生产多胺缀合物的酵母的制作方法

1.本发明总体涉及遗传工程化酵母，并且特别涉及能够生产多胺缀合物的这类酵母。


背景技术：

2.需要具有新颖作用机制的小分子来帮助处理当今最具挑战性的生物医学问题和农业问题。然而，几十年间，由目标是识别用于药物和农用化学品开发的先导化合物的合成化学产生的超过1.35亿的小分子，尽管通过了初始筛选，但是被逐步淘汰。显然，改善小分子的复杂性和多样性是必要的。实际上，在自然界中多样的化合物，即具有复杂结构的天然产物和它们的衍生物是容易得到的，数千年来其在疾病的研究和治疗中发挥了重要作用。特别地，多胺缀合物是一组多样并且数量上主要的植物次级代谢物，其展示出广阔的结构多样性和复杂性。由此，已经报道多项对这些化合物的有益性质的研究。例如，已经提议多胺-谷胱甘肽缀合物，也被称为锥虫胱甘肽(trypanothione)，作为药物化学中的特异性分子探针和用于谷胱甘肽还原酶抑制剂的开发。
3.遗憾的是，由于其结构复杂性和在自然界中的低丰度，从传统的合成化学或自天然来源的提取均难以获得多胺类似物。已经寻求在快速生长、遗传上易处理的物种中基于微生物的生产作为天然产物及它们的衍生物的传统供应链的替代方案。特别地，面包师的酵母酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)已经用做细胞工厂用于生产许多不同的燃料、化学品、食品配料和医药品，特别是为了它的天然产物生产。
4.因此，期望开发用于多胺缀合物的发现和生产的新方法。


技术实现要素：

5.提供能够生产多胺缀合物的酵母细胞是总体的目的。
6.通过实施方案满足该目的以及其他目的。
7.在独立权利要求中定义了本发明。在从属权利要求中定义了本发明进一步的实施方案。
8.本发明涉及能够生产谷胱甘肽-多胺缀合物的酵母细胞。该酵母细胞能够生产至少一种多胺。该酵母细胞还包含多胺:谷胱甘肽连接酶编码基因和至少一种多胺合酶编码基因，但是缺少多胺氧化酶编码基因或包含扰乱的多胺氧化酶编码基因。
9.本发明还涉及生产谷胱甘肽-多胺缀合物的方法。该方法包含在培养基中并且在适合于通过根据本发明的酵母细胞生产谷胱甘肽-多胺缀合物的培养条件下培养所述酵母细胞。该方法还包含从培养基和/或从酵母细胞中收集谷胱甘肽-多胺缀合物。
10.本发明提供用于各种谷胱甘肽-多胺缀合物的生产的有效手段，所述谷胱甘肽-多胺缀合物包括单取代和/或多取代多胺，诸如锥虫胱甘肽。因此本发明可以用作涉及传统的合成化学或自天然来源的提取以获得多胺缀合物的现有技术方法的有成本效益的替代方案。
附图说明
11.通过参考以下与附图一起的描述可以最好地理解实施方案，连同其进一步的目的和优点，其中：图1a至1f说明用于亚精胺和高级多胺(higher-polyamine)过量合成的工程酵母代谢。
12.图2a和2b说明酵母中锥虫胱甘肽-(sh)2的生产。
13.图3a和3b说明用于酵母中复杂的酚酰胺和锥虫胱甘肽-(sh)2的生物合成的工程化途径。
具体实施方案
14.为了使得能够有效获取多胺缀合物的多样性，我们工程化了酵母代谢以过量生产一类复杂的多胺，例如亚精胺、高亚精胺(homo-spermidine)、热精胺(thermospermine)和精胺。通过具有按需定制途径(tailoring pathway)的多样的多胺缀合物的生物合成证明该酵母平台的多用性。具体地，由计算机模拟辅助，我们系统地重构了酵母中心碳代谢和氮代谢、甲硫氨酸补救途径、腺嘌呤的补救途径、多胺转运机器和多胺降解途径，由此使得酵母能够在深孔(deep-well)规模发酵中生产》400 mg/l的亚精胺。此外，通过插入按需定制途径以及产生合成聚生体，我们证明了酵母中多胺缀合物(包括锥虫胱甘肽)的从头生物合成。
15.现在将参考其中展示本发明的实施方案的附图和实施例在下文中描述本发明。该描述并非旨在成为可以实施本发明的所有不同方式或可以添加至本发明的所有特征的详细目录。例如，关于一个实施方案说明的特征可以并入到其他实施方案中，并且关于特定的实施方案说明的特征可以从该实施方案中删除。因此，本发明设想在本发明的一些实施方案中，可以排除或省略载于本文的任何特征或特征的组合。此外，鉴于本公开，本文提出的对各种实施方案的很多变化和添加对于本领域技术人员将是显而易见的，它们不背离本发明。因此，以下描述旨在说明本发明的一些特定的实施方案，并且并非旨在详尽地指定其所有的排列、组合和变化。
16.除非本文另有定义，本文所使用的科学术语和技术术语将具有本领域普通的技术人员通常所理解的含义。
17.一般地，本文所述的与生物化学、酶学、分子和细胞生物学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学以及杂交的技术有关使用的名词是在本领域众所周知且通常使用的那些。
18.本文提及的常规方法和技术在，例如molecular cloning, a laboratory manual [second edition] sambrook et al. cold spring harbor laboratory, 1989中，例如，在其第1.21章节"extraction and purification of plasmid dna"、第1.53章节"strategies for cloning in plasmid vectors"、第1.85章节"identification of bacterial colonies that contain recombinant plasmids"、第6章节"gel electrophoresis of dna"、第14章节 "in vitro amplification of dna by the polymerase chain reaction"和第17章节"expression of cloned genes in escherichia coli")中更详细地解释。
[0019]
本说明书通篇涉及的酶委员会(enzyme commission)(ec)编号(本文也称为"种类")是根据国际生物化学与分子生物学联合会命名委员会(nomenclature committee of the international union of biochemistry and molecular biology) (nc-iubmb)在其例如作为以下得到的资源"enzyme nomenclature" (1992，包括附录6-17)中： "enzyme nomenclature 1992: recommendations of the nomenclature committee of the international union of biochemistry and molecular biology on the nomenclature and classification of enzymes", webb, e. c. (1992), san diego: 由academic press为国际生物化学与分子生物学联合会(the international union of biochemistry and molecular biology)出版(isbn 0-12-227164-5)。这是基于由每个酶种类催化的化学反应的数字分类方案。
[0020]
除非上下文另有指示，具体地意指本文所述的本发明的各种特征可以以任何组合使用。此外，本发明还设想在本发明的一些实施方案中，可以排除或省略载于本文的任何特征或特征的组合。为了说明，如果本说明书声明组合物包含组分a、b和c，其具体地意指可以单独地或以任何组合省略和放弃a、b或c或其组合的任一个。
[0021]
如在本发明的描述和所附权利要求中所使用的，除非上下文另有清楚指示，单数形式"一(a)"、"一(an)"和"该/所述(the)"也旨在包括复数形式。也如本文所使用的，"和/或"指的是并且包括一种或多种关联的所列项目的任何和所有可能的组合，以及在替代方案("或")中解释时为组合的缺少。
[0022]
