一种制备海水养殖尾水处理菌剂的工艺及尾水处理方法

1.本发明属于海洋产业废水处理技术领域，尤其涉及一种制备海水养殖尾水处理菌剂的工艺及尾水处理方法。


背景技术：

2.近年来, 海水水产养殖业从分散养殖模式向高密度集约化精养模式转变。在这种养殖模式下,残饵、粪便的分解会导致水体中的氮浓度迅速升高, 严重威胁水生动物。同时需要通过大量换水来降低养殖水体中有害氮物质的浓度, 这种操作不仅浪费水资源, 并且尾水外排会导致周边自然海水遭到污染。海水养殖的尾水中的主要污染物有以下几种：鱼类剩余饵料、养殖生物排泄物、化学物品残留以及微生物病菌等，这几种物质都难以被轻易消除和溶解，极易造成养殖污染导致养殖生物生长状况出现问题。养殖尾水的处理已经成为影响中国海水养殖业绿色发展的重要因素，亟需开发环境友好的水产养殖模式及尾水处理方式，通过尾水生态治理、源头管控、长效治理等方式，不仅可以改善当地的生态环境，经济效益和社会效益都会得到显著提高，因此进行养殖尾水处理对水产健康养殖及可持续发展具有重要的现实意义。
3.目前的海水养殖主要是使用物理、化学、生物这三种类型的方法来处理尾水。尾水处理的重点主要是降低其中的化学耗氧量（cod）、生物需氧量（bod）、残渣（ss）、氨氮（nh
4 -n）、总磷等指标，然后将处理过的水进行循环利用。微生物强化处理具有高效、低成本、处理量大的优势，生物坝滤池、曝气池等微生物强化处置作为尾水处理的重要构造,是生物脱氮降低有机污染物的重要处置单元，因为海水养殖，需要接种的脱除海水养殖尾水污染物的微生物菌种是耐盐菌种，为了保持菌种的降解优势，需要不间断添加，菌种的需求量较大，需要大规模培养。


技术实现要素：

4.为解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种利用真菌发酵液制备海水养殖尾水处理菌剂的工艺及尾水处理方法。
5.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明利用真菌（冬虫夏草、云芝、虫草头孢）深层发酵，然后过滤去除菌丝体，得到真菌发酵液，再经过调配后作为二级种子培养基，制备耐盐工程菌菌剂产品，应用于海水养殖尾水处置中，实现高效去除养殖污染物、资源循环利用的良好效果。
6.一种利用真菌发酵液制备海水养殖尾水处理菌剂的工艺，包括以下工艺步骤：（1）真菌发酵液的制备：利用真菌（冬虫夏草、云芝、虫草头孢中的一种）深层发酵工艺中滤除回收菌丝体，之后剩余的真菌发酵液，备用；（2）二级种子培养基的制备：步骤（1）中制得的真菌发酵液中，添加2g/l氯化钠和0.1mol/l氢氧化钠溶液调配滤液的盐度和ph=5-8，调配后的真菌发酵滤液经过高温90-100℃灭菌15-60min，冷却至20-50℃，作为一级耐盐菌种子扩增培养的二级种子培养基，备用；
（3）一级种子菌液培养：本发明中的一级种子罐所采用液体种子培养基如下：称取10g葡萄糖、3g酵母粉、2g蛋白胨，用1l蒸馏水加热溶解后，121℃、0.1mpa高温灭菌15min，备用。
7.本发明中涉及到的原始种子液的获得：将斜面保藏的耐盐酵母菌（或者耐盐芽孢杆菌菌种）活化2代后接入上述液体种子培养基中，20℃、100转/分钟振摇培养18h，获得一级种子液。
