一种蛋白磷酸酶OsPP74在提高水稻磷吸收中的应用的制作方法

一种蛋白磷酸酶ospp74在提高水稻磷吸收中的应用
(一)技术领域
1.本发明涉及一种反向遗传学途径克隆的水稻ospp74(protein phosphatase 74)基因，并且通过超表达技术及基因编辑技术鉴定该了基因的功能；还涉及利用该基因产物提高水稻的磷吸收、利用效率。
(二)

背景技术：

2.磷是植物生长发育过程中一种不可或缺的大量营养元素(raghothama，1999)，它是植物体内atp、磷脂和核酸等许多代谢物和大分子的重要组成部分，参与了基因表达、信号转导等大量的生化途径(liu et al.,2015)。磷主要以正磷酸盐(pi，无机磷酸盐)的形式被植物体吸收利用。由于其本身的化学特性，磷容易被土壤中的阳离子或有机化合物固定(hirsch et al.,2006)，因而在土壤中迁移率低，可利用率低。正是这些原因使得大约70％的耕地中有效磷含量都低于植物营养生长和生殖生长所需要的最适浓度(herrera
‑
estrella and lopez
‑
arredondo.,2016)。可利用磷(有效磷)低也因此成为了影响农作物生长和农业生产的限制因素。
3.蛋白磷酸化修饰是一种常见的翻译后修饰。其由蛋白激酶和蛋白磷酸酶两种相互拮抗作用的酶催化完成(uhrig et al.,2013)。蛋白磷酸化修饰通过影响蛋白的开启、关闭或改变蛋白的定位等调节机体的多种生命活动。例如：在水稻中证明蛋白激酶 osck2α3/β3可以通过磷酸化ospt，从而减弱其与phf1(pt traffic facilitator)(chenet al.,2011)的相互作用，并导致pt滞留在内质网中，最终影响植物体内磷平衡(chenet al.，2015)。因此，通过改变水稻中pt分子中蛋白激酶ckii磷酸化位点的氨基酸性质，可使水稻表现出耐低磷和提高低磷条件下的生物量和产量。实验室已经发现 pp95通过调控水稻磷转运体的磷酸化水平，从而影响其从内质网向质膜的转运及植物体内磷稳态(yang et al.,2020)。逐渐我们开始认识到磷酸化修饰在调控磷稳态中的重要性，但是磷酸化调控的分子机理还有待研究。
4.我们通过反向遗传学方法筛选到参与水稻磷吸收调控的蛋白磷酸酶ospp74。超表达ospp74能够显著提高水稻的磷吸收效率，在分子育种中存在较大的应用潜力。
(三)

技术实现要素：

5.本发明目的是提供一种蛋白磷酸酶ospp74在提高水稻磷吸收中的应用，本发明从水稻中克隆基因ospp74，超表达ospp74能够显著提高水稻的磷吸收效率，在分子育种中存在较大的应用潜力。
6.本发明采用的技术方案是：
7.本发明提供一种蛋白磷酸酶ospp74在提高水稻磷吸收中的应用，所述蛋白磷酸酶ospp74具有磷酸酶活性，氨基酸序列为seq id no：2所示，编码基因的核苷酸序列为seq id no：1所示。
8.由于核苷酸序列的特殊性，任何seq no：1所示多核苷酸的变体，只要其与该多核
苷酸具有90％以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以使生的等位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的氨基酸的功能。
9.由于氨基酸序列的特殊性，任何含有seq no：2所示氨基酸序列的多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在95％以上，均属于本发明保护范围之列。具体的，所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。
10.本发明蛋白磷酸酶ospp74在提高水稻磷吸收中的应用方法为：将蛋白磷酸酶 ospp74编码基因连接入pcambia1300
‑
35s
‑
gfp载体，转化大肠杆菌，测序正确后，抽质粒，转农杆菌eha105，后利用农杆菌介导法将载体转入水稻基因中，构建获得磷吸收效率提高的水稻植株。