贯穿该说明书的描述和权利要求，词语"包含(comprise)"和"含有(contain)"以及词语的变化，例如"包含(comprising)"和"包含(comprises)"，意为"包括但不限于"并且不排除其他的部分、添加物、组分、整数或步骤。贯穿该说明书的描述和权利要求，除非上下文另有要求，单数包括复数。特别地，在使用不定冠词的情况下，除非上下文另有要求，本说明书应理解为设想复数以及单数。
[0023]
如本文所使用的，过渡词组基本上由
…
"组成"意为权利要求的范围应解释为包括在权利要求中所列举的指定的材料或步骤以及实质上不影响所要求保护的发明的基本和新颖特性的那些材料或步骤。因此，当在本发明的权利要求中使用时，术语基本上由
…
"组成"并非旨在解释为等效于"包含"。
[0024]
为了便于理解本发明，下面定义了许多术语。
[0025]
如本文所使用的，术语"多胺"指的是具有两个或更多个伯氨基基团的有机化合物。多胺的示例包括腐胺(put)、亚精胺(spd)、精胺(spm)、热精胺(tspm)、对称-高亚精胺(sym-homospermidine)(hspd)、1,2-二氨基丙烷、尸胺、胍丁胺、对称-降亚精胺(sym-norspermidine)和降精胺(norspermine)。
[0026]
如本文所使用的，术语"多胺缀合物"或"谷胱甘肽-多胺缀合物"指的是至少一个谷胱甘肽(gsh)分子和多胺之间的缀合物。优选地，谷胱甘肽-多胺缀合物包含在gsh的羧基基团和多胺的胺基团之间形成的酰胺键。谷胱甘肽-多胺缀合物的非限制性而是说明性的示例包括锥虫胱甘肽(n1,n
10-双(谷胱甘酰基)亚精胺)、n
1-谷胱甘酰基亚精胺、n
10-谷胱甘酰基亚精胺、n1,n
10-双(谷胱甘酰基)精胺、n1,n5,n
10-三(谷胱甘酰基)精胺、n1,n5,n
10
,n
14-四(谷胱甘酰基)精胺。因此，谷胱甘肽-多胺缀合物可以是一个多胺(诸如亚精胺或精胺)和一个、两个或更多个(诸如三个或四个)谷胱甘肽分子之间的缀合物。
[0027]
也如本文所使用的，术语"核苷酸序列"、"核酸"、"核酸分子"、"寡核苷酸"和"多核苷酸"指的是rna或dna，包括cdna、dna片段或部分、基因组dna、合成dna、质粒dna、mrna和反义rna，其中的任何一种可以是单链或双链的、线性或分支的、或其杂合体。本文所提供的核酸分子和/或核苷酸序列以5'至3'方向、从左至右呈现于本文，并且使用如载于美国序列细则 37 cfr
ꢀ§§
1.821
ꢀ‑ꢀ
1.825和世界知识产权组织(the world intellectual property organization)(wipo)标准st.25中的用于代表核苷酸性状的标准代码来代表。当人工合成地生产dsrna时，不太常见的碱基，诸如肌苷、5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤、次黄嘌呤等也可以用于反义、dsrna和核酶配对。例如，已经证明包含尿苷和胞苷的c-5丙炔类似物的多核苷酸以高亲和力结合rna并且是基因表达的有力反义抑制剂。也可以进行其他的修饰，诸如对磷酸二酯主链或rna的核糖糖基团中的2'-羟基的修饰。如本文所使用的术语"重组体"在使用时意为特定的核酸(dna或rna)是克隆、限制和/或连接步骤的各种组合的产物，所述各种组合造成具有结构编码序列或非编码序列的可区别于天然系统中发现的内源核酸的构建体。
[0028]
如本文所使用的，术语"基因"指的是能够用于生产mrna、反义rna、mirna、抗-微rna反义寡聚脱氧核苷酸(anti-microrna antisense oligodeoxyribonucleotide)(amo)等的核酸分子。基因可以能够或不能够用于生产功能蛋白或功能基因产物。基因可以包括编码区域和非编码区域(例如，内含子、调控元件、启动子、增强子、终止序列和/或5'非翻译区域和3'非翻译区域)两者。基因可以是"分离的"，其意为核酸实质上或基本上没有通常发现的与处于其天然状态的核酸关联的组分。这类组分包括其他细胞材料、来自重组体生产的培养基和/或在化学合成核酸中使用的各种化学品。
[0029]
如本文所定义的"扰乱的基因"涉及造成部分或完全无功能基因和基因产物的对基因的任何突变或修饰。这种突变或修饰包括但不限于错义突变、无义突变、缺失、取代、插入、靶向序列的添加等。此外或备选地，基因的扰乱还可以通过控制基因转录的控制元件的突变或修饰(诸如启动子、终止子和/或增强元件中的突变和修饰)来达到。在这种情况下，这种突变或修饰造成基因转录的部分或完全丧失，即，当与天然和未修饰的控制元件相比，转录较低或减少。作为结果，转录和翻译之后可用的基因产物的量(如果有的话)将减少。此外，基因的扰乱可能还需要向基因中添加或从中去除定位信号，造成基因产物在其天然的亚细胞区室中的存在降低。
[0030]
基因扰乱的目的是减少基因产物的可用的量，包括完全阻止基因产物的任何生产，或表达当与天然或野生型基因产物相比缺少或具有较低的酶活性的基因产物。
[0031]
如本文所使用的术语"缺失"或"敲除"指的是无效或敲除的基因。
[0032]
术语"减弱的活性"在涉及酶时指的是与对照或野生型状态相比酶在其天然区室中的活性降低。造成减弱的酶活性的操作包括但不限于错义突变、无义突变、缺失、取代、插入、靶向序列的添加、靶向序列的去除等。包含造成减弱的酶活性的修饰的细胞与不包含这类修饰的细胞相比将具有较低的酶活性。减弱的酶活性可以通过编码无功能基因产物(例如，具有基本上无活性例如，当与野生型多肽的活性相比活性小于约10%或者甚至5%的多肽)来达到。
[0033]
基因的密码子优化版本指的是引入到细胞中的外源基因，并且其中基因的密码子已经关于特定的细胞进行了优化。一般地，并非所有的trna横跨物种都是同等地或者在相
同水平表达。由此，基因序列的密码子优化涉及改变密码子以匹配最优势的trna，即，在给定细胞中，用由相对更优势的trna识别的同义密码子去改变由低优势的trna识别的密码子。这样，来自密码子优化基因的mrna将被更有效地翻译。优选地，密码子和同义密码子编码相同的氨基酸。
[0034]
如本文所使用的，术语"肽"、"多肽"和"蛋白"可互换使用以指示氨基酸残基的聚合物。术语"肽'、"多肽"和"蛋白"还包括修饰，所述修饰包括但不限于脂质附着、糖基化、糖基化、硫酸酯化、羟基化、l-谷氨酸残基的γ-羧基化和adp-核糖基化。
[0035]
如本文所使用的，术语"酶"定义为在细胞中催化化学或生化反应的蛋白。通常地，根据本发明，编码酶的核苷酸序列可操作地连接至核苷酸序列(启动子)，该核苷酸序列(启动子)引起相应基因在细胞中的充分表达以赋予细胞生产亚精胺的能力。
[0036]
如本文所使用的，术语"开放阅读框(orf)"指的是编码多肽、肽或蛋白的rna或dna区域。
[0037]
如本文所使用的，术语"基因组"包括宿主细胞中的质粒和染色体两者。例如，无论它们是染色体整合的还是质粒定位的，引入到宿主细胞中的本公开的编码核酸都可以是基因组的一部分。
[0038]
如本文所使用的，术语"启动子"指的是具有控制一个或多个基因转录的功能的核酸序列，其位于关于基因的转录起始位点的转录方向的上游。在该上下文中合适的启动子包括组成型天然启动子和诱导型天然启动子两者，以及本领域的技术人员所熟知的工程化启动子。
[0039]
用于在酵母细胞中使用的合适的启动子包括但不限于pdc、gpd1、tef1、pgk1和tdh的启动子。其他合适的启动子包括gal1、gal2、gal10、gal7、cup1、his3、cyc1、adh1、pgl、gapdh、adc1、ura3、trp1、leu2、tpi、aox1和enol的启动子。
[0040]
如本文所使用的，如果没有另外注释，术语"终止子"指的是"转录终止信号"。终止子是阻碍或停止聚合酶的转录的序列。
[0041]
如本文所使用的，根据本公开的"重组真核细胞"定义为包含内源核酸序列的额外多份或一份拷贝的细胞，或用在真核细胞中不天然存在的多肽或核苷酸序列转化或遗传修饰的细胞。如本文所使用的，野生型真核细胞定义为重组真核细胞的亲本细胞。
[0042]
