适用于15种植物检疫病毒的靶向测序建库及检测方法与流程

1.本发明涉及植物病毒检疫领域，特别涉及一种适用于15种植物检疫病毒的靶向测序建库及检测方法。


背景技术：

2.植物病毒被视为“植物癌症”，其会导致农作物的低产并威胁人类食品安全，进而引发一系列社会问题。随着我国国际农产品贸易的不断发展，检疫性植物病毒入侵风险逐年加大，严重威胁我国农业生产安全，因此建立快速检疫性植物病毒检测技术和监测体系是保障农业安全生产的重要前提。目前，植物病毒的检疫工作已在各港口所,各省市大专院校，农科院等单位普遍开展起来。
3.目前检测植物病毒的传统方法包括血清学检测、电子显微镜观察、pcr或rt-pcr、 芯片杂交等，但此类检测植物病毒的方法存在许多的弊端，例如电镜观察容易出现判断不准确的情况，核酸扩增技术受限于多重扩增引物的设计，血清学技术的效率有限，因此极大地限制了各类检测方法在实际工作中的推广和应用。
4.在过去的十几年中，测序技术的发展迅猛，测序技术已经从第一代sanger法测序到第二代测序技术(next-generation sequencing,ngs) 为分子生物学领域带来了革命性的变化。测序技术也适用于植物病毒的快速检测，目前主流的基于深度测序的植物病毒检测主要以ngs技术为主。
5.但是基于ngs测序技术的病毒检测依然面临很多问题，存在的问题主要体现在以下几个方案：1.在设备上ngs测序仪属于大型仪器，价格昂贵。需要在专业的实验室或公司平台；2.在实验操作上，测序文库准备复杂且步骤繁琐，需要专业的实验操作人员。3.在测序流程和检测周期上，ngs实验操作和测序周期为2-3天。4.在测序数据质控和数据分析上，由于ngs依赖于pcr扩增，因此具有一定的测序偏好性，导致基因组覆盖不全而且由于ngs测序长不1kb，因此病毒基因组需要组装，在一定程度上结果极度依赖软件和算法的优化和提高。
6.纳米孔测序技术是基于核酸分子通过纳米孔时电势差变化而进行碱基检测的单分子测序技术。与已有测序技术不同的是，纳米孔测序技术没有dna合成这一步骤，是目前唯一可以对核酸分子直接进行测序的技术。同时纳米孔测序还兼具超长读长、便携且可实时测序、高通量多平台等其他测序平台不具有的优势。但是其试剂成本相比较于二代测序高于5～10倍，同时由于缺少针对植物检疫病毒生物信息分析流程导致该技术在实际中很难普及，需要进一步改进。此外，我国植物检疫病毒基因组类型多样，有的为rna病毒、有的为dna病毒，而rna病毒又包括含有polya尾巴和不含polya尾巴的rna病毒。目前针对上述不同类型的植物病毒，通常需要采用不同的建库方案，增加了单次同时检测不同类型植物病毒的成本和难度。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种适用于15种植物检疫病毒的靶向测序建库及检测方法，利用所有植物病毒均能产生rna的特点，构建植物检疫病毒特异性反转录引物池，并将特异性多重反转录技术与纳米孔技术相结合，建立针对15种植物检疫病毒的靶向捕获测序方法，具备高灵敏度、高通量、低成本的优点，可实现单次建库测序检测15种植物检疫病毒的目标，可解决目前植物病毒检疫存在的检测通量低、检测目标单一的问题。
8.为了实现以上目的，本技术方案提供一种适用于15种植物检疫病毒的靶向测序建库方法，包括以下步骤：
9.提取植物样品rna，利用特异性引物池对植物样品rna进行反转录合成病毒cdna，其中特异性引物池包括seq id no.1-seq id no.30所示的引物序列；
10.根据病毒cdna两端保守序列对不同病毒进行pcr扩增，得到富集双链dna；
11.对富集双链dna进行定量和稀释，进行接头连接。
12.本方案可针对以下15种植物检疫病毒进行测序建库，15种植物检疫病毒包括：南芥菜花叶病毒、菜豆荚斑驳病毒、可可肿枝病毒、香石竹环斑病毒、玉米褪绿矮缩病毒、玉米褪绿斑驳病毒、燕麦花叶病毒、马铃薯帚顶病毒、马铃薯a病毒、马铃薯v病毒、马铃薯黄矮病毒、南方菜豆花叶病毒、甘蔗线条病毒、烟草环斑病毒以及小麦线条花叶病毒。
