碱基的重叠，所述正义链和反义链可以退火以形成双链dna。
55.相比于现有技术，本发明的有益效果在于：dna片段的磷酸化和拼接步骤在一个反应体系中完成，一步完成多段dna分子的拼接反应，避免了使用磷酸化引物造成的高昂成本和分步操作可能引入的污染；不引入多余核苷酸，降低从业人员操作成本；高效的多片段拼接能力；被拼接的dna片段末端不引入其它核苷酸，且自带粘性末端；相比现有的两步操作流程，本发明的方法可减少一半的加样操作，操作效率增加50％，且无需补水；在pcr仪上设置一次性退火程序即可，且pcr温控程序时间减少5min，反应所需时长减少12.5％；充分利用buffer中含有防止酶被高温氧化的dtt，克服了高温对引物退火、引物磷酸化以及连接整合的技术瓶颈；不仅能用于普通基因的合成，同样可解决引物因反向重复，高低gc、含poly序列等pcr不能解决的扩增问题，对无法通过pcr技术完成的难度基因的拼接具有应用价值；多段dna拼接成功率可以达到90％以上，实现真正意义上的多快好省。
附图说明
56.图1为本发明一步式多段dna分子拼接的方法的反应过程原理图。
57.图2和3分别为实施例1中利用不同退火温度进行基因拼接获得的连接产物转化子的平板图。
58.图4为实施例1中利用不同退火温度进行基因拼接获得的连接产物电泳图；1-8：退火温度为95℃。
59.图5为实施例2中方案c现有技术两步法多段dna分子拼接法lb平板长斑图。
60.图6为实施例2中方案d一步式多段dna分子拼接法lb平板长斑图。
61.图7为实施例2中方案c和方案d获得的连接产物电泳图。
62.图8为实施例3中方案e现有技术两步法多段dna分子拼接法lb平板长斑图。
63.图9为实施例3方案f一步式多段dna分子拼接法lb平板长斑图。
64.图10为实施例3中方案e和方案f获得的连接产物电泳图。
65.图11为实施例4中方案g现有技术两步法多段dna分子拼接法lb平板长斑图。
66.图12为实施例4中方案h一步式多段dna分子拼接法lb平板长斑图。
67.图13为实施例4中方案g和方案h获得的连接产物电泳图。
具体实施方式
68.下面将结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤、条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若无特别说明，实施例中所用的实验方法均为本领域技术人员所熟知的常规方法和技术，试剂或材料均为通过商业途径得到。
69.实验设计
70.首先对本发明提出的一步式多段dna分子拼接方法中的退火温度进行优化设计实验，确定最佳优化退化温度；其次，设计对比实验：将本发明提出的一步式多段dna分子拼接的方法与现有技术两步法多段dna分子拼接方法在基因克隆成功率上的比较。
71.实施例1：本发明一步式多段dna分子拼接的方法中退火温度的优化
72.实验材料：
73.选择3段含有明显反向重复和高gc的双链dna序列f1、f2、f3(每段dna包含正义链和反义链两条序列，共6条序列)、10units/μlt4 pnk；
74.柠檬酸盐缓冲液(即20
×
ssc buffer)组分：
75.12mm tris-hcl、4m nacl、400mm c6h5na3o7、1.8mm edta，ph 7.5；
76.t4多聚核苷酸激酶的缓冲液(t4 pnkbuffer)组分：
77.70mm tris-hcl、10mm mgcl2、9mm dtt，ph 7.5；
78.其中：tris起到ph缓冲作用，dtt起到防止t4激酶被高温氧化的作用，而盐离子对于dna双链的形成是必要的。
79.实验操作：按照表2至上向下的顺序依次吸取2μl的6条0.02nmol/μl待拼接的dna序列(序列信息如下表1)、20
×
ssc buffer、10
×
t4 pnk buffer、10units/μl的t4 pnk酶分加入到0.2ml的pcr管中后涡旋混匀，在thermal cycler 2720pcr仪上分别设置96℃5min、37℃30min、4℃保存(方案a)和65℃5min、37℃30min、4℃保存(方案b)反应程序。
80.表1
81.[0082][0083]
表2
[0084]
待拼接序列各2μl20
×
ssc2μl10
×
t4 pnk buffer2μl10units/μl t4 pnk酶2μl总反应体系18μl
[0085]
实验结果：从lb平板长斑情况、菌检阳性数(检测胶图)、测序得到克隆成功数三个角度判定这两种pcr程序的优劣：
[0086]
(1)lb平板长斑情况：从转化后37℃培养的菌落来看，长斑个数情况几乎一致，用平板菌落计数法得到每块平板长斑个数维持在200～300，长斑情况无显著差异(如图2和3)。
[0087]
(2)菌检阳性数：从随机挑取的8个单克隆菌落，利用菌落pcr方法扩增目的序列，方案a菌检阳性个数(正确扩增条带大小)有7个(如图4，marker左侧300bp左右条带)，而方案b只有3个(如图4，marker右侧300bp左右条带)。
