一种用于检测或区分禽呼肠孤病毒4种不同基因型的多重PCR试剂盒及其应用

一种用于检测或区分禽呼肠孤病毒4种不同基因型的多重pcr试剂盒及其应用
技术领域
1.本发明涉及一种多重pcr试剂盒及其应用，特别涉及一种用于检测或区分禽呼肠孤病毒4种不同基因型的多重pcr试剂盒及其应用。本发明属于医药技术领域。


背景技术：

2.鸡病毒性关节炎是由禽呼肠孤病毒(avian reovirus，arv)感染导致的一种以鸡关节肿胀、跛行等为主要特征的禽免疫抑制病。近年来，arv感染和流行情况呈不断加重的趋势，并且传播速度快、波及范围广，病鸡感染后表现关节肿胀、腱鞘炎、跛行等症状，arv感染可诱发免疫抑制，增强感染鸡群继发其他疾病的易感性，常引起混合感染或继发感染，死亡率高达30％～50％，给我国养鸡业带来了严重的经济损失。
3.arv是无囊膜的dsrna病毒，其基因组由10个节段组成。其中s1基因编码的σc蛋白是病毒的外衣壳蛋白和主要保护性抗原，与arv的感染、致病性和抗原变异关系密切。σc蛋白编码基因可作为arv流行毒株分型的依据，根据其遗传进化分析结果，arv分离株可分为6种基因型，其中基因ⅰ型、基因ⅰ亚型、基因ⅱ型和基因
ⅴ
型arv为我国arv流行的优势基因型。临床样品检测发现，同一个养殖场不同基因型毒株共感染或混合感染现象较为常见，因此，建立一种高效、快速的鉴别诊断方法是十分必要的。
4.arv特异性抗原检测方法是我国目前临床上比较常用的抗原检测方法，但该方法不能区分病毒基因分型，且检测结果假阳性率比较高。而像荧光定量、间接免疫荧光实验、病毒分离等抗原检测方法，因其操作繁琐、对实验仪器要求高、耗时长的局限性，也不利于大批量样品的检测。
5.本发明建立并优化了一个用于区分禽呼肠孤病毒4种不同基因型的多重pcr检测方法，该多重pcr检测方法快速、特异性好、敏感性高，适用于禽病毒性关节炎临床诊断、流行病学调查以及临床监测工作。