13.南芥菜花叶病毒(armv)、菜豆荚斑驳病毒(bpmv)、可可肿枝病毒(cssv)、香石竹环斑病毒(crsv)、玉米褪绿矮缩病毒(mcdv)、玉米褪绿斑驳病毒(mcmv)、燕麦花叶病毒(omv)、马铃薯帚顶病毒(pmtv)、马铃薯a病毒(pva)、马铃薯v病毒(pvv)、马铃薯黄矮病毒(pydv)、南方菜豆花叶病毒(sbmv)、甘蔗线条病毒(ssv)、烟草环斑病毒(trsv)以及小麦线条花叶病毒(wsmv)。
14.15种植物检疫病毒名录及分类见下表一
15.表一 检疫病毒名录及分类
16.17.18.[0019][0020]
本方案的特异性引物池针对15种病毒序列，特异池引物池内的特异性引物序列如下表二所示：
[0021]
表二：特异性引物池内引物序列
[0022]
[0023][0024][0025]
本方案的重点在于提取并富集病毒核酸，并利用相应的试剂对这些病毒核酸建立测序文库，建立程序化的生物信息学分析程序，达到实时检测和分析植物样品中是否含有
植物检疫病毒的目的。
[0026]
在“提取植物样品rna”步骤中，利用植物rna提取试剂盒提取植物样品rna。植物rna提取试剂盒的类型可选用rna mini kit，也可选用其他的植物rna提取试剂盒。
[0027]
在本方案的一实施例中，取待测植物样品加入液氮并研磨成粉末，使用植物rna提取试剂盒rna mini kit抽提植物样本总rna，电泳及nanodrop检测，将植物样品rna最终浓度调整到250ng/ul。
[0028]
在“利用特异性引物池对植物样品rna进行反转录合成病毒cdna”步骤中，联用纳米孔测序试剂盒的ssp引物，使得每一病毒cdna的5’端加接头。在一些实施例中，可联用纳米孔测序试剂盒pcr-cdna barcoding kit(sqk-pcb109)中的ssp引物给cdna的5’端加接头。
[0029]
本方案的反转录体系可采用therom maxima h minus reverse transcriptase反转录体系，第一反转录体系如下表三所示：
[0030]
表三 第一反转录体系
[0031][0032][0033]
在65℃保温5分钟后置于冰上放置，并将第二反转录体系加到冰上放置的解旋rna中，42℃保温2分钟，再在体系中加入maxima h minus reverse transcriptase 1ul；62℃保温90分钟；85℃保温5分钟；冰上放置。至此cdna合成完毕，第二反应体系如下表四所示：
[0034]
表四 第二反转录体系
[0035][0036]
换言之，在反逆转录过程中：将植物样品rna溶液、特异性引物池、dntp mixture和depc h2o混合并置于65℃保温5分钟后置于冰上，随后将5
×
reverse transcriptase buffer、rnase inhibitor、10um ssp、depc h2o加入上述解旋的rna中，42℃保温2分钟后再在体系中加入maxima h minus reverse transcriptase 1ul，62℃保温90分钟，85℃保温5
分钟并在冰上放置。
[0037]
考虑到反转录得到的cdna是比较少的，故此需要对cdna进行富集。在本方案的“根据病毒cdna两端保守序列对不同病毒进行pcr扩增，得到富集双链dna”步骤中，利用barcode引物(lwb1-12)对不同样本进行pcr扩增，得到富集双链dna。
[0038]
在一具体实施例中，根据cdna两端保守序列，联用cdna-pcr barcoding kit(sqk-pcb109 withsqk-pbk004)试剂盒中的barcode引物(lwb1-12)对不同cdna进行pcr扩增，pcr扩增使用但不限于new england biolabs公司的longamptaq mix聚合酶。
[0039]
本方案进行pcr扩增的体系及条件如下：
[0040]
pcr体系如表五所示：
[0041]
表五pcr体系
[0042][0043]
pcr反应循环的条件如下：
[0044]
表六pcr反应循环条件
[0045][0046]
在pcr反应结束后在上述pcr管子中加入1ul neb exonuclease 1，以去除pcr体系中的rna，此时的反应条件为：在37℃下反应15分钟后再置于80℃下反应15分钟。
[0047]
本方案的“对富集双链dna进行定量和稀释”步骤中，细化包括以下步骤：
[0048]
a.准备ampure xp beads斡旋，混匀；
[0049]
b.将每4管pcr溶液混合一起至1.5ml的离心管中；
[0050]
c.震荡悬浮ampure xp beads；
[0051]
d.在pcr混合液中加入160ul beads；
[0052]
e.杂交炉中旋转室温5min；
[0053]
f.孵育后的溶液经磁力架处理，丢弃上清，加入200ul 70％乙醇溶液，洗两次(管子在架子上不动)；
[0054]
g.晾干；
[0055]
h.12ul水溶解，室温10min，杂交炉中旋转分离磁珠，磁力架处理后上清转移至1.5ml离心管中。
[0056]
在本方案的实施例中，将富集双链dna纯化至满足od260/280为1.8-2.1及od260/230为2.2-2.5的条件，稀释到100ng/ul的核酸浓度。
[0057]
在“进行接头连接”步骤中，吸取200ng的文库产物，用水稀释至11ul，加入1ul的rap，混匀，室温5min。
[0058]
如图1所示，第二方面，本方案提供一种适用于15种植物检疫病毒的检测方法：
[0059]
提取植物样品rna，利用特异性引物池对植物样品rna进行反转录合成病毒cdna，其中特异性引物池包括seq id no.1-seq id no.30所示的引物序列；
[0060]
根据病毒cdna两端保守序列对不同病毒进行pcr扩增，得到富集双链dna；
[0061]
对富集双链dna进行定量和稀释，进行接头连接得到核酸样本库；
[0062]
将核酸样本库上机实时检测，获取纳米孔测序数据；
[0063]
分组纳米孔测序数据并和标准病毒数据库比对，确定植物检疫病毒序列。
[0064]
其他步骤同于第一方面的方案介绍，不同之处在于上机检测以及纳米孔测序数据处理。
[0065]
本方案的“将核酸样本库上机实时检测，获取纳米孔测序数据”具体包括以下步骤：
[0066]
1.将sequencing buffer(sqb),loading beads(lb),flush tether(flt)以及flush buffer(fb)在室温下解冻，解冻完成后将管放在冰上。
[0067]
2.涡流混合sequencing buffer(sqb)及flush buffer(fb)，离心和放置冰上。
[0068]
3.离心flush tether(flt)tube，吹打混匀，放置冰上。
[0069]
4.打开纳米孔测序装置的盖子，顺时针滑动流池的启动口盖，使启动口可见。
[0070]
5.启动和加载spoton芯片。
[0071]
6.打开灌注口后，检查盖子下是否有小气泡。抽回少量以清除任何气泡:
[0072]
设置一个p1000μl移液器到200ul
[0073]
把枪头插入灌注口
[0074]
转动转盘，直到刻度盘显示220-230μl，或者直到看到少量缓冲液进入移液器吸头位置。
[0075]
7.准备芯片灌注混合物：将30μl解冻且混合的flush tether(flt)直接添加到解冻且混合的flush buffer(fb)的管中，并通过上下吹打进行混合。
[0076]
8.通过灌注端口将800μl灌注混合物装入流通池中，避免引入气泡。等5分钟。
[0077]
9.用移液器彻底混合loading beads(lb)的内容物。
[0078]
在一个新的管，准备库加载如下表七:
[0079]
表七 准备库成分
[0080][0081]
10.轻轻提起spoton样品端口盖以使spoton样品端口可触及。
[0082]
11.通过灌注端口(不是spoton样品端口)将200μl的priming mix装入芯片，避免引入气泡。
[0083]
12.通过spoton样品端口以逐滴方式将75μl样品添加到流通池中。在添加下一滴之前，请确保每个滴都流入端口。
[0084]
13.轻轻地装回spoton样品端口盖，确保塞子进入spoton端口，关闭注油端口，然后装回minion盖子。
[0085]
14.使用minion测序仪和dell precision t3630工作站(intel i7-8700 cpu/32g mem/1.92t ssd/p2200 gpu)在室温环境下上机测序。
[0086]
在“分组纳米孔测序数据并和标准病毒数据库比对，确定植物检疫病毒序列”步骤中，首先建立本地的标准病毒数据库，从纳米孔测序数据中用guppy软件去barcoder分组，用blastn(参数为e-5
到e-10
)与本地数据库比，用blastn(参数为e-5
到e-10
)与本地数据库比，准确获取植物样品中的病毒核酸序列。
[0087]
相较现有技术，本技术方案具有以下特点和有益效果：
[0088]
可实现单次建库测序检测15种植物检疫病毒的检测，减少了单次同时检测不同类型植物病毒的成本和难度，且检测效率高可实现检测实时分析，达到快速、现场检测的效果，可被应用于检疫部门对植物检疫病毒进行现场的快速检测。
附图说明
[0089]
图1是根据本方案的适用于15种植物检疫病毒的检测方法的流程示意图。
[0090]
图2是不同病毒核酸浓度下，病毒来源核酸序列数量变化图。
具体实施方式
[0091]
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。
[0092]
下述实施例和实验例涉及的仪器包括：minion测序仪、高速离心机、qubit3.0、金属浴、移液器、磁力架等。
[0093]
涉及的试剂包括：植物核酸提取试剂盒(rna mini kit)、ont建库试剂盒：cdna-pcr barcoding kit(sqk-pcb109 withsqk-pbk004)、ampure xp纯化磁珠、qubittm检测试剂盒、ont测序芯片等。
[0094]
实施例一设计病变番茄以测试本方案的可行性和灵敏度
[0095]
通过t7体外合成方式获得15种病毒标准rna核酸序列，其中该15种病毒分别为：南芥菜花叶病毒(armv)、菜豆荚斑驳病毒(bpmv)、可可肿枝病毒(cssv)、香石竹环斑病毒(crsv)、玉米褪绿矮缩病毒(mcdv)、玉米褪绿斑驳病毒(mcmv)、燕麦花叶病毒(omv)、马铃薯帚顶病毒(pmtv)、马铃薯a病毒(pva)、马铃薯v病毒(pvv)、马铃薯黄矮病毒(pydv)、南方菜豆花叶病毒(sbmv)、甘蔗线条病毒(ssv)、烟草环斑病毒(trsv)以及小麦线条花叶病毒(wsmv)，通过与健康番茄总rna进行一定比例的混合，模拟不同浓度病毒在植物样品中的混合侵染，利用建立的植物检疫病毒靶向测序技术对上述病毒进行检测，以评估该方法的可行性与灵敏度。
[0096]
1.体外转录：将带有t7启动子的15种病毒标准rna核酸序列dna进行体外转录反应。将模版dna浓度稀释到50ng/μl，使用takara t7体外转录试剂盒对15种病毒进行体外转录，42℃保温2小时，反应体系如下表八所示：
[0097]
表八 反应体系
[0098][0099]
2、rna提纯
[0100]
a.将步骤1得到的反转录rna中加入1～2μl的dnase i(10u/μl，takara)，37℃保持15～20min，此步骤的目的是删除模板dna。
[0101]
b.将上述体系补水至200μl，转至新的1.5ml离心管中，加入200μl饱和酚/氯磷，(1:1，rna质量)，4℃冷冻离心机，10000～12000r/min，离心3min。
[0102]
c.将步骤(2)离心后的产物弃沉淀，吸取离心后的上层水相至新的离心管中，加入
600μl(540μl异丙醇 60μl：1/10总体积的醋酸钠)，上下颠倒混匀，-20℃放置30min。
[0103]
d.将步骤(3)的离心管在冰箱取出，4℃冷冻离心机，10000～12000r/min，离心15min。
[0104]
e.将步骤(4)离心后的液体弃上清，加入700μl 75％乙醇，4℃冷冻离心机，10000～12000r/min，离心5min。取出后，弃上清，再重复此步骤。
[0105]
f.将步骤(5)离心后的上清弃掉，4℃冷冻离心机，10000r/min，空离2～3min。离心后取出，用枪头吸去多余的上清，打开离心管盖子，晾干一下，除去多余乙醇。
[0106]
g.在步骤(6)晾干后的管中加入20μl无菌双蒸水，溶解rna，由此得到纯度较高的rna。
[0107]
3、健康植物rna提取(番茄)
[0108]
本发明使用rna mini kit植物rna提取试剂盒。
[0109]
a.取新鲜番茄叶片，约0.1g，剪碎放入1.5ml离心管中，加入研磨用小钢珠适量，放入液氮中速冻3min。
[0110]
b.将步骤(1)中速冻好的植物样品放入震荡破碎仪中，70hz破碎150s左右，无大块组织即可。
[0111]
c.1ml rl 20μl dtt(50
×
)配成裂解液，每个样品中加入500μl，轻轻吹打混匀吼，4℃冷冻离心机，12000r/min，离心5min。
[0112]
d.吸取300μl步骤(3)离心后的上清至黄色过滤柱中，将过滤柱放入配套离心管中，4℃冷冻离心机，12000r/min，离心1min。
[0113]
e.弃柱子，保留滤液，将1/2体积的乙醇加入到步骤(4)的离心管中，轻轻吹打混合均匀，转移到在铝板中取出的过滤柱中，将过滤柱放在新的配套离心管中，4℃冷冻离心机，12000r/min，离心1min，后弃滤液。
[0114]
f.将500μl rwa沿管壁转圈加入步骤(5)离心后的过滤柱中，4℃冷冻离心机，12000r/min，离心30s，弃滤液。此步为除去盐分。
[0115]
g.dnase i消化条件如下：10
×
dnase i buffer，5μl；recombinant dnase i，4μl；free h2o，41μl。
[0116]
上述体系共50μl，将配好的体系加入到过滤柱中，每个样品50μl，室温静置15min。再加入300μl的rwb，4℃冷冻离心机，12000r/min，离心30s，后弃滤液。
[0117]
h.将600μl的rwb加入步骤(7)离心后的管中，4℃冷冻离心机，12000r/min，离心30s，弃滤液。
[0118]
i.将步骤(8)的离心管再放回4℃冷冻离心机中，12000r/min，离心30s，弃滤液。
[0119]
g.将步骤(9)离心后的过滤柱取出，放入新的1.5ml离心管中，像过滤柱中间加入50～200μl的free h2o，室温静置5min，4℃冷冻离心机，12000r/min，离心2min，弃过滤柱，测一下提取到的rna浓度。
[0120]
4、cdna合成
[0121]
本发明将病毒用健康植物稀释成10％、5％、0.5％、0.05％、0％，5种不同浓度，来验证可检测到的最低浓度。
[0122]
(1)不同浓度病毒样品的制备。
[0123]
a.10％：病毒池2.5μl 50μl健康番茄rna
[0124]
b.10％病毒15μl 15μl健康番茄rna
[0125]
c.5％病毒2μl 18μl健康番茄rna
[0126]
d.0.5％病毒2μl 18μl健康番茄rna
[0127]
e.0％：只有健康番茄rna
[0128]
(2)cdna合成
[0129]
使用therom maxima h minus reverse transcriptase反转录体系rna进行反转录，反转录引物使用病毒特异性引物池(rtpmix)。第一反应体系如下表九所示：
[0130]
表九 第一反应体系
[0131][0132]
65℃保温5分钟；冰上放置：
[0133]
表十 第二反应体系
[0134][0135][0136]
(3)将上述第二反应体系转移到上一步的解旋的rna中，42℃保温2分钟；再在体系中加入maxima h minus reverse transcriptase 1ul；62℃保温90分钟；85℃保温5分钟；冰上放置。至此cdna合成完毕。
[0137]
(4)cdna双链合成及扩增，根据cdna两端保守序列，联用cdna-pcrsequencing kit中的barcode引物(lwb1-12)对不同样本进行pcr扩增。
[0138]
pcr的扩增使用new england biolabs公司的longamptaq mix聚合酶。
[0139]
pcr体系如下表十二所示：
[0140]
表十二 pcr体系
[0141][0142]
lwb 8-12分别对应10％、5％、0.5％、0.05％、0％的病毒样品。
[0143]
pcr反应循环的设置如下：95℃，30sec；【95℃，15sec；62℃，15sec；65℃，40sec】35个循环；65℃，6min；4℃，hold。
[0144]
pcr反应结束后在上述pcr管子中加入1ul neb exonuclease 1，以去除pcr体系中的rna。反应条件为：37℃，15min；80℃，15min。
[0145]
(5)dsdna纯化
[0146]
利用ampure xp beads对pcr产物进行纯化：震荡悬浮ampure xp beads，在步骤(4)得到的pcr产物中加入160μl的ampure xp beads，放入杂交炉中，室温旋转5min。取出后放在磁力架上，静置2min，待ampure xp bead与液体完全分开后，弃上清，加入200μl提前制备好的70％乙醇，清洗两次ampurexp bead，开盖晾干一下多余的乙醇，加12μl ddh2o溶解，在杂交炉中室温旋转10min，再放磁力架分离磁珠，将上清转移至新的1.5ml离心管中，得到纯度较高的dsdna，用nanodrop对步骤(1)纯化的双链dna核酸检测，满足od260/280为1.8-2.1及od260/230为2.2-2.5，用qubit方法对步骤(1)纯化的双链dna核酸定量，并稀释到100ng/ul的核酸浓度。
[0147]
(6)连接接头
[0148]
吸取200ng的步骤(5)文库产物，用ddh2o稀释至11μl，加入1μl的rap，混匀后，室温静置5min。
[0149]
三、文库上机及纳米孔实时测序
[0150]
详细的步骤如下：
[0151]
1.将sequencing buffer(sqb),loading beads(lb),flush tether(flt)and one tube of flush buffer(fb)在室温下解冻，解冻完成后将管放在冰上。
[0152]
2.涡流混合sequencing buffer(sqb)、flush buffer(fb)tubes，离心后放置冰上。
[0153]
3.离心flush tether(flt)tube，吹打混匀，放置冰上。
[0154]
4.打开纳米孔测序装置的盖子，顺时针滑动流池的启动口盖，使启动口可见。
[0155]
5.启动和加载spoton芯片
[0156]
6.打开灌注口后，检查盖子下是否有小气泡。抽回少量以清除任何气泡:
[0157]
设置一个p1000μl移液器到200ul
[0158]
把枪头插入灌注口
[0159]
转动转盘，直到刻度盘显示220-230μl，或者直到看到少量缓冲液进入移液器吸头为止
[0160]
7.准备芯片灌注混合物：将30μl解冻且混合的flush tether(flt)直接添加到解冻且混合的flush buffer(fb)的管中，并通过上下吹打进行混合8.通过灌注端口将800μl灌注混合物装入流通池中，避免引入气泡。等5分钟.
[0161]
9.用移液器彻底混合loading beads(lb)的内容物。
[0162]
在一个新的管，准备库加载如下表十三:
[0163]
表十三 准备库
[0164][0165]
10.轻轻提起spoton样品端口盖以使spoton样品端口可触及.
[0166]
11.通过灌注端口(不是spoton样品端口)将200μl的priming mix装入芯片，避免引入气泡。
[0167]
12.通过spoton样品端口以逐滴方式将75μl样品添加到流通池中。在添加下一滴之前，请确保每个滴都流入端口。
[0168]
13.轻轻地装回spoton样品端口盖，确保塞子进入spoton端口，关闭注油端口，然后装回minion盖子。
[0169]
14.使用minion测序仪和dell precision t3630工作站(intel i7-8700cpu/32g mem/1.92t ssd/p2200 gpu)在室温环境下上机测序。
[0170]
四、病毒来源序列数据分析
[0171]
采用flo-min106的测序芯片测序，一共测序5h1m。测序数据统计如表十四，不同病毒核酸浓度下，病毒来源核酸序列数量变化如图2表示。
[0172]
表十四 检测结果
[0173]
[0174][0175]
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本技术相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。