8.（4）二级耐盐工程菌种培养：步骤（2）中制得的二级种子培养基中加入发酵成熟的一级种子罐的液体耐盐酵母菌种（或者耐盐芽孢杆菌菌种，备注：只能单一培养，不能混合培养），进行二级工程菌种培养；二级耐盐工程菌种培养控制工艺参数如下：将特定耐盐菌的一级种子菌液（特定耐盐菌活菌数大于1亿cfu/ml）按1：100的体积比接种于液体发酵培养基中，30℃、180rpm的条件下发酵培养36-60h，获得可应用于海水养殖尾水处置耐盐酵母工程菌种（或者耐盐芽孢杆菌工程菌种产品）。
9.本发明产品活菌数大于1亿cfu/ml，保存温度20℃下。
10.本发明还公开了一种海水养殖尾水处理方法，包括以下步骤：工厂化海水养殖区产生的带有较高浓度污染物的水先经过沉淀池进行分离，沉淀池上清液再经过过滤坝过滤，然后进入曝气池进行充氧，保持溶解氧不低于2mg/l；上述所得的耐盐酵母工程菌种或者耐盐芽孢杆菌工程菌种按照1:1-2混合比例（根据海水养殖品种和污染物差异而调整）进行混合使用，添加入工厂化海水养殖过滤坝和生物净化池区域段，周添加量为海水养殖厂总水量的0.01%,设计曝气池 生物净化池区域的比例为整个养殖区域容积的25%-50%，日循环次数为1-5次。
11.在此工艺条件下，循环水中的大部分的可溶性有机物、有机氮、氨氮、硝态氮、总磷通过本发明耐盐酵母和耐盐芽孢杆菌工程菌混合菌种的降解，可达到一个很低的含量标准控制要求。在尾水处理设施中设有尾水水质在线水质监测设备、中央管理系统和预报预警系统等功能组成，监测指标包括温度、溶解氧、orp、悬浮物质、ph 值、化学需氧量、生化需氧量、无机氮和活性、磷酸盐等参数。养殖尾水外排应达到海水水产养殖用水的标准要求。实现治理海水养殖尾水的回用。
12.本发明还公开了一种二级种子扩增发酵系统。
13.二级种子扩增发酵系统由二级发酵罐、罗茨风机无菌供氧系统、包装系统和控制系统构成。
14.材质：与液体接触的部分全部为双相不锈钢（或者钛材）、或者是衬氟塑处理，抗酸、碱、氯盐，便于高温消毒。
15.为了强化传质效率，因为空气充氧量有限，增加了快速搅拌器，这里搅拌器的搅拌方向和作用是增加中心桶内液体的上升流速，强化气提内循环流速，中心桶的直径为二级发酵扩增罐直径的1/3，搅拌叶轮设计为三叶搅拌浆，搅拌浆的直径为中心桶直径的2/3，转速可调节，搅拌轴旋转方向是提升物料，强化传质。
16.二级种子发酵罐设有蒸汽盘管加热，配套温度在线传感器，可信号控制自动蒸汽阀门开度从而控制发酵温度在设定的温度范围内。
17.发酵罐内底部通入灭菌过滤的空气，对发酵液进行充氧气，安装在线光谱法溶解氧仪，可在线控制罗茨风机的转速，从而控制充氧速度，二次发酵的溶解氧控制在1-3mg/l，同时发酵设备安装有ph在线传感器、orp在线传感器，发酵液体积（v）、空气流量（fa）、冷却水进出口温度（t1
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和t
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2）、搅拌马达转速（rmp）、搅拌马达电流（i）、泡沫高度（h）在线测量仪表来实现自动测量，实现过程和发酵终点监控。
18.有益效果本发明公开了一种利用真菌发酵液制备海水养殖尾水处理菌剂的工艺，本发明是利用的真菌发酵工厂回收菌丝体后废弃的发酵滤液作为生产耐盐海水养殖尾水处置菌剂的基质，属于废弃资源的重复利用。利用滤液中含有丰富的多糖、总氮和磷等营养物质进行二次调配、灭菌和接种发酵，最终形成了脱除氨氮、总氮、有机氮、有机物的耐盐工程菌剂，适用于海水养殖尾水生态强化处理，实现了海水养殖尾水的高效生态循环利用。
附图说明