技术实现要素：

6.本发明的目的之一在于提供一种用于检测或区分禽呼肠孤病毒4种不同基因型的多重pcr引物组；
7.本发明的目的之二在于提供一种含有上述多重pcr引物组的，用于检测或区分4种不同禽呼肠孤病毒基因型的多重pcr试剂盒；
8.本发明的目的之三在于提供上述多重pcr引物组和试剂盒在检测或区分禽呼肠孤病毒4种不同基因型中的用途。
9.为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
10.本发明的一种用于检测或区分禽呼肠孤病毒4种不同基因型的多重pcr引物组，所述的多重pcr引物组由1条通用上游引物mgc-f，和分别用于扩增arv
‑ⅰ
、arv
‑ⅰ‑
sub、arv
‑ⅱ
以及arv
‑ⅴ
特异性基因区域的4条特异性下游引物mgc1-r、mgc1-sub-r、mgc2-r以及mgc5-r
组成，其中上游引物mgc-f的核苷酸序列如seq id no.1所示，4条特异性下游引物mgc1-r、mgc1-sub-r、mgc2-r以及mgc5-r的核苷酸序列分别如seq id no.2-5所示。
11.进一步的，本发明还提出了所述的多重pcr引物组在制备检测或区分禽呼肠孤病毒4种不同基因型的试剂中的用途，所述的arv 4种不同基因型包括arv
‑ⅰ
、arv
‑ⅰ‑
sub、arv
‑ⅱ
以及arv
‑ⅴ
。
12.更进一步的，本发明还提出了一种用于检测或区分禽呼肠孤病毒4种不同基因型的多重pcr试剂盒，所述的试剂盒中含有所述的多重pcr引物组。
13.其中，优选的，所述的试剂盒用于检测或区分禽呼肠孤病毒4种不同基因型时，其反应体系为25.0μl，包括ex taq预混酶12.5μl，上游引物mgc-f 1.0μl，下游引物mgc1-r 1.0μl、下游引物mgc1-sub-r 1.5μl、下游引物mgc2-r 1.0μl、下游引物mgc5-r 1.5μl，cdna2.0μl，ddh2o 4.5μl。
14.其中，优选的，上游引物以及下游引物的浓度均为10μm/μl。
15.其中，优选的，所述的试剂盒用于检测或区分禽呼肠孤病毒4种不同基因型时，其反应程序为：95℃5min预变性，95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸50s，35个循环，然后在72℃延伸10min。
16.相较于现有技术，本发明的有益效果是：
17.禽呼肠孤病毒感染在许多禽类养殖场中十分常见，近年来，它的流行和暴发给我国养禽业带来了严重的经济损失。因而，准确、快速、实用的诊断方法对禽呼肠孤病毒病的防控至关重要。本发明建立了一种可以对基因ⅰ型、基因ⅰ亚型、基因ⅱ型和基因
ⅴ
型4种基因型arvs进行鉴别诊断的多重pcr方法。本发明根据σc基因序列比对的结果，设计了一条通用的上游引物，四条特异的下游引物，利用这5条引物可以在一个反应体系中扩增出基因ⅰ型arv 233bp的片段，基因ⅰ亚型arv 748bp的片段，基因ⅱ型arv 546bp的片段，基因
ⅴ
型arv 297bp的片段。实验证明，该方法敏感性高，可同时检测到4种基因型病毒的103个病毒拷贝数；特异性良好，对4种基因型的病毒均具有良好的检测效果，且不会与常见的禽病病毒产生非特异性反应；对人工感染动物试验样品检测结果表明，mpcr与常规pcr方法检测结果一致，符合率为100％。
18.综上，本发明建立的mpcr方法可同时检测和区分基因ⅰ型、基因ⅰ亚型、基因ⅱ型、基因
ⅴ
型，4种基因型的禽呼肠孤病毒，方法快速、特异性好、敏感性高，可作为临床诊断和流行病学调查的简便、特异和有效的检测工具。
附图说明
19.图1为mpcr检测方法的优化；
20.其中，a、b:标准质粒模板；c、d:病毒cdna模板；泳道1-4：1，arv
‑ⅰ
；2、arv
‑ⅰ‑
sub；3、arv
‑ⅱ
；4、arv
‑ⅴ
；n:阴性对照；m:dl2000 dna标记；
21.图2为多重pcr的特异性检测结果；
22.其中，m:dl2000 dna标记；泳道1:arv
‑ⅰ
；泳道2:arv
‑ⅰ‑
sub；泳道3:arv
‑ⅱ
；泳道4:arv
‑ⅴ
；泳道5:mdv；泳道6:iltv；泳道7:fadv；泳道8:ciav；泳道9:rev；泳道10:alv；泳道11:ibdv；泳道12:ndv；泳道13:aiv；泳道14:ibv；泳道15:ddh2o；
23.图3为多重pcr灵敏度检测结果；
24.其中，a、b、c、d:arv
‑ⅰ
、arv
‑ⅰ‑
sub、arv
‑ⅱ
和arv
‑ⅴ
的常规pcr；e:mpcr；泳道1-10:arv
‑ⅰ
、arv
‑ⅰ‑
sub、arv
‑ⅱ
和arv
‑ⅴ
阳性质粒浓度范围为10
10
拷贝/μl至101拷贝/μl；n:阴性对照；m:dl2000 dna标记；
25.图4为多重pcr的重复性检测结果；
26.其中，a:批内重复性测试；b:批间重复性测试；n:阴性对照；m:dl2000 dna标记。
具体实施方式
27.下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明不限于以下实施例。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神及范围下可对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
28.实施例1引物设计及合成
29.从genbank中下载arv
‑ⅰ
、arv
‑ⅰ‑
sub、arv
‑ⅱ
、arv
‑ⅴ
参考毒株的σc基因序列，进行序列分析，在4种基因型共同的保守基因区域设计1条通用上游引物(mgc-f)，在不同基因型特异性基因区域设计4条特异性下游引物(mgc1-r，mgc1-sub-r，mgc2-r和mgc5-r)(见表1)。其中，mgc-f与mgc1-r可以扩增出一条233bp的arv
‑ⅰ
片段，mgc-f与mgc1-sub-r可以扩增出一条748bp的arv
‑ⅰ‑
sub片段，mgc-f与mgc2-r可以扩增出一条546bp的arv