如本文所使用的，术语"增加(increase)"、"增加(increased)"、"增加(increasing)"、"增强(enhance)"、"增强(enhanced)"、"增强(enhancing)"和"增强(enhancement)"(及其语法变化)指示当与对照相比，至少约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、150%、200%、300%、400%、500% 或更多，或其中任何范围的提高。
[0043]
如本文所使用的，术语"减少(reduce)"、"减少(reduced)"、"减少(reduction)"、"缩减"、"抑制"和"降低"以及相似的术语意为当与对照相比，至少约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、150%、200%、300%、400%、500% 或更多，或其中任何范围的降低。
[0044]
如本文所使用的减少的基因表达涉及减少基因的转录、减少转录自基因的mrna的翻译和/或减少翻译自mrna的蛋白的翻译后加工的遗传修饰。这类遗传修饰包括应用于基因的控制序列(诸如启动子和增强子)的插入、缺失、置换或突变。例如，基因的启动子可以
由较少活性的启动子或诱导型启动子替换，从而造成减少的基因转录。启动子的敲除也会造成减少的基因表达(典型地为0)。
[0045]
如本文所使用的，术语本发明的核苷酸序列的"部分"或"片段"将理解为意为核苷酸序列相对于参考核酸或参考核苷酸序列长度减少，并且包含与参考核酸或参考核苷酸序列同一或几乎同一的(例如，80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、98%、99%同一性)连续核苷酸的核苷酸序列、基本上由之组成和/或由之组成。根据本发明的这种核酸片段或部分可以在适当的情况下包含于较大的多核苷酸中作为其组分。
[0046]
具有同源性的不同的核酸或蛋白在本文中称为"同源物"。术语同源物包括来自相同物种和其他物种的同源序列，以及来自相同物种和其他物种的直系同源序列。"同源性"指的是用位置同一性的百分比(即，序列相似性或同一性)表示的在两个或更多个核酸和/或氨基酸序列之间的相似性水平。同源性还指的是不同的核酸或蛋白中相似的功能性质的概念。因此，本发明的组合物和方法进一步包含本发明的核苷酸序列和多肽序列的同源物。如本文所使用的，"直系同源的"指的是不同物种中的在物种形成期间由共同的祖先基因产生的同源核苷酸序列和/或氨基酸序列。本发明的核苷酸序列的同源物与所述核苷酸序列具有实质的序列同一性，例如，至少约70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%和/或100%。
[0047]
如本文所使用的术语"过量表达(overexpress)"或"过量表达(overexpression)"指的是，与在其天然或对照状态下(例如，未用特定的过量表达的异源或重组多肽转化)在细胞中相比，更高水平的基因活性(例如，基因的转录)、更高水平的mrna翻译为蛋白和/或更高水平的基因产物(例如，多肽)的生产。过量表达基因的典型示例是在当与基因的天然启动子相比另一启动子的转录控制下的基因。另外或备选地，基因的控制元件(诸如增强子)中的其他改变也可以用于过量表达特定的基因。此外，如本文所使用的，影响(即，增加)转录自基因的mrna的翻译的修饰可以备选地或额外用于达到基因过量表达。这些术语也可以指的是细胞中基因的拷贝数量的增加和/或mrna和/或基因产物的量的增加。还可以通过包括来自不同物种的编码相同或同源基因产物(诸如酶)的基因达到过量表达。过量表达可以造成当与对照水平相比细胞中25%、50%、75%、100%、200%、300%、400%、500%、750%、1000%、1500%、2000%或更高，或其中任何范围的水平。
[0048]
如本文所使用的，术语"外源的"或"异源的"在关于核酸(rna或dna)、蛋白或基因使用时指的是，核酸、蛋白或基因作为将其导入的细胞、生物体、基因组、rna或dna序列的部分非天然地存在，包括天然存在的核苷酸序列的非天然存在的多份拷贝。这种外源基因可以是来自另一物种或株系的基因、在宿主细胞中天然存在的基因的修饰、突变或进化版本或在宿主细胞中天然存在的基因的嵌合版本或融合基因。在这些前例中，修饰、突变或进化引起基因的核苷酸序列的改变，从而获得当与宿主细胞中天然存在的基因相比具有另一核苷酸序列的修饰、突变或进化的基因。进化基因指的是编码进化基因并且通过遗传修饰(诸如突变或暴露于进化压力)以衍生出当与野生型或天然基因相比具有不同的核苷酸序列的新基因而获得的基因。嵌合基因是通过将一个或多个编码序列的部分组合以产生新基因而形成的。这些修饰与将整个基因序列合并到单个阅读框中的融合基因不同，并且经常保留它们的原始功能。
[0049]
"内源的"、"天然的"或"野生型"核酸、核苷酸序列、多肽或氨基酸序列指的是天然存在的或内源的核酸、核苷酸序列、多肽或氨基酸序列。因此，例如，"野生型mrna"是天然存在于生物体中或生物体内源的mrna。
[0050]
如本文所使用的，术语"修饰的"，当其关于生物体使用时，指的是当与除了未进行如此修饰之外相同的宿主生物体相比，已进行修饰以生产多胺缀合物的宿主生物体。原则上，根据本公开的这类"修饰"可以包含当与除了未经过修饰之外相同的生物体相比，在宿主生物体中适当地变更多胺缀合物的生产的任何生理、遗传、化学或其他的修饰。然而，在大多数实施方案中，修饰将包含遗传修饰。在某些实施方案中，如本文所述，修饰包含将基因引入到宿主细胞中。提升多肽活性的遗传修饰包括但不限于：引入一份或多份拷贝的编码多肽的基因(其可能区别于已存在于宿主细胞中的编码具有相同活性的多肽的任何基因)；变更存在于细胞中的基因以增加基因的转录或翻译(例如，变更例如调节序列、启动子序列或其他序列、向其添加额外的序列、置换其一个或多个核苷酸、从其缺失序列或将其交换)；以及变更编码多肽的基因的序列(例如非编码或编码的)以提升活性(例如通过增加酶活性、降低反馈抑制、靶向特定的亚细胞定位、提升mrna稳定性、提升蛋白稳定性)。减少多肽活性的遗传修饰包括但不限于：缺失编码多肽的基因的部分或全部；插入扰乱编码多肽的基因的核酸序列；改变存在于细胞中的基因以减少基因的转录或翻译或减少由基因编码的mrna或多肽的稳定性(例如通过添加额外的序列至启动子序列、调控序列或其他序列、将其变更、从其缺失序列、置换其一个或多个核苷酸或将其交换例如置换其一个或多个氨基酸)。术语"过量生产"在本文中关于宿主细胞中产物的生产使用，并且指示依靠编码涉及宿主细胞的代谢途径的不同多肽的核酸序列的引入或作为其他的修饰的结果，当与未修饰宿主细胞或野生型细胞相比宿主细胞生产更多的产物。
[0051]
如本文所使用的术语"载体"定义为线性或环状dna分子，其包含编码本发明的多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸可操作地连接至确保其表达的额外核苷酸。
[0052]
"引入"在酵母细胞的上下文中意为以核酸分子得以进入细胞的内部的方式使核酸分子与细胞接触。相应地，多核苷酸和/或核酸分子可以在单个的转化事件中、在分开的转化事件中引入酵母细胞。因此，如本文所使用的术语"转化"指的是将异源核酸引入到细胞中。酵母细胞的转化可以是稳定的或瞬时的。
[0053]
"瞬时转化"在多核苷酸的上下文中意为多核苷酸被引入到细胞中并且不整合到细胞的基因组中。
[0054]
在将多核苷酸引入到细胞中的上下文中提到"稳定地引入"或"稳定地引入的"意指引入的多核苷酸稳定地并入到细胞的基因组中，并且因此多核苷酸稳定地转化了细胞。如本文所使用的"稳定转化"或"稳定地转化的"意为核酸分子被引入到细胞中并且整合到细胞的基因组中。因此，整合的核酸分子能够由其后代，更特别地，由多个连续世代的后代遗传。如本文所使用的稳定转化也可以指的是染色体外(例如作为微型染色体)维持的核酸分子。
[0055]
瞬时转化可以通过例如酶联免疫吸附测定(elisa)或蛋白质印迹来检测，其可以检测由一个或多个引入到生物体中的核酸分子编码的肽或多肽的存在。细胞的稳定转化可以通过例如细胞的基因组dna与核酸序列的dna印迹杂交测定来检测，所述核酸序列特异性地与引入到生物体(例如，酵母)中的核酸分子的核苷酸序列杂交。细胞的稳定转化可以通