[0088]
(3)测序得到克隆成功数：方案a测序得到的克隆成功数为7个，而方案b只有1个。
[0089]
实验结论：通过比较方案a及方案b的实验结果可知，多段退火程序温度，96℃的高温相对65℃在克隆成功数方面具有显著优势(除了温度梯度程序不同，其余实验材料和方法均相同)，因此，本发明一步式多段dna分子拼接的方法中具体pcr梯度温度条件可以是高温变性:96℃，5min、然后缓慢降温退火：37℃，30min，这一步缓慢降温对形成正确的结构是非常有帮助的，降温过快将导致错误高级结构的产生，最终4℃保存，得到完整拼接的含有明显的反向重复和高gc的目标dna。原因分析是高温环境下，利于单条退火引物打开发夹结构，更利于退火引物彼此拼接成功，两步的温度梯度调节足以满足高效的多段退火引物一步拼接需求。
[0090]
实施例2：本发明一步式多段dna分子拼接法与现有技术两步法多段dna分子拼接法在含有明显反向重复dna片段拼接成功率上的优劣比较
[0091]
实验材料：
[0092]
选择3段含有明显反向重复的双链dna片段f4、f5、f6(每段dna包含正义链和反义链两条序列，共6条序列)、10units/μl的t4 pnk；
[0093]
20
×
ssc buffer和t4 pnkbuffer组分同实施例1；
[0094]
实验操作：
[0095]
现有技术中两步法多段dna分子拼接法为：步骤一：碱基彼此互补配对的dna片段在缓冲液20
×
ssc buffer和96℃的高温环境下(pcr仪温控模块)依次经历解链，维持10min后降温至4℃导致碱基彼此互补配对的dna片段依靠氢键的力量互补配对在一起形成带有黏性末端的双链dna片段；步骤二：将步骤一完成的彼此独立的双链dna片段分别取2μl，随即加入10
×
t4 pnkbuffer和10units/μl的t4 pnk酶各2μl，最终补水至20μl；将此混合物放入pcr仪，设置进行37℃，持续30min后4℃保存，此时完成引物磷酸化和拼接步骤(方案c)。
[0096]
本发明一步式多段dna分子拼接法：按照表4至上向下的顺序依次吸取2μl的6条0.02nmol/μl待拼接的dna序列(序列信息如下表3)，20
×
ssc buffer、10
×
t4 pnk buffer、10units/μl的t4 pnk酶加入到0.2ml的pcr管中后涡旋混匀，在同款pcr仪器上分别设置96℃5min、37℃30min、4℃保存(方案d)。
[0097]
表3
[0098][0099][0100]
表4
[0101]
待拼接的dna序列2μl20
×
ssc2μl10
×
t4 pnk buffer2μl10units/μl t4 pnk酶2μl总反应体系18μl
[0102]
实验结果：从lb平板长斑情况、菌检阳性数(检测胶图)、测序得到克隆成功数三个角度判定这两种方案的优劣：
[0103]
(1)lb平板长斑情况：转化后37℃培养的平板菌落，使用平板菌落计数法对方案c得到的平板长斑个数统计得出在300-400之间，而方案d得到的每块平板长斑个数维持在
200～300之间，长斑情况方案c(如图5)明显多于方案d(如图6)。
[0104]
(2)菌检阳性数：从随机挑取的8个单克隆菌落，利用菌落pcr方法扩增目的序列，方案c菌检阳性数(正确扩增条带大小)为7个(如图7，marker左侧300bp左右条带)，方案d维持8个(如图7，marker右侧300bp左右条带)，无显著差别。
[0105]
(3)测序得到克隆成功数：方案c克隆成功数为7，方案d亦可达到8个，几乎无差别。
[0106]
实验结论：由实验结果可知，c、d两种方案在菌检阳性数、测序得到克隆成功数方面几乎无差别，但是方案d在长斑个数方面少于方案c，上述实验结果说明，在能保证几乎无差别的菌检阳性数和测序得到克隆成功数的前提下，本发明一步式多段dna分子拼接方法(方案d)能最大程度的控制单克隆菌落数，易于挑取单克隆菌落，操作上相对现有技术(方案c)得到的平板较友好。且进一步证明采用本发明的一步式多段dna分子拼接方法能够得到完整拼接的含有明显的反向重复和高gc的目标双链dna。
[0107]
实施例3：本发明一步式多段dna分子拼接法与现有技术两步法多段dna分子拼接法在高gc且为poly结构的dna片段拼接成功率上的优劣比较
[0108]
实验材料：
[0109]
选择3段含有高gc且为poly结构的双链dna片段f7、f8、f9(每段dna包含正义链和反义链两条序列，共6条序列，序列信息见下表5)、10units/μl的t4 pnk酶；
[0110]
20
×
ssc buffer和t4 pnkbuffer组分同实施例1；
[0111]
实验操作：
[0112]
现有技术两步法多段dna分子拼接法(方案e)和本发明一步式多段dna分子拼接法(方案f)的实验操作同实施例2；