‑ⅱ
片段，mgc-f与mgc5-r可以扩增出一条297bp的arv
‑ⅴ
片段。
30.表1 arvs多重pcr(mpcr)引物
[0031][0032]
实施例2一种区分禽呼肠孤病毒4种不同基因型的多重pcr(mpcr)方法的建立及应用
[0033]
1方法
[0034]
1.1构建标准质粒
[0035]
使用primestar gxl dna polymerase以及实施例1设计并合成的引物对arv各基因型的σc基因进行pcr扩增，将扩增后pcr产物纯化并连接至pmd18-t载体，筛选阳性克隆进行测序。经鉴定正确的重组质粒分别命名为pmd-arv
‑ⅰ
、pmd-arv
‑ⅰ‑
sub、pmd-arv
‑ⅱ
和pmd-arv
‑ⅴ
。
[0036]
1.2条件优化
[0037]
将反转录的arv
‑ⅰ
、arv
‑ⅰ‑
sub、arv
‑ⅱ
、arv
‑ⅴ
病毒cdna分别稀释到1000ng/μl,等
量混合后作为模板，优化mpcr反应条件。在25.0μl反应体系中，对引物浓度，模板cdna浓度，退火温度，pcr循环数等条件以棋盘法进行优化。
[0038]
1.3 mpcr的特异性
[0039]
以arv4种基因型(arv
‑ⅰ
、arv
‑ⅰ‑
sub、arv
‑ⅱ
、arv
‑ⅴ
)的cdna以及其他禽类病毒基因组(马立克病病毒(mdv)、鸡传染性喉气管炎病毒(iltv)、禽腺病毒(fadv)、鸡传染性贫血病毒(ciav)、网状内皮增生病病毒(rev)、禽白血病病毒(alv))或cdna(鸡传染性囊病病毒(ibdv)、新城疫病毒(ndv)、禽流感病毒(aiv)、传染性支气管炎病毒(ibv))为模板，以上述优化反应条件进行mpcr扩增，检测该方法的特异性。每个样品做3个重复，同时设置阴性对照。
[0040]
1.4多重pcr检测的敏感性
[0041]
将上述构建的4种重组质粒分别进行10倍倍比稀释，从1
×
10
10
copies/μl到1
×
101copies/μl。同时，将这4个质粒等量混合后再进行上述倍比稀释，用已经建立好的mpcr扩增，以检测该多重pcr方法的敏感性。每个样品做3个重复，同时设置阴性对照。
[0042]
1.5多重pcr检测的重复性
[0043]
利用上述建立的mpcr方法，对3份arv不同基因型cdna混合物进行检测，每份样品做3个重复，以相同批次和不同批次的pcr扩增结果进行统计，分别进行批内和批间重复性检测。
[0044]
1.6 mpcr检测方法在临床样本中的应用
[0045]
选用人工感染不同基因型arv动物实验样品102份(样品记录、顺序打乱并编号)，以建立的mpcr方法进行检测，统计各基因型的检出结果。首先，将102份样品随机分为4组，提取其病毒rna，反转录为cdna，依次作为mpcr的模板。同时，对上述样品进行常规pcr检测，统计各基因型的检出结果，计算其检出率，并对mpcr及常规pcr符合率进行比较。
[0046]
2结果
[0047]
2.1mpcr方法的建立与优化
[0048]
经多次优化后，最终确定了mpcr方法的反应体系及反应程序。反应体系为25.0μl，包括ex taq预混酶12.5μl，上游引物mgc-f 1.0μl，下游引物mgc1-r 1.0μl、mgc1-sub-r 1.5μl、mgc2-r 1.0μl、mgc5-r 1.5μl，引物浓度均为10μm/μl)，cdna2.0μl，ddh2o 4.5μl。反应程序：95℃5min预变性，95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸50s，35个循环，然后在72℃延伸10min。利用上述优化条件，mgc-f和mgc1-r、mgc1-sub-r、mgc2-r、mgc5-r引物分别扩增出233bp、748bp、546bp和297bp的条带，与预期结果一致(图1)。
[0049]
2.2 mpcr方法的特异性
[0050]
利用本发明建立的mpcr方法仅能对arv4种基因型(arv
‑ⅰ
、arv
‑ⅰ‑
sub、arv
‑ⅱ
、arv
‑ⅴ
)cdna扩增获得特异性条带，可获得预期大小的扩增产物。而对mdv、iltv、fadv、ciav、rev、alv、ibdv、ndv、aiv、ibv其他禽类病毒基因组或cdna扩增均未见特异性扩增。结果表明，本发明建立的mpcr方法特异性良好(图2)。
[0051]
2.3 mpcr方法的敏感性
[0052]
多重pcr方法的灵敏度定义为可检测到的最小dna分子浓度。为了确定本发明建立的mpcr的敏感性，将含有这4种病毒序列的质粒dna分别10倍倍比稀释(10
10
拷贝/μl～101拷贝/μl)，并以此为模板进行mrcr，以在pcr中可见靶基因特异性条带的dna模板的最高稀释
度为检测限。结果显示，mpcr对arv
‑ⅰ
、arv
‑ⅰ‑
sub、arv
‑ⅱ
和arv
‑ⅴ
的最低检测下限分别为102、102、101和103个病毒拷贝(图3e)。而常规pcr对arv
‑ⅰ
、arv
‑ⅰ‑
sub、arv
‑ⅱ
和arv
‑ⅴ
的最低检测下限分别为103、103、103和102个病毒拷贝(图3a-d)。结果表明，mpcr的灵敏度优于常规pcr。
[0053]
2.4 mpcr方法的重复性
[0054]
选择3份arv不同基因型cdna的混合物分别进行批间和批内重复试验，结果显示，批内和批间重复性试验检测结果重复性良好(图4)，表明本发明建立的mpcr方法具有良好的重复性。
[0055]
2.5 mpcr方法对临床样本的检测
[0056]
分别利用本发明建立的mpcr和常规pcr方法对102份arv人工感染试验组织样本进行检测，并将两者的检测结果进行比较，结果表明，这4种基因型病毒总检出率为90.20％(92/102)，其中mpcr检测结果为：19份arv
‑ⅰ
阳性，25份arv
‑ⅰ‑
sub阳性，22份arv
‑ⅱ
阳性，26份arv
‑ⅴ
阳性，与常规pcr方法检测结果一致，符合率为100％，进一步证明了mpcr方法的准确性。