过例如细胞的rna与核酸序列的rna印迹杂交测定来检测，所述核酸序列特异性地与引入到酵母或其他生物体中的核酸分子的核苷酸序列杂交。细胞的稳定转化还可以通过例如本领域所熟知的聚合酶链式反应(pcr)或其他扩增反应来检测，所述反应采用与核酸分子的靶标序列杂交的特异性引物序列，造成靶标序列的扩增，其可以根据标准方法检测。转化也可以通过本领域熟知的直接测序和/或杂交方案来检测。
[0056]
本发明的实施方案还包括如本文所述的多肽的变体。如本文所使用的，"变体"意为其中氨基酸序列与它衍生自的基础序列的不同在于序列内一个或多个氨基酸由其他氨基酸取代的多肽。例如，seqidno:1的变体可以具有氨基酸序列，该氨基酸序列与seqidno:1具有至少约50%同一性(例如，至少约80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或约100%同一性)。该变体和/或片段是功能变体/片段，因为变体序列具有与酶相似或同一的功能酶活性特性，所述酶具有本文所指定的非变体氨基酸序列(并且这是如本说明书通篇所使用的术语"功能变体"的含义)。
[0057]
因此，任何呈现的氨基酸序列的"功能变体"或"功能片段"是保持在与非变体序列相同酶类别(即，具有相同ec编号)内的任何氨基酸序列。确定酶是否落在特定类别内的方法是技术人员所熟知的，技术人员可以在不使用创造性技能的情况下确定酶类别。例如，合适的方法可以从国际生物化学与分子生物学联合会(theinternationalunionofbiochemistryandmolecularbiology)获得。
[0058]
氨基酸由具有大致相似的性质的不同的氨基酸置换的氨基酸取代可以视为"保守的"。非保守取代是其中氨基酸由不同类型的氨基酸置换。
[0059]
"保守取代"意为一种氨基酸由相同种类的另一氨基酸取代，其中种类定义如下：种类氨基酸示例非极性的：a、v、l、i、p、m、f、w不带电荷的极性的：g、s、t、c、y、n、q酸性的：d、e碱性的：k、r、h。
[0060]
如本领域技术人员所熟知的，通过保守取代变更多肽的一级结构可能不会显著变更该多肽的活性，因为插入到序列中的氨基酸的侧链可能能够形成与已被取代掉的氨基酸的侧链相似的键和接触。甚至当取代在对确定多肽构象关键的区域中时也是如此。
[0061]
在本发明的实施方案中，如本文别处所定义的，假如非保守取代不干扰多肽的酶活性，它们就是可能的。酶的取代版本必须保留特性，以使它们保持在与非取代酶相同的酶种类中，所述酶种类使用以上所讨论的nc-iubmb命名法确定。
[0062]
一般来说，在不变更多肽的生物活性的情况下，比保守取代更少的非保守取代将是可能的。确定任何取代(以及事实上任何氨基酸缺失或插入)的影响完全在技术人员的常规能力内，技术人员可以容易地确定变体多肽是否保留根据本发明的方面的酶活性。例如，当确定多肽的变体是否落在本发明的范围内(即，为如上所定义的"功能变体或片段")时，技术人员将确定该变体或片段是否保留如本文别处所提及的参考nc-iubmb命名法所定义的底物转换酶活性。所有这类变体都在本发明的范围内。
[0063]
除本文所公开的那些之外，使用标准的遗传代码，技术人员可以容易地构思和制造编码多肽的进一步的核酸序列。核酸序列可以是dna或rna，并且当它是dna分子时，它可
以例如包含cdna或基因组dna。如本文别处所述，核酸可以包含在表达载体内。
[0064]
因此，本发明的实施方案包括编码本发明的实施方案所设想的多肽的变体核酸序列。与核酸序列相关的术语"变体"意为多核苷酸序列的任何取代、变化、修饰、置换、缺失或自其或向其添加一个或多个核苷酸，只要由该多核苷酸编码的所得多肽序列表现出与由基础序列编码的多肽至少相同或相似的酶性质。该术语包括等位基因的变体并且还包括多核苷酸("探针序列")，该多核苷酸实质上与本发明的实施方案的多核苷酸序列杂交。这类杂交可能发生在低严谨性条件下和高严谨性条件下或两者之间。概括地，低严谨性条件可以定义为其中洗涤步骤发生在低于探针序列的计算或实际解链温度(tm)约40
°
c-48
°
c(例如，约实验室环境温度至约55
°
c)的温度下在0.330-0.825 m nacl缓冲液溶液中的杂交，而高严谨性条件涉及在低于探针序列的计算或实际tm约5
°
c-10
°
c(例如，约65
°
c)的温度下在0.0165-0.0330 m n缓冲液溶液中的洗涤。缓冲液溶液可以是，例如盐水-柠檬酸钠(ssc)缓冲液(0.15m nacl和0.015m 柠檬酸三钠)，其中低严谨性洗涤发生在3
ꢀ×ꢀ
ssc缓冲液中，并且高严谨性洗涤发生在0.1
ꢀ×ꢀ
ssc 缓冲液中。涉及核酸序列的杂交的步骤已经在例如molecular cloning, a laboratory manual [second edition] sambrook et al. cold spring harbor laboratory, 1989中，例如在其第11章节"synthetic oligonucleotide probes"中描述。
[0065]
优选地，核酸序列变体具有约80%或更多的与本发明的实施方案的核酸序列相同的核苷酸，更优选至少85%或甚至90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更大的序列同一性。
[0066]
本发明的变体核酸可以进行密码子优化以用于在特定的宿主细胞中表达。
[0067]
如本文所使用的，"序列同一性"指的是两个核苷酸序列或两个肽序列或蛋白序列之间的序列相似性。通过序列比对确定相似性，以确定序列之间的结构和/或功能关系。
[0068]
氨基酸序列之间的序列同一性可以通过使用从the national center for biotechnology information (ncbi), bethesda, md., usa得到的needleman-wunsch 全局序列比对工具(needleman-wunsch global sequence alignment tool)，例如，经由http://blast.ncbi. nlm.nih.gov/blast.cgi，使用默认参数设置(对于蛋白比对，gap costs existence: 11 extension: 1)比较序列的比对来确定。本说明书中提及的序列比较和百分比同一性已使用该软件确定。当将序列同一性水平与例如seq id no: 1比较时，优选地，这应相对于seq id no: 1的整个长度进行(即，使用全局比对方法)，以避免短区域的高同一性重叠造成同一性的高总体评价。例如，具有例如五个氨基酸的短多肽片段可能具有与整个seq id no: 1内的五个氨基酸区域具有100%同一性的序列，但这不提供100%的氨基酸同一性，除非该片段形成较长序列的部分，该较长序列在等效于seq id no: 1中的位置的其他位置也具有同一的氨基酸。当比较序列中的等效位置由相同的氨基酸占据时，那么分子在该位置是同一的。将比对评分为同一性的百分比是与比较序列共享的位置处同一的氨基酸的数量的函数。在比较序列时，最佳比对可能要求将空位引入到一个或多个序列中，以考虑序列中可能的插入和缺失。序列比较方法可以采用空位罚分，以便对于被比较的序列中相同数量的同一的分子，具有尽可能少的空位的序列比对，其反映两个比较序列之间较高的相关性，将达到比具有许多空位的序列更高的分数。最大百分比同一性的计算涉及考虑空位罚分的最佳比对的产生。如上所提及的，可以使用needleman-wunsch全局序
列比对工具，使用默认参数设置确定百分比序列同一性。needleman-wunsch算法出版于j. mol. biol. (1970) 48卷: 443-453。
[0069]
本发明的一个方面涉及能够生产谷胱甘肽-多胺缀合物的酵母细胞。该酵母细胞能够生产至少一种多胺并且该酵母细胞包含多胺:谷胱甘肽连接酶编码基因和至少一种多胺合酶编码基因，但是缺少多胺氧化酶编码基因或包含扰乱的多胺氧化酶编码基因。
[0070]
在一个实施方案中，酵母细胞被工程化以用于多胺:谷胱甘肽连接酶的过量表达。
[0071]