19.图1：本发明所述真菌发酵滤液培养耐盐菌-海水养殖尾水处置资源化工艺路线图；图2：二级种子扩增发酵系统的结构示意图；图3：实施例1中水质总氮浓度变化图；图4：实施例1中水质toc浓度变化图；图5：实施例2中水质总氮浓度变化图；图6：实施例2中水质toc浓度变化图；图中，1：发酵培养基调配罐；2：一级种子发酵罐；3：二级发酵罐；4：罗茨风机；5：空气过滤灭菌装置；6：包装系统；7：搅拌器；8：蒸汽盘管；9：自动蒸汽阀门；10：中心桶。
具体实施方式
20.以下，将详细地描述本发明。在进行描述之前，应当理解的是，在本说明书和所附的权利要求书中使用的术语不应解释为限制于一般含义和字典含义，而应当在允许发明人适当定义术语以进行最佳解释的原则的基础上，根据与本发明的技术方面相应的含义和概念进行解释。因此，这里提出的描述仅仅是出于举例说明目的的优选实例，并非意图限制本发明的范围，从而应当理解的是，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以由其获得其他等价方式或改进方式。
21.以下实施例仅是作为本发明的实施方案的例子列举，并不对本发明构成任何限制，本领域技术人员可以理解在不偏离本发明的实质和构思的范围内的修改均落入本发明的保护范围。除非特别说明，以下实施例中使用的试剂和仪器均为市售可得产品。
22.实施例1云芝发酵液制备海水养殖尾水处理菌剂的方法，包括以下工艺：（1）云芝发酵滤液的来源：云芝深层发酵生产完成后，进行双膜过滤，厂家拿走菌丝体加工成制剂，作为保健药品出售，所得滤液即为云芝发酵液。本发明是综合利用云芝发酵滤液中的丰富的多糖、氮磷资源，作为生产耐盐海水养殖尾水处置菌剂的基质，二次发酵制备耐盐酵母和耐盐芽孢杆菌菌剂产品，解决海水养殖尾水污染的难题，属于废弃资源的
重复利用，充分开发云芝滤液的潜在价值。
23.（2）耐盐酵母菌的培养（单独培养）一级工程菌种培养一级液体种子培养基的制备：称取10g葡萄糖、3g酵母粉、2g蛋白胨，用1l蒸馏水加热溶解后，121℃、0.1mpa高温灭菌15min，备用。
24.一级种子液的获得：将斜面保藏的耐盐酵母菌活化2代后接入上述液体种子培养基中，20℃、100转/分钟振摇培养18h，获得一级耐盐酵母菌的种子液。
25.二级液体发酵培养基：云芝发酵液，加2g/l nacl，用0.1mol/l naoh溶液调节ph值至5.0,高温灭菌15min，备用。
26.菌剂的获得：将一级耐盐酵母菌的种子液按1：100的体积比接种于二级液体发酵培养基中，30℃、180 rpm的条件下发酵培养36-60h,获得二级耐盐酵母菌发酵工程菌剂。
27.（3）耐盐芽孢杆菌的培养（单独培养）一级种子液培养基：10 g/l葡萄糖, 5 g/l酵母浸出物，5 g/l蛋白胨，8 g/l氯化钠，0 .5 g/l七水合硫酸镁，剩余用水补齐。
28.一级种子培养：取斜面保存的枯草芽孢杆菌菌种 ，将枯草芽孢杆菌菌种接种于装有300ml种子培养基的1l三角瓶中，接种后，在37℃，160rpm摇床培养24-36h，即制得一级种子液。
29.二级液体发酵培养基：云芝发酵液，加3g/l nacl，用0.1mol/l naoh溶液调节ph值至6.0,高温灭菌15min，备用。
30.二级发酵培养：将30l的所述发酵培养基装在50l发酵罐中，将一级种子液按10％的体积比例加入发酵罐中，在37℃、220 rpm 进行发酵培养，36-48h后，获得耐盐芽孢杆菌发酵菌剂。