[0113]
表5
[0114][0115]
表6
[0116]
待拼接序列2μl20
×
ssc2μl
10
×
t4 pnk buffer2μl10units/μl t4 pnk酶2μl总反应体系18μl
[0117]
实验结果：
[0118]
从lb平板长斑情况、菌检阳性数(检测胶图)、测序得到克隆成功数三个角度判定两种方案对高gc且poly结构的序列的优劣：
[0119]
(1)lb平板长斑情况：转化后37℃培养的平板菌落，使用平板菌落计数法对方案e得到的平板长斑个数统计得出在100-200之间，而方案f得到的每块平板长斑个数维持在40-70之间(如下图8和图9)。
[0120]
(2)菌检阳性数：从随机挑取的8个单克隆菌落，利用菌落pcr方法扩增目的序列，方案e菌检阳性数(正确扩增条带大小)为6个(如图10，marker左侧300bp左右条带)，方案f维持8个(如图10，marker右侧300bp左右条带)，说明使用本发明所述的一步式多段dna分子拼接方案更有优势。
[0121]
(3)测序得到克隆成功数：方案e克隆成功数为5，方案f克隆成功数可达到7个，说明本发明一步式拼接高gc且为poly结构序列比现有技术两步法拼接方案在阳性率和正确克隆方面有优势。
[0122]
实验结论：由实验结果可知，方案f在菌检阳性数、测序得到克隆成功数方面均优于方案e，说明采用本发明的一步式多段dna分子拼接方法能够得到完整拼接的含有高gc且为poly结构的目标双链dna。
[0123]
实施例4：本发明一步式多段dna分子拼接法与现有技术两步法多段dna分子拼接法在低gc且为poly结构的dna片段拼接成功率上的优劣比较
[0124]
实验材料：
[0125]
选择2段含有低gc且为poly结构的双链dna片段f10、f11(每段dna包含正义链和反义链两条序列，共4条序列，序列信息见下表7)、10units/μl的t4 pnk酶；
[0126]
20
×
ssc buffer和t4 pnkbuffer组分同实施例1；
[0127]
实验操作：
[0128]
现有技术两步法多段dna分子拼接法(方案g)和本发明一步式多段dna分子拼接法(方案h)实验操作同实施例2；
[0129]
表7
[0130]
[0131][0132]
表8
[0133]
待拼接序列2μl20
×
ssc2μl10
×
t4 pnk buffer2μl10units/μl t4 pnk酶2μl总反应体系14μl
[0134]
实验结果：
[0135]
从lb平板长斑情况、菌检阳性数(检测胶图)、测序得到克隆成功数三个角度判定两种方案对低gc且为poly结构的序列的优劣：
[0136]
(1)lb平板长斑情况：转化后37℃培养的平板菌落，使用平板菌落计数法对方案g得到的平板长斑个数统计得出在300-400之间，而方案h得到的每块平板长斑个数维持在200～300之间，长斑情况方案g(如图11)明显多于方案h(如图12)。
[0137]
(2)菌检阳性数：从随机挑取的8个单克隆菌落，利用菌落pcr方法扩增目的序列，方案g菌检阳性数(正确扩增条带大小)为8个(如图13，marker左侧200bp左右条带)，方案h维持8个(如图13，marker右侧300bp左右条带)，无显著差别。
[0138]
(3)测序得到克隆成功数：方案g克隆成功数为8，方案h亦可达到8个，几乎无差别。
[0139]
实验结论：由实验结果可知，g、h两种方案在菌检阳性数、测序得到克隆成功数方面几乎无差别，但是方案h在长斑个数方面少于方案g，上述实验结果说明，在能保证几乎无差别的菌检阳性数和测序得到克隆成功数的前提下，本发明一步式多段dna分子拼接方法(方案h)能最大程度的控制单克隆菌落数，易于挑取单克隆菌落，操作上相对现有技术(方案g)得到的平板较友好。且进一步证明采用本发明的一步式多段dna分子拼接方法能够得到完整拼接的含有低gc且为poly结构的目标双链dna。
[0140]
综上所述：本发明实施例2、实施例3和实施例4中使用的含有明显的反向重复或高低gc且为poly结构的序列的难度基因，虽然可通过化学方法合成，但无法利用pcr扩增技术让这些难度基因dna序列拼接成正常且完整的dna双链，而使用本发明的一步式多段dna分子拼接方法，对上述含有反向重复或高低gc且为poly序列的难度基因进行一步式的引物退火、引物磷酸化以及连接整合过程，后续通过连接载体、转化、菌检及测序步骤可得到完整的dna并验证上述序列是正确无误的；特别是在针对高gc且为poly结构序列的拼接，本发明一步式多段dna分子拼接方法相对现有技术两步法拼接在阳性率和正确克隆方面有明显优势。
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本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保
护范围。