在一个实施方案中，多胺:谷胱甘肽连接酶的过量表达通过将多胺:谷胱甘肽连接酶编码基因置于在酵母细胞中高活性的启动子的转录控制下来达到。用于在酵母细胞中使用的合适的启动子包括但不限于，pdc、gpd、gpd1、tef1、pgk1、tdh和tdh3的启动子。其他合适的启动子包括gal1、gal2、gal10、gal7、cup1、his3、cyc1、adh1、pgl、gapdh、adc1、ura3、trp1、leu2、tpi、aox1和eno1的启动子。
[0072]
酵母细胞可以包含一份或多份(即至少两份)拷贝的多胺:谷胱甘肽连接酶编码基因，从而增加多胺:谷胱甘肽连接酶的mrna的拷贝数量并且从而增加由酵母细胞生产的多胺:谷胱甘肽连接酶的量。在这种情况下，多胺:谷胱甘肽连接酶编码基因的多份拷贝可以在一个启动子的转录控制下，或每个多胺:谷胱甘肽连接酶编码基因可以在各自的启动子的转录控制下。在后一种情况下，相同类型的启动子可以用于控制各个多胺:谷胱甘肽连接酶编码基因的转录，或可以使用不同类型的启动子。
[0073]
在一个实施方案中，谷胱甘肽-多胺缀合物选自锥虫胱甘肽(n1,n
10-双(谷胱甘酰基)亚精胺)、n
1-谷胱甘酰基亚精胺、n
10-谷胱甘酰基亚精胺、n1,n
10-双(谷胱甘酰基)精胺、n1,n5,n
10-三(谷胱甘酰基)精胺、n1,n5,n
10
,n
14-四(谷胱甘酰基)精胺。因此，缀合物可以是一个多胺(诸如亚精胺或精胺)和一个、两个或多个(诸如三个或四个)谷胱甘肽分子之间的缀合物。
[0074]
在一个实施方案中，多胺:谷胱甘肽连接酶编码基因选自锥虫胱甘肽合酶(ec 6.3.1.9)、谷胱甘酰基亚精胺合酶(ec 6.3.1.8)及其组合。
[0075]
在一个实施方案中，锥虫胱甘肽合酶(trys)编码基因选自布氏锥虫指名亚种(trypanosoma brucei brucei)锥虫胱甘肽合酶(tbbtrys)和核苷酸序列，该核苷酸序列编码与锥虫胱甘肽合酶tbbtrys具有至少80%的序列同一性的锥虫胱甘肽合酶。在一个实施方案中，该核苷酸序列编码与布氏锥虫指名亚种trrs具有至少85%或甚至90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的锥虫胱甘肽合酶。在一个实施方案中，该具有至少80%的序列同一性的锥虫胱甘肽合酶能够催化谷胱甘肽和多胺转换为谷胱甘酰基多胺和/或催化谷胱甘肽和谷胱甘酰基多胺转换为双(谷胱甘酰基)多胺，优选地，能够催化谷胱甘肽和亚精胺转换为谷胱甘酰基亚精胺和催化谷胱甘肽和谷胱甘酰基亚精胺转换为n1,n
10-双(谷胱甘酰基)亚精胺。具有至少80%的序列同一性的锥虫胱甘肽合酶的酶效力可以低于、实质上等于或高于tbbtrrs相应的酶效力，优选至少实质上相等或较高的酶效力。
[0076]
tbbtrys的氨基酸序列展示于seq id no: 34中并且tbbtrrs的核苷酸序列展示于seq id no: 35中。
[0077]
在一个实施方案中，谷胱甘酰基亚精胺合酶(gss)编码基因选自大肠杆菌(escherichia coli)谷胱甘酰基亚精胺合酶(ecgss)和核苷酸序列，该核苷酸序列编码与谷胱甘酰基亚精胺合酶ecgss具有至少80%的序列同一性的谷胱甘酰基亚精胺合酶。在一个
id no: 2中。atspms相应的氨基酸序列展示于seq id no: 3中并且atspms的核苷酸序列展示于seq id no: 4中。
[0088]
在一个实施方案中，热精胺合酶编码基因选自拟南芥热精胺合酶(优选atacl5)和核苷酸序列，该核苷酸序列编码与热精胺合酶atacl5具有至少80%的序列同一性的热精胺合酶。在一个实施方案中，该核苷酸序列编码与atacl5具有至少85%或甚至90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的热精胺合酶。在一个实施方案中，该具有至少80%的序列同一性的热精胺合酶能够催化亚精胺转换为热精胺。具有至少80%的序列同一性的热精胺合酶的酶效力可以低于、实质上等于或高于atacl5相应的酶效力，优选至少实质上相等或较高的酶效力。
[0089]
atacl5的氨基酸序列展示于seq id no: 5中并且atacl5的核苷酸序列展示于seq id no: 6中。
[0090]
在一个实施方案中，高亚精胺合酶(hss)编码基因选自春千里光(senecio vernalis)高亚精胺合酶(svhss)、绿色芽生绿菌(blastochloris viridis)高亚精胺合酶(bvhss)和核苷酸序列，该核苷酸序列编码与高亚精胺合酶svhss或高亚精胺合酶bvhss具有至少80%的序列同一性的高亚精胺合酶。在一个实施方案中，该核苷酸序列编码与svhss或bvhss具有至少85%或甚至90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的高亚精胺合酶。在一个实施方案中，该具有至少80%的序列同一性的高亚精胺合酶能够催化腐胺转换为对称-高亚精胺，或催化腐胺或亚精胺转换为对称-高亚精胺。具有至少80%的序列同一性的高亚精胺合酶的酶效力可以低于、实质上等于或高于svhss或bvhss相应的酶效力，优选至少实质上相等或较高的酶效力。
[0091]
svhss的氨基酸序列展示于seq id no: 7中并且svhss的核苷酸序列展示于seq id no: 8中。bvhss相应的氨基酸序列展示于seq id no: 9中并且bvhss的核苷酸序列展示于seq id no: 10中。
[0092]
在一个实施方案中，酵母细胞选自酵母属(saccharomyces)、克鲁维酵母菌属(kluyveromyces)、接合酵母属(zygosaccharomyces)、假丝酵母属(candida)、有孢汉逊酵母属(hanseniaspora)、毕赤酵母属(pichia)、汉逊酵母属(hansenula)、裂殖酵母属(schizosaccharomyces)、三角酵母属(trigonopsis)、酒香酵母属(brettanomyces)、德巴利酵母属(debaromyces)、拿逊酵母属(nadsonia)、油脂酵母属(lipomyces)、隐球菌属(cryptococcus)、短梗霉属(aureobasidium)、丝孢酵母属(trichosporon)、红酵母属(rhodotorula)、耶罗威亚酵母属(yarrowia)、红冬孢酵母属(rhodosporidium)、法夫酵母属(phaffia)、许旺酵母属(schwanniomyces)、曲霉属(aspergillus)和阿氏酵母属(ashbya)。在特定的实施方案中，酵母细胞选自酿酒酵母、布拉氏酵母(saccharomyces boulardii)、拜耳接合酵母(zygosaccharomyces bailii)、乳酸克鲁维酵母(kluyveromyces lactis)、圆红冬孢酵母(rhodosporidium toruloides)、解脂耶罗威亚酵母(yarrowia lipolytica)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomyces pombe)、巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)、异常汉逊酵母(hansenula anomala)、圆球形假丝酵母(candida sphaerica)或解苹果酸裂殖酵母(schizosaccharomyces malidevorans)。酿酒酵母是优选的酵母物种。
[0093]
在一个实施方案中，酵母细胞是酿酒酵母细胞并且多胺氧化酶是fms1。因此，在一
个实施方案中，酿酒酵母细胞缺少fms1或包含扰乱的fms1。
[0094]
本发明的另一方面涉及能够生产谷胱甘肽-多胺缀合物的酵母细胞。该酵母细胞能够生产至少一种多胺并且该酵母细胞包含多胺:谷胱甘肽连接酶编码基因。
[0095]
如前文中所述的酵母细胞的各种实施方案也可以应用于本发明的这个方面。
[0096]
本发明的另一方面涉及生产谷胱甘肽-多胺缀合物的方法。该方法包含在培养基中并且在适合于通过根据本发明的酵母细胞生产谷胱甘肽-多胺缀合物的培养条件下培养所述酵母细胞。该方法还包含从培养基和/或从酵母细胞中收集谷胱甘肽-多胺缀合物。
[0097]
在本发明的这个方面中的培养基可以是其中可以培养酵母细胞以生产谷胱甘肽-多胺缀合物的任何培养基。培养可以是，例如分批培养、补料分批培养或灌注培养或发酵、生物反应器发酵等的形式。
实施例
[0098]
实施例1：通过系统地重新布线酵母中的天然代谢来改善亚精胺生产在该实施例1中，我们系统地重构了酵母菌株中的代谢，包括中心碳代谢和氮代谢、甲硫氨酸补救途径、腺嘌呤的补救途径、多胺转运机器和多胺消耗/降解途径。此外，我们还引入了另外潜在的阳性遗传靶标。该酵母菌株用新的模块化遗传设计建造。具体地，从头spd生物合成途径分成多个遗传模块，其包含很多生物合成酶的编码序列以将更大的碳通量从糖碳来源转移至spd。
[0099]
设计以增加l-鸟氨酸(orn)的积累的前体过量生产模块(i)包括八种蛋白的过量表达：来自酿酒酵母的nadp
( )-依赖的谷氨酸脱氢酶(gdh1)[seq id no: 11]、来自酿酒酵母的线粒体天冬氨酸和谷氨酸载体蛋白(agc1)[seq id no: 12]、来自酿酒酵母的线粒体l-鸟氨酸载体蛋白(ort1)[seq id no: 13]、来自大肠杆菌的谷氨酸n-乙酰基转移酶(ecarga)[seq id no: 14]、来自大肠杆菌的乙酰基谷氨酸激酶(ecargb)[seq id no: 15]、来自谷氨酸棒状杆菌(corynebacteriumglutamicum)的n-乙酰基-γ-谷氨酰基磷酸还原酶(cgargc)[seq id no: 16]、来自谷氨酸棒状杆菌的乙酰基鸟氨酸氨基转移酶(cgargd)[seq id no: 17]和来自谷氨酸棒状杆菌的鸟氨酸乙酰基转移酶(cgargj)[seq id no: 18]。此外，该模块(i)中还包括两种蛋白的减弱或去除：通过用较弱的启动子p
kex2
交换其天然启动子p
arg3
来减弱酵母天然的鸟氨酸氨甲酰基转移酶(arg3)[seq id no: 19]，和通过敲除car2来去除l-鸟氨酸转氨酶(car2)[seq id no: 20]的活性。
[0100]
设计以从l-鸟氨酸过量生产put的腐胺(put)模块(ii)包括两个遗传修饰；来自酿酒酵母的鸟氨酸脱羧酶(spe1)[seq id no: 21]的过量表达和天然的鸟氨酸脱羧酶抗酶(oaz1)[seq id no: 22]的缺失。
[0101]
设计亚精胺生物合成模块(iii)用于从腐胺过量生产亚精胺(spd)，并且其特点在于来自酿酒酵母的两种蛋白的过量表达：腺苷甲硫氨酸脱羧酶(adometdc；spe2)[seq id no: 23]和亚精胺合酶(spdsyn；spe3)[seq id no: 24]。该模块还包括两种天然蛋白的缺失以避免亚精胺消耗或降解：编码精胺合酶的spe4 [seq id no: 2]和编码非特异性多胺氧化酶的fms1 [seq id no: 25]的缺失。
[0102]
设计s-腺苷-l-甲硫氨酸(adomet)模块(iv)以增加辅因子adomet的可达性。这些修饰包括很多蛋白的过量表达：5'-甲硫腺苷磷酸化酶(meu1)[seq id no: 26](来自酿酒
酵母)、支链氨基酸氨基转移酶(bat2)[seq id no: 27](来自酿酒酵母)、腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(apt1)[seq id no: 28](来自酿酒酵母)、核糖磷酸焦磷酸激酶(prs5)[seq id no: 29](来自酿酒酵母)和来自婴儿利什曼原虫(leishmania infantum)的s-腺苷甲硫氨酸合酶(limat)[seq id no: 30]。该模块还包括腺嘌呤脱氨酶活性(aah1)[seq id no: 31]的缺失。
[0103]
设计多胺流出模块(v)以减轻对细胞的细胞毒性或减轻对多胺生物合成的抑制。该模块包括由tpo5[seq id no: 32]编码的酵母天然的多胺转运蛋白的过量表达。
[0104]
最后但重要地，设计另外的亚精胺生物合成模块(vi)用于从腐胺和adomet过量生产亚精胺。该模块包括由spe2-spe3[seq id no: 33]编码的adometdc-spdsyn融合蛋白的过量表达。
[0105]
该实施例1中的基因的过量表达经由基于crispr/cas9系统或传统的遗传标记物的方法，通过染色体整合至作为整合基因座的我们预期没有生长缺陷和活性表达的区域来获得。按照由mans等人2015开发的方案执行基于crispr/cas9的基因组编辑。特别地，包含使cas9能够组成型表达的具有his3标记物的质粒pl-cas9-his的酿酒酵母菌株cen.pk113-11c为用于所有遗传操作的开始菌株。为了使得能够在所选择的基因座中有效地编辑基因组，构建了多个引导rna(grna)质粒。遗传模块根据重叠延伸pcr (oe-pcr)程序构建为整合盒，所述遗传模块包括遗传部分(即，启动子、终止子、orf和同源臂)的各种组合。该实施例1中使用以下基因和启动子组合：tpi1p-ort1-pyx212t、thxt7p-agc1-cyc1t、tef1p-gdh1-dit1t 、pgk1p-spe3-pyx212t、tef1p-spe1-prm9t、tdh3p-spe2-dit1t、tdh3p-cgargj-tdh2t、pgk1p
‑‑
ecargb-adh1t、tef1p-cgargc-fba1t、thxt7p-cgargd-tpi1t、tpi1p-ecarga-cyc1t、tpi1p-meu1p-fba1t、pgk1p-bat2-cyc1t、tdh3p-apt1-dit1t、tef1p-prs5-prm9t、tef1p-limat-prm9、tdh3p-tpo5-cyc1t、tef1p-spe2-spe3-prm9t。
[0106]
所有天然的遗传部分(即天然的启动子、终止子、orf和同源臂)是使用cen.pk113-11c基因组dna作为模板进行pcr扩增的。对于优化的异源基因，使用合成的片段或质粒(从genscript获得)用于pcr扩增。贯穿整个分子克隆程序使用high-fidelity phusion dna聚合酶。通过标准的liac/ss dna/peg转化方法将盒或质粒引入到酵母中。在合成的不含尿嘧啶完全介质培养基(sc-ura)上选择包含基于ura3的质粒或盒的菌株，所述培养基由6.7 g/l不含氨基酸的酵母氮源基础(ynb)、0.77 g/l不含尿嘧啶的完全补充混合物(csm-ura)、20 g/l葡萄糖和20 g/l琼脂组成。将ura3标记物去除，并在5-氟乳清酸(5'-foa)平板上选择。此外，基于crispr/cas9的系统也用于实践aah1、spe4和fms1的缺失。其他基因敲除实验通过传统的方法进行。本文所使用的所有引物在表1中列出，所有质粒在表2中列出并且所有菌株在表3中列出。
[0107]
表1-引物
表2-质粒
表3-菌株
使用将深孔规模发酵和高效液相色谱(hplc)组合的测定以评估所得菌株jqspd_aa。特别地，所得jqspd_aa菌株用于多胺的生产的24孔深孔分批发酵在由verduyn等人1992开发的基本培养基中实行。在0.2的初始od
600
下用2 ml基本培养基在24孔深孔平板中自24h预培养物接种培养物，并且在300 rpm，30
°
c下培育120小时。基本培养基包含7.5 g/l (nh4)2so4、14.4 g/l kh2po4、0.5 g/l mgso4∙
7h2o、20 g/l葡萄糖、2 ml/l微量金属和1 ml/l维生素溶液，如果需要，用40 mg/l尿嘧啶、40 mg/l组氨酸补充，ph调节至4.5。样品通过取0.1 ml的液体培养物制备并且经过热水(hw)提取。在该方法中，我们使用在深孔平板的发酵中的基本培养基作为提取背景。将包含0.9 ml的发酵培养基的管在水浴中100
°
c下预热10 min。然后，将热发酵培养基迅速地倾倒至0.1 ml的液体培养物上；立即涡旋混合物，并且将样品放置于水浴中。30 min后，将每个管放置于冰上5 min。离心后，上清液直接用于衍生化。为了衍生化，将0.125 ml的饱和nahco3溶液和0.25 ml的丹磺酰氯溶液(5 mg/ml在丙酮中)添加至0.25 ml的样品。然后反应混合物在40
°
c下在黑暗中偶尔摇动(occasional shaking)孵育1 h。通过添加0.275 ml的甲醇停止反应。通过25 mm针头式滤器(0.45
ꢀµ
m nylon)过滤的样品用于hplc检测。使用以下色谱条件：c18 (100 mm
ꢀ×ꢀ
4.6 mm i.d., 2.6
ꢀµ
m, phenomenex kinetex)，激发波长340 nm，发射波长515 nm，样品注入1.5
ꢀµ
l，柱温40
°
c，检测器灵敏度7，采集开始于4.0 min。流动相为水和甲醇，其速度为1 ml/min。洗脱程序如下：0-5min 50%至65%甲醇，5-7.5 min 65%至75%甲醇，7.5-9.5 min 75%至87.5%甲醇，
9.5-10.5 min 87.5%至100%甲醇，10.5-11.5 min 100%甲醇，11.5-13.5 min 100%至50% 甲醇，13.5-16 50% 甲醇。
[0108]
菌株jqspd_aa生产的spd滴度在浓度》 400 mg/l，与如本文所使用的仅有部分的修饰的菌株(见wo 2016/144247和wo 2019/013696中的实施例)相比显著地增加了spd滴度。
[0109]
实施例2：酵母中高级多胺的生产生命已经进化出各式各样的途径来合成多胺的结构变体。事实上，虽然put和spd作为常见的多胺典型地发现于大多数细胞中，但不常见的多胺，诸如对称-高亚精胺(hspd)、热精胺(tspm)、精胺(spm)、支链多胺和长链多胺(lcpas)在自然界中也已被找到。该实施例2通过设计遗传模块(vii)并将其引入到来自实施例1的spd平台菌株jqspd_aa中，调查了对称-高亚精胺(hspd)、热精胺(tspm)和精胺(spm)的生物合成。
[0110]
我们首先着手异源合成三胺hspd，其存在于植物和细菌两者中。在植物中，hspd是吡咯里西啶生物碱生物合成中第一个途径特异性的中间体，其由高亚精胺合酶(植物hss；ec 2.5.1.45)形成。该酶比细菌高亚精胺合酶(细菌hss；ec 2.5.1.44)更具特异性，因为后者不能使用put作为氨基丁基基团的供体。为了探索植物hss和细菌hss两者用于hspd微生物生产的可能性，设计以在酵母中生物合成hspd的遗传子模块(vii-a)和(vii-b)分别编码了春千里光svhss和绿色芽生绿菌bvhss13的表达。子模块作为从genscipt订购的并且分别包含酵母密码子优化的svhss基因[seq id no: 8]和bvhss基因[seq id no: 10]的高拷贝质粒svhss_p426gpd和bvhss_p426gpd引入到spd平台菌株jqspd_aa中。转化实验按照与实施例1中相同的程序。用与实施例1中所描述的相同的程序测定所得菌株jqspd_aa (svhss_p426gpd)和jqspd_aa (bvhss_p426gpd)的hspd生产。
[0111]
我们发现两种hss的过量表达都使得能够生物合成hspd。特别地，svhss使hspd滴度能够在40.9 mg/，而bvhss使hspd滴度能够在31.1mg/(见图1a和1d)。
[0112]
随后，我们还通过引入子模块(vii-c)、子模块(vii-d)和子模块(vii-e)，利用spd平台(实施例1)用于四胺spm和tspm的生产。spm是在所有后生动物中、在有花植物中以及在酵母中发现的最常见的四胺。特异性氨基丙基转移酶，即精胺合酶(spmsyn；ec 2.5.1.22)负责spm生物合成。我们首先探索了酵母天然的spmsyn spe4p用于spm过量生产。
[0113]
当在jqspd_aa中过量表达作为高拷贝质粒spe4_p426gpd (子模块(vii-c))的密码子优化的酵母spe4[seq id no: 2]时，获得了53.1 mg/l的spm(见图1c和1f)。我们还通过在jqspd_aa菌株中过量表达作为高拷贝质粒atspms_p426gpd(子模块(vii-d))的atspms[seq id no: 4]测试了来自拟南芥的spmsyn。这造成了spm的生产(41.8 mg/l；见图1c和1f)。植物acl5氨基丙基转移酶(tspmsyn；ec 2.5.1.79)(来自拟南芥)被证明合成spm的异构体tspm。因此我们还在jqspd_aa菌株中过量表达作为高拷贝质粒atacl5_p426gpd (子模块(vii-e))的atacl5[seq id no: 6]。该策略使得能够生产43.8 mg/l的tspm (见图1b和1e)。所有包含酵母密码子优化的基因的质粒购买自genscript。在该实施例2中使用了与实施例1中所使用的相同的转化和产物测定。所有质粒在表2中列出并且所有菌株在表3中列出。
[0114]
图3a说明用于酵母中亚精胺和高级多胺的生物合成的工程化途径。
[0115]
实施例3：酵母中锥虫胱甘肽的生物合成
酰胺键无疑是自然界中最重要的结构基序之一。大约四分之一的所有市售药物和三分之二的所有药物候选物都携带至少一个酰胺键，并且胺的酰基化是制药工业中实践最广泛的反应之一。多胺存在独特的骨架以连接其他部分，并且经常被并入到特化代谢中，导致具有复杂结构的多样的包含酰胺键的天然产物的生物合成。例如，锥虫胱甘肽(n1,n
10-双(谷胱甘酰基)亚精胺)，t(sh)2)是短膜虫属(crithidia)、锥虫属(trypanosoma)和利什曼原虫属(leishmania)的锥虫(trypanosomatid)中主要的低分子量硫醇，后两者的属包含威胁生命的疾病或致残疾病(诸如非洲昏睡病、黑热病、恰加斯病(chagas
’ꢀ
disease)和美洲利什曼病或东方疖)的病原体。同时，在植物中可以合成丰富的含有多胺的羟基肉桂酰胺，已假定其涉及花、花粉和种子的发育以及病原体抗性。然而，从传统的合成化学或自天然来源的提取均难以获得它们。首先，这些多胺缀合物在自然界中表现出低丰度(li等人2018)。另一方面，多年来建立用于直接酰胺化反应的有效催化系统仍然是有机化学中难以解决的挑战(wang 2019)。在该实施例3中，我们通过引入模块(viii)在多胺缀合物的生物合成中利用了来自实施例1的多胺平台。
[0116]
我们首先着手酵母中[t(sh)2]的异源生物合成。[t(sh)2]是致病的锥虫中主要的氧化还原介体，其在法式短膜虫(crithidia fasciculate)中由两个相异的酶(即谷胱甘酰基亚精胺合酶(gsps；ec 6.3.1.8)和锥虫胱甘肽合酶(trys；ec 6.3.1.9))从谷胱甘肽(gsh)和亚精胺(spd)逐步合成，然而在布氏锥虫指名亚种中两个步骤都由罕见的具有宽广的底物特异性的trys (ec 6.3.1.9)催化。为了探索tbbtrys用于[t(sh)2]微生物生产，设计以在酵母中合成[t(sh)2]的遗传子模块(viii-a)编码布氏锥虫指名亚种trys (tbbtrys)的表达。子模块作为从genscript订购的包含酵母密码子优化的tbbtrys基因[seq id no: 35]的高拷贝质粒tbbtrys_p426gpd引入至spd平台菌株jqspd_aa。按照与实施例1中所描述的相同的程序构建转化实验。所得菌株jqspd_aa (tbbtrys _p426gpd)用于与实施例1中所描述的相同的程序的基于24孔深孔的发酵。通过取0.1 ml的液体培养物制备发酵样品。发酵样品经过热水(hw)提取，在我们的方法中我们使用发酵培养基提取。将包含0.9 ml的发酵培养基的管在水浴中100
°
c下预热10 min。然后，将热发酵培养基迅速地倾倒至0.1 ml的液体培养物上；立即涡旋混合物，并且将样品放置于水浴中。30 min后，将每个管放置于冰上5 min。离心后，上清液直接用于检测。
[0117]
多胺缀合物的检测通过在连接到orbitrap fusion mass spectrometer (thermo fisher scientific, san jose, ca)的dionex ultimate 3000 uhplc (fisher scientific, san jose, ca)上的液相色谱-质谱(lc-ms)测量来进行。该系统使用保持在35
°
c下的agilent zorbax eclipse plus c18 2.1 x 100 mm, 1.8
ꢀµ
m柱。流速为0.350 ml/min，用0.1%甲酸(a)和在乙腈中的0.1%甲酸(b)作为流动相。梯度开始为5% b 1min并且然后接着线性梯度至95% b直到5 min。该溶剂组合物持续1.5 min，其后将它改变至5% b并且持续直到8 min。样品(5
ꢀµ
l)传递至装备有正离子或正离子模式的加热电喷雾离子化源(hesi)的ms，其中鞘气设置为50(a.u.)，辅助气设置为10(a.u.)并且吹扫气设置为1(a.u.)。锥温和探针温度分别为325
°
c和380
°
c，并且喷雾电压为3500 v。扫描范围为80 da至500 da并且扫描之间的时间为50 ms。符合tbbtrs催化两个gsh部分到亚精胺上的性质，该酶在来自实施例1的spd平台jqspd_aa中的过量表达造成了[t(sh)2]的生产。特别地，检测到m/z值对应于722.2977[m h]

或361.6524[m h]
2
的新的单个lc-ms峰，指示[t
(sh)2]的存在(见图2a和2b)。所有质粒在表2中列出并且所有菌株在表3中列出。
[0118]
图3b说明用于酵母中谷胱甘肽-多胺缀合物的生物合成的工程化途径。
[0119]
以上所述的实施方案应理解为本发明的一些说明性示例。本领域的技术人员将理解可以在不背离本发明范围的情况下对实施方案进行各种修饰、组合和改变。特别地，在技术上可能的情况下，可以将不同实施方案中的不同部分技术方案合并成其他配置。然而，本发明的范围由所附权利要求定义。
[0120]
参考文献bienz, s., detterbeck r., ensch c., guggisberg a., h
ä
usermann u., meisterhans c., wendt b., werner c. & hesse m. putrescine, spermidine, spermine, and related polyamine alkaloids. alkaloids chem biol. 58, 83-338 (2002).kim, s.-k., jin, y.-s., choi, i.-g., park, y.-c. & seo, j.-h. enhanced tolerance of saccharomyces cerevisiae to multiple lignocellulose-derived inhibitors through modulation of spermidine contents. metabolic engineering 29, 46-55, doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.ymben.2015.02.004 (2015).li, s., li, y. & smolke, c. d. strategies for microbial synthesis of high-value phytochemicals. nat chem 10, 395-404, doi:10.1038/s41557-018-0013-z (2018).mans, r., van rossum, h. m., wijsman, m., backx, a., kuijpers, n. g., van den broek, m., daran-lapujade, p., pronk, j. t., van maris, a. j. & daran, j. m. crispr/cas9: a molecular swiss army knife for simultaneous introduction of multiple genetic modifications in saccharomyces cerevisiae. fems yeast res. 15, fov004-fov004, doi:10.1093/femsyr/fov004 (2015).michael, a. j. polyamines in eukaryotes, bacteria, and archaea. j. biol. chem. 291, 14896-14903, doi:10.1074/jbc.r116.734780 (2016).nielsen, j. yeast cell factories on the horizon. science 349, 1050-1051, doi:10.1126/science.aad2081 (2015).nielsen, j. cell factory engineering for improved production of natural products. natural product reports, doi:10.1039/c9np00005d (2019).nielsen, j. & keasling, jay d. engineering cellular metabolism. cell 164, 1185-1197, doi:https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.02.004 (2016).ober, d. & hartmann, t. homospermidine synthase, the first pathway-specific enzyme of pyrrolizidine alkaloid biosynthesis, evolved from deoxyhypusine synthase. proceedings of the national academy of sciences 96, 14777-14782, doi:10.1073/pnas.96.26.14777 (1999).verduyn, c., postma, e., scheffers, w.a., van dijken, j.p. effect of benzoic acid on metabolic fluxes in yeasts: a continuous-culture study on the regulation of respiration and alcoholic fermentation. yeast 8, 501
–
517, doi:
10.1002/yea.320080703 (1992).wang, x. challenges and outlook for catalytic direct amidation reactions. nature catalysis 2, 98-102, doi:10.1038/s41929-018-0215-1 (2019).yu, t. zhou, y. j., huang, m., liu, q., pereira, r., david, f., & nielsen, j. reprogramming yeast metabolism from alcoholic fermentation to lipogenesis. cell 174, 1549-1558. e1514, doi:https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.07.013 (2018).zhou, y. j., buijs, n. a., zhu, z., qin, j., siewers, v. & nielsen, j. production of fatty acid-derived oleochemicals and biofuels by synthetic yeast cell factories. nat. commun 7, 11709, doi:10.1038/ncomms11709, https://www.nature.com/articles/ncomms11709#supplementary-information (2016)。