31.获得可应用于海水养殖尾水处置耐盐酵母工程菌种和耐盐芽孢杆菌工程菌种产品，本发明产品活菌数大于1亿/cfu/ml，保存温度20℃下。运送至工厂化养殖场，用于海水养殖尾水处理，具体如下：如图1所示，工厂化中国对虾海水养殖区产生的带有较高浓度污染物的水先经过沉淀池进行分离，沉淀池上清液再经过过滤坝过滤，然后进入曝气池进行充氧，保持溶解氧不低于2mg/l，本发明耐盐酵母工程菌种按照1:1混合比例进行混合使用，添加入工厂化海水养殖过滤坝和生物净化池区域段，日添加量为海水养殖厂总水量的0.01%,设计曝气池 生物净化池区域的比例为整个养殖区域容积的25%，日循环次数为1次。本发明耐盐芽孢杆菌工程菌种按照1:1混合比例进行混合使用，添加入工厂化海水养殖过滤坝和生物净化池区域段，日添加量为海水养殖厂总水量的0.01%,设计曝气池 生物净化池区域的比例为整个养殖区域容积的35%，日循环次数为5次。
32.应用效果如下：海水养殖区域的水质变动情况如下：连续添加5d后，水质基本上降低至低水平的稳定状态，总氮浓度为1mg/l, 水质总氮浓度变化图如图3所示；toc浓度为0.2mg/l, 水质toc浓度变化图如图4所示，显示出本发明产品的良好的降解效果。
33.实施例2冬虫夏草发酵液和虫草头孢发酵液1：1配比制备海水水产养殖菌工程菌及应用。
34.（1）发酵液来源：冬虫夏草菌株（cordyceps）由中国农业微生物菌种保藏管理中心提供，菌种名称：蝙蝠蛾拟青霉；虫草头孢菌菌株（cordyceps）由中国农业微生物菌种保藏管理中心提供，保藏编号accc 51700。发酵培养基组成为蔗糖6%、酵母粉5%、蛋白胨1.5%、磷酸二氢钾0.4%、硫酸镁0.09%、消泡剂0.1%，深层发酵完成后，进行微滤过滤，所得滤液即为发酵液。
35.本实施例采用的是冬虫夏草和冬虫头孢发酵液按照1:1（体积比）混合后进行使用。
36.（2）耐盐酵母菌的培养（单独培养）一级液体种子培养基称取10g葡萄糖、3g酵母粉、2g蛋白胨，用1l蒸馏水加热溶解后，121℃、0.1mpa高温灭菌15min，备用。
37.一级种子液的获得：将斜面保藏的耐盐酵母菌活化2代后接入上述液体种子培养基中，20℃、100转/分钟振摇培养18h，获得一级种子液。
38.二级液体发酵培养基：冬虫夏草和虫草头孢发酵液1:1（体积比）混合，加2g/l nacl，用0.1mol/l naoh溶液调节ph值至8.0,高温灭菌15min，备用。
39.菌剂的获得：将一级耐盐酵母菌的种子液按1：100的体积比接种于二级液体发酵培养基中，30℃、180 rpm的条件下发酵培养36-60h，获得二级耐盐酵母菌发酵工程菌剂。
40.（3）耐盐芽孢杆菌的培养（单独培养）一级种子液培养基：10 g/l葡萄糖, 5 g/l酵母浸出物，5 g/l蛋白胨，8 g/l氯化钠，0 .5 g/l七水合硫酸镁，剩余用水补齐。
41.一级种子培养：取斜面保存的枯草芽孢杆菌菌种，将枯草芽孢杆菌菌种接种于装有300ml种子培养基的1l三角瓶中，接种后，在37℃，160rpm摇床培养24-36h，即制得一级种子液；二级液体发酵培养基：冬虫夏草和虫草头孢发酵液1:1混合，加3g/l nacl，用0.1mol/l naoh 溶液调节ph值至6.5,高温灭菌30min，备用。
42.二级发酵培养：将30l的所述发酵培养基装在100l发酵罐中，将一级种子液按10％的体积比例加
入发酵罐中，在37℃、220 rpm 进行发酵培养，48h后，获得耐盐芽孢杆菌发酵菌剂。
43.获得可应用于海水养殖尾水处置耐盐酵母工程菌种和耐盐芽孢杆菌工程菌种产品，本发明产品活菌数大于1亿/cfu/ml，保存温度20℃下。运送至工厂化养殖场，用于海水养殖尾水处理，具体如下：如图1所示，工厂化中国对虾海水养殖区产生的带有较高浓度污染物的水先经过沉淀池进行分离，沉淀池上清液再经过过滤坝过滤，然后进入曝气池进行充氧，保持溶解氧不低于3mg/l，本发明耐盐酵母工程菌种或者耐盐芽孢杆菌工程菌种按照1:2混合比例进行混合使用，添加入工厂化海水养殖过滤坝和生物净化池区域段，日添加量为海水养殖厂总水量的0.01%,设计曝气池 生物净化池合计区域的比例为整个养殖区域容积的50%，日循环次数为2次。
44.应用效果如下：海水养殖区域的水质变动情况如下：连续添加5d后，水质基本上降低至低水平的稳定状态，总氮浓度为1mg/l, 水质总氮浓度变化图如图5所示；toc浓度为0.2mg/l, 水质toc浓度变化图如图6所示，显示出本发明产品的良好的降解效果。
45.实施例3如图2所示，一种二级种子扩增发酵系统，包括二级发酵罐3、无菌供氧系统、包装系统6和控制系统。
46.所述无菌供氧系统包括罗茨风机4，所述罗茨风机4的出气口与空气过滤灭菌装置5的进气口连接，所述空气过滤灭菌装置5的出气口与二级发酵罐3底部的进气口连接。
47.所述包装系统6与所述二级发酵罐3底部的出料口连接。
48.所述二级发酵罐3上的发酵培养基加入口和菌液加入口分别与发酵培养基调配罐1、一级种子发酵罐2的出料口连接。
49.所述控制系统包括控制器。
50.所述二级发酵罐3内设置有中心桶10，所述中心桶上部设置有搅拌器7，所述二级发酵罐3内下部设置有蒸汽盘管8，所述蒸汽盘管与所述二级发酵罐3上的蒸汽进口连接，所述蒸汽进口出设置有自动蒸汽阀门9，与控制器电联接。
51.所述二级发酵罐3内设置有在线测量装置，包括：温度在线传感器、在线光谱法溶解氧仪、ph在线传感器、orp在线传感器、发酵液体积在线测量仪表、空气流量在线测量仪表、冷却水进出口温度在线测量仪表、搅拌马达转速在线测量仪表、搅拌马达电流在线测量仪表、泡沫高度在线测量仪表，且上述各个在线测量装置均与控制器电联接。
52.材质：与液体接触的部分全部为双相不锈钢（或者钛材）、或者是衬氟塑处理，抗酸、碱、氯盐，便于高温消毒。
53.为了强化传质效率，因为空气充氧量有限，增加了快速搅拌器，这里搅拌器的搅拌方向和作用是增加中心桶内液体的上升流速，强化气提内循环流速，中心桶的直径为二级发酵扩增罐直径的1/3，搅拌叶轮设计为三叶搅拌浆，搅拌浆的直径为中心桶直径的2/3，转速可调节，搅拌轴旋转方向是提升物料，强化传质。
54.二级种子发酵罐设有蒸汽盘管加热，配套温度在线传感器，可将温度信号发送给控制器，控制器根据接收到的温度信号控制自动蒸汽阀门开度，从而控制发酵温度在设定
的温度范围内。
55.发酵罐内底部通入灭菌过滤的空气，对发酵液进行充氧气，安装在线光谱法溶解氧仪，可将溶解氧信号发送给控制器，控制器根据接收到的溶解氧信号控制罗茨风机的转速，从而控制充氧速度。二次发酵的溶解氧控制在1-3mg/l。
56.同时发酵设备安装有ph在线传感器、orp在线传感器，发酵液体积（v）、空气流量（fa）、冷却水进出口温度（t1
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2）、搅拌马达转速（rmp）、搅拌马达电流（i）、泡沫高度（h）在线测量仪表来实现自动测量，实现过程和发酵终点监控。
57.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。