11.与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：蛋白磷酸酶ospp74首次被发现参与水稻磷吸收调控，在植株体内增加蛋白磷酸酶ospp74基因的表达，提高水稻的磷吸收、利用效率。本发明丰富了磷吸收、转运调控机制研究，为水稻相应缺磷胁迫提供参考机制，而且在分子育种中存在较大的应用潜力。
(四)附图说明
12.图1为ospp74基因pcr产物电泳结果。
13.图2为ospp74蛋白的原核表达和酶活鉴定；a为gst
‑
ospp74原核蛋白表达图； b为ospp74蛋白酶活鉴定图。
14.图3为ospp74的组织表达；a为苗龄1周的水稻整株染色，bar＝1mm；b为叶片脱色后切片，bar＝50μm；c为苗龄2个月水稻未开的花序，d和e分别为花的雌蕊和雄蕊bar＝1mm；f为苗龄1周的水稻根中部的切片bar＝50μm；g为根尖bar ＝1mm；h为根尖的纵切图bar＝50μm。
15.图4为ospp74在原生质体中的亚细胞定位；a为35s
‑
pp74
‑
gfp在gfp波长下的荧光；b为商业化内质网定位标记marker；c在普通光下的原生质体；d为abc 的合并结果，bar＝5μm。
16.图5为ospp74在水稻中的亚细胞定位的显微图，35s
‑
pp74
‑
gfp为pp74
‑
gfp融合蛋白的gfp荧光观察结果，bright明场视野，merged为gfp和明场合并的结果。
17.图6为ospp74超表达株系及rnai转基因株系的定量rt
‑
pcr鉴定结果。nip 表示野生型；ov
‑
3、ov
‑
4、ov
‑
5表示ospp74三个转基因超表达株系；ri
‑
4、ri
‑
16 表示ospp74两个rnai的转基因株系。***表示显著性(p<0.01)。
18.图7为ospp74超表达及rnai转基因株系的表型；a、c图分别是nip、ospp74 超表达株系(ov
‑
3、ov
‑
4、ov
‑
5)和rnai转基因株系(ri
‑
4、ri
‑
16)发芽后在正常磷(200μm pi)培养条件下7天的表型；b、d、e图分别为nip、ospp74超表达株系(ov
‑
3、ov
‑
4、ov
‑
5)、rnai转基因
株系(ri
‑
4、ri
‑
16)发芽后在正常磷培养下7天苗的不定根数(b)和主根长、(d)、株高(e)统计数据；f、g图分别是nip、 ospp74超表达株系(ov
‑
3、ov
‑
4、ov
‑
5)和rnai转基因株系(ri
‑
4、ri
‑
16)发芽后在正常磷(200μm pi)培养条件下30天的表型；h图是nip、ospp74超表达株系(ov
‑
3)和rnai转基因株系(ri
‑
4)发芽后在正常磷(200μm pi)培养条件下30天苗的叶片表型。a、c图中bar＝1cm,f、g图中bar＝10cm，h图中bar＝2cm。***表示显著性差异(p<0.01)。
19.图8为ospp74超表达株系(ov
‑
3、ov
‑
4、ov
‑
5)及rnai转基因株系(ri
‑
4、 ri
‑
16)有效磷含量测定。a、b分别是在高磷(200μm pi)条件下培养30天苗的有效磷含量；c、d分别是在低磷(10μm pi)条件下培养30天苗的有效磷含量。*表示显著性(p<0.05),**表示显著性(p<0.01),***表示显著性(p<0.01)。
20.图9为ospp74超表达株系(ov
‑
3、ov
‑
4、ov
‑
5)及rnai转基因株系(ri
‑
4、 ri
‑
16)各元素含量测定。a为ospp74超表达株系及rnai转基因株系地上部分元素含量测定；b为ospp74超表达株系及rnai转基因株系根部的元素含量测定。*** 表示显著性(p<0.01)。
21.图10为用于研究的载体结构示意图；a为gst原核表达载体示意图；b为 pucm
‑
t载体图。
(五)具体实施方式
22.下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
23.实施例1、os pp74原核表达、纯化
24.1、gst
‑
ospp74载体构建
25.为明确ospp74具有蛋白磷酸酶活性，我们对其进行了原核表达并纯化。以野生型水稻日本晴(oryza sativa japonica group(taxid:39947))cdna为模版，用ospp74 全长扩增引物，用kod fx酶(购自toyobo)pcr扩增出ospp74全长编码序列 (seq id no.1所示，氨基酸序列为seq id no.2所示)，目的片段大小为1452bp。直接用gel and pcr clean
‑
up试剂盒(购自macherey
‑
nagel)回收后用clone
ꢀⅱ
one step cloning kit(购自诺唯赞)试剂盒连于ecori、bamhi(购自thermofisher scientific)酶切的pgex
‑
4t
‑
1载体(即为gst，购自ge healthcare，图谱见图 10中a)，转化大肠杆菌dh5α(购自takara)，提取阳性克隆，测序正确后，用质粒抽提试剂盒(购自macherey
‑
nagel)抽质粒，获得gst
‑
ospp74质粒。
26.ospp74全长扩增引物：
27.上游引物为：gttccgcgtggatccatggatgccaactcc；
28.下游引物为：tcgacccgggaattcttactggaacatcct。
29.pcr扩增体系为：
[0030][0031]
pcr扩增程序：
[0032][0033][0034]
pcr扩增后，得到一条1452bp大小目的片段(图1)。
[0035]
2、原核表达、纯化
[0036]
将构建完成的gst
‑
ospp74质粒和空载体gst(pgex
‑
4t
‑
1)分别转入大肠杆菌 bl21(de3)表达菌株(购自transgen biotech)，具体操作为：
[0037]
1)挑步骤1阳性单克隆在10ml具有100mg/l amp抗性的lb培养基中，37℃摇过夜，然后取5ml接种到500ml具有100mg/l amp抗性的lb培养基中，37℃摇3h左右。室温放置冷却。
[0038]
2)加入100mm异丙基硫代半乳糖苷(iptg)水溶液500μl，20℃，100rpm摇 16h诱导融合蛋白表达。
[0039]
3)离心(5000rpm，10min，4℃)，收集菌体(菌体可在
‑
20℃保存)。
[0040]
4)加入20ml 1xpbs(ph7.4)重悬，加入200mm的蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(pmsf)水溶液200μl。置于冰上超声破碎。超声破碎参数为：保护温度25℃，总时间20min，超声开、关间隔均为2s(变幅杆02φ06，scientz
‑
iid超声波细胞破碎仪)。
[0041]
5)离心(12000g，10min，4℃)，取上清。
[0042]
6)取3ml glutathione sepharose 4fast flow beads(gst柱材料，购自gehealthcare)，装柱(ge healthcare试剂盒提供的tricorn
tm
10/100柱子)后用1x pbs 洗2
‑
3遍。将上述离心所得上清加入柱中，在4℃摇1h。去掉液体后用50mm tris
‑
hcl (ph 8.0)洗填料
‑
产物复合物一次。
[0043]
7)用洗脱液洗脱融合蛋白，收集流出液，即为纯化蛋白。洗脱液组分为：50mmtris
‑
hcl(ph 8.0)，10mm还原型谷胱甘肽。
[0044]
8)加入等体积甘油分装后保存在
‑
80℃，即为gst
‑
pp74蛋白溶液。
[0045]
取10ul纯化蛋白跑page胶考染观察蛋白纯化效果。蛋白考染后结果为图2中a，前四个孔25kda处为gst空蛋白，作为实验对照，后四个泳道为gst
‑
ospp74蛋白，大小大约70kda。
[0046]
3、酶活检测
[0047]
酶活是指酶催化底物化学反应的能力。因此，测定的酶活，实际上就是测定酶促反应进行的速度，酶促反应速度越快，酶活就越大；反之，速度越慢，酶活越小。
[0048]
在温度为25度条件下，1分钟内转化1微摩尔底物硝基苯酸钠(pnpp)所需的 gst
‑
ospp74酶量为一个活力单位(u)。其他条件取反应的最适条件。试剂准备：将所有试剂取出，恢复至室温使用。
[0049]
配置显色底物溶液：
[0050]
母液1(2
×
)：ph 7.6、150mm tris，200mm nacl，1mm edta。
[0051]
母液2(100
×
)为下列金属盐水溶液之一：用去离子水分别配制1m zncl2水溶液， 1m mncl2水溶液，1m cacl2水溶液，1m mgcl2水溶液。
[0052]
显色底物溶液配方：母液1(2
×
)11.347ml，母液2(终浓度10mm)26.9ul，硝基苯酸钠(pnpp，购于sigma)1片(5mg)，h2o补足到22.694ml。
[0053]
注：新鲜配制的显色底物溶液需在6h内使用。
[0054]
取60ul显色底物溶液 40ul步骤2制备的gst
‑
pp74蛋白溶液(含0.3ug蛋白)，混匀后立即放入酶标仪(spectroquant nova 60spectrophotometer，merck)中，检测 405nm吸光度，温度设为37℃，每2min测一次，测25次，取平均值a405。根据磷酸酶标准曲线，算出测得的a405值相对应酶活性，利用graphpad prism 5对数据进行作图，结果见图2中b。
[0055]
根据硝基苯酸钠(pnpp)磷酸酶检测试剂盒(sigma)测定的磷酸酶标准曲线： y＝3450x
‑
246.7，y为吸光值，x为磷酸酶酶活。
[0056]
通过对原核表达的ospp74蛋白进行酶活鉴定，用酶标仪检测溶液在405nm的吸光度值。当磷酸酶与磷酸酶底物硝基苯酸钠(pnpp)反应时，会形成黄色水溶性反应产物，该产物在405nm有光吸收，所以405nm的吸光度值的升高就说明了酶有活性，可以和pnpp反应，生成产物的浓度不断升高。实验发现mn
2
存在时，ospp74 蛋白磷酸酶活性约有200nmolμg
‑1min
‑1(图2中b)。而在zn2、ca
2
、mg
2
存在时， ospp74几乎没有磷酸酶活性。以上实验说明ospp74蛋白磷酸酶功能的发挥需要有 mn
2
存在。
[0057]
实施例2、ospp74
‑
gus融合基因载体的构建及gus染色
[0058]
1、pbi101.3
‑
ospp74
pro
‑
gus plus载体构建：从rice genome annotationproject(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)搜索loc_os05g11550基因号，获得 ospp74基因的基因组信息，选取ospp74基因开放阅读框前2500bp的启动子，设计如下引物，以野生型水稻日本晴基因组(oryza sativa japonica group(taxid:39947)) 为模版，按照实施例1的方法进行pcr扩增得到ospp74启动子(核苷酸序列为seqid no.3所示)，直接用gel and pcr clean
‑
up试剂盒(购自macherey
‑
nagel) 回收后用cloneⅱone step cloning kit(购自诺唯赞)试剂盒连于hindiii、 sali(购自thermo fisher scientific)酶切的pbi101.3
‑
gus plus载体(yue et al.,2010)，转化大肠杆菌dh5α(购自takara)，提取阳性克隆，测序正确后，用质粒抽提试剂盒(购自macherey
‑
nagel)抽质粒，获得质粒pbi101.3
‑
ospp74
pro
‑
gus plus。经测序验证后，将接有gus的ospp74启动子的质粒pbi101.3
‑
ospp74
pro
‑
gus plus 转入农杆菌eha105(购自takara)，通过侵染，整合进野生型水稻日本晴基因组中 (wang et al.,2014)，通过潮霉素筛选获得t0代gus转基因株系。
[0059]
上游引物：cccaagctttgtcacagtattgagtgaac
[0060]
下游引物：acgcgtcgacgatagtttcccttgagcttt
[0061]
扩增产物(seq id no.3)：cacagtattgagtgaactgtcacagattgtcaa gtgtccatggctgctcctgatgataagggtgtgtcagtatgtgtatggacgatt ttgtttctgctgctaagatttcttattgcaaatgcttgtttcgtgcttaatttgg gtatgctattcaatcