检测OBSCN基因突变位点的试剂在制备诊断心肌致密化不全的试剂盒中的应用的制作方法

检测obscn基因突变位点的试剂在制备诊断心肌致密化不全的试剂盒中的应用
技术领域
1.本发明涉及诊断试剂技术领域，具体涉及检测obscn基因突变位点c.19063c》t的试剂在制备诊断心肌致密化不全的试剂盒中的应用。


背景技术：

2.心肌致密化不全(noncompaction of ventricular myocardium，nvm)是一种先天性发育异常的心脏病，其特征为心室内异常粗大的肌小梁和交错的深隐窝为主要表现。nvm患者常出现心室收缩和舒张功能障碍减退，以恶性心律失常、心衰、血栓栓塞症和猝死以一侧或双侧心室扩张及收缩功能障碍为特征，预后差。目前nvm的致病机制尚未明确，以常染色体显性遗传为主，具有家族遗传性，主要与编码肌节蛋白、细胞骨架蛋白、离子通道蛋白等基因突变相关。nvm的诊断主要根据影像学结果，心脏超声可见由非致密层和致密层组成的厚层状心肌、突出的小梁形成及深部小梁间陷窝，结合核磁进一步确诊。通过对nvm一级亲属进行临床筛查，可筛查出家族性心肌致密化不全。
3.目前nvm的研究及防治存在以下几个问题：致病基因及致病机制需进一步研究；患者的诊断主要依据影像学检查，缺乏基因诊断的标准；对nvm患者及其一级亲属早期筛查及诊治需要基因测序的结果，提高精准干预靶点。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供检测obscn基因突变位点c.19063c》t的试剂在制备诊断心肌致密化不全的试剂盒中的应用。本发明所述应用能够补充心肌致密化不全的致病突变谱，制备得到的心肌致密化不全诊断试剂盒可用于筛查高危患者，便于早期诊断及干预。
5.本发明提供了检测obscn基因突变位点c.19063c》t的试剂在制备诊断心肌致密化不全的试剂盒中的应用。
6.优选的是，所述突变位点在obscn基因第82外显子上。
7.本发明还提供了一种诊断心肌致密化不全的引物，所述引物的核苷酸序列如seq id no.1～2所示。
8.本发明还提供了一种诊断心肌致密化不全的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述的引物和反应试剂。
9.优选的是，所述反应试剂包括：takara la10
×
la taq buffer ii和dntp。
10.本发明提供了检测obscn基因突变位点c.19063c》t的试剂在制备诊断心肌致密化不全的试剂盒中的应用。心肌致密化不全是一种严重的遗传性心肌病，患者早期出现心室收缩和舒张功能障碍，发生恶性心律失常、严重的心力衰竭、体循环栓塞以及猝死，预后极差。因此早期诊断、早期干预对这类患者显得尤为重要，本发明所述应用可实现：1、筛查具有该突变位点的家族性心肌致密化不全及携带者；2、提供基因诊断标志物；3、根据基因筛查结果指导下一代优生优育；4、补充心肌致密化不全的致病突变谱，为未来提供精准治疗
干预靶点。
附图说明
11.图1为本发明提供的患者测序图；
12.图2为本发明提供的正常对照测序图；
13.图3为本发明提供的患者及家属外周血测序结果。
具体实施方式
14.本发明提供了检测obscn基因突变位点c.19063c》t的试剂在制备诊断心肌致密化不全的试剂盒中的应用。在本发明中，所述突变位点在obscn基因第82外显子上。obscn基因位于1q42.13，主要在横纹肌组织中表达的结构蛋白，obscn基因编码obscurin蛋白，维持正常肌节和肌浆网结构的细胞骨架作用，参与肌纤维化形成过程，对心肌的正常发育和结构功能维持十分重要。本发明通过试验验证，发现了一个obscn基因突变的nvm家系，经过二代全外显子测序及一代测序验证，确定了该家族部分成员obscn基因第82外显子(nm_001098623)的一个错义突变(c.19063c》t)。通过生物信息学软件，分析了该突变位点的致病性。临床中对于致密化不全心肌病的疑诊患者，可通过采集患者及其家庭成员的外周血，利用sanger测序的方式检测是否存在该致病基因，如果受检者被检测到该位点由c突变为t，提示心肌致密化不全诊断可能性。
15.本发明还提供了一种诊断心肌致密化不全的引物，所述引物的核苷酸序列如seq id no.1～2所示：上游引物：5
’‑
tcatcccagagaggctttgc-3’(seq id no.1)；下游引物：5
’‑
tcagggacagggtcctatgg-3’(seq id no.2)。
16.本发明还提供了一种诊断心肌致密化不全的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述的引物和反应试剂。
17.在本发明中，所述反应试剂优选包括：takara la10
×
la taq buffer ii(mg
2
)和dntp。
18.在本发明中，所述试剂盒在用于诊断时，检测体系优选如表1所示：
19.表1反应体系
[0020][0021]
在本发明中，所述检测体系的反应程序优选如表2所示：
[0022]
表2反应程序
[0023][0024][0025]
本发明心肌致密化不全相关突变基因在obscn基因的基础上进行以下突变得到：c.19063c》t：编码区第19063位碱基c突变成t。obscn蛋白第6355位氨基酸由精氨酸(arg)变为色氨酸(trp)。
[0026]
本发明通过对一个心肌致密化不全家系中2名患者及2名正常对照进行全外显子测序，经过生物信息学分析最终确定了obscn基因上c.19063c》t可能为该家族性心肌致密化不全的致病突变。此后通过对家系中其它成员进行sanger测序，符合基因型表型共分离。该突变位点可导致第6355位氨基酸由精氨酸(arg)变为色氨酸(trp)，通过生物信息学软件预测及数据库检索后，认为该突变位点具有较强致病性并未在心肌致密化不全中报道。
[0027]
具体的，本发明通过采集受检者外周血，提取基因组dna，针对携带该突变位点c.19063c》t的obscn基因片段设计引物，检测obscn基因上是否存在突变位点c.19063c》t，即可辅助心肌致密化不全的快速诊断。
[0028]
本发明提供的新的突变位点补充了心肌致密化不全的遗传突变谱，实现了心肌致
密化不全患者的早期诊断及相关家系中无症状致病基因携带者的检出。由于该致病突变位于常染色体，该发明提供了一种孕前遗传病筛查试剂盒，可根据父母双方基因型指导生育，规避致病基因的遗传。
[0029]
下面结合具体实施例对本发明所述的检测obscn基因突变位点c.19063c》t的试剂在制备诊断心肌致密化不全的试剂盒中的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
[0030]
本发明得到了阜外医院伦理委员会的批准。所有参与者均自愿参加并签署了知情同意书。心肌致密化不全诊断标准依据2019年esc诊断标准和指南。
[0031]
实施例1
[0032]
基因测序技术检测家系患者及健康对照的基因突变
[0033]
通过对一个心肌致密化不全家系中2名患者及2名正常对照进行全外显子测序。收集研究对象2ml edta抗凝外周静脉血，提取基因组dna。针对先证者，应用下一代半导体靶向测序技术进行全外显子测序，首先进行文库构建，所有外显子序列进行扩增。使用ion torrent suite v3.2软件进行ion torrent数据提取、序列比对及snps和indels提取，得到的snps和indels经过seattleseq variation annomitation138注释，对注释结果进行筛选(剔除非靶向区域的变异，以及频率高于1％的常见变异)，对筛选的候选变异利用基因可视化软件integrated genomicsviewer(igv，v2.1)进行测序质量评估以剔除假阳性变异，并进行保守性分析和in silico蛋白功能受损情况预测。利用sanger法测序，将筛选得到的可疑致病变异依次进行先证者验证和家系共分离验证。突变位点命名依据人类基因组变异学会命名原则命名(http：//www.hgvs.orgmutnomen)。
[0034]
根据全外显子测序及生物信息学分析结果，确定重点关注突变位点。根据全外显子测序得到的关注位点，通过生物信息学分析软件预测该突变具有致病性，导致第6355位氨基酸由精氨酸(arg)变为色氨酸(trp)。
[0035]
具体的，本发明通过对心肌致密化不全家系中两名患者及两名正常对照进行全外显子测序，发现了该突变位点c.19063c》t，发现患者携带有该突变而正常人不携带该突变，证明该突变位点是引起该家系心肌致密化不全的原因。首次通过生物信息学分析预测该突变位点的致病性，并结合患者明确的临床表型，结果提示该位点突变具有高度致病性，使患者罹患心肌致密化不全。本发明所述突变位点作为诊断标记物及诊断试剂盒可通过采集患者及家属外周血，并进行sanger测序，即可快速检出是否携带有致病突变位点，以协助诊断。
[0036]
本发明设计正反向引物，收集家系成员外周静脉血，进行pcr扩增及电泳、产物纯化及上机测序，完成其他家系成员的一代sanger测序验证(测序图如图1和图2所示，心肌致密化不全患者第19063号碱基由c变成t；正常对照第19063号碱基是c，sanger测序在家系中进行了初步验证，即患者携带该突变而正常人不携带)。具体如下：
[0037]
上游引物：5
’‑
actgtgcccattcggatg-3’(seq id no.1)。
[0038]
下游引物：5
’‑
ggtatgtgtaggtcctctgt-3’(seq id no.2)。
[0039]
患者及家属外周血测序结果如图3所示，黑色代表患者、白色代表正常人、灰色代表未参加此次检测，圆圈代表女性、方形代表男性，斜线代表死亡患者，箭头代表先证者。该家系中受检者为ⅱ3、iii 3、iii 5、iii 8，携带突变的患者，根据临床检查考虑为心肌致密
化不全，而未携带该突变的家系成员，临床检查无异常。
[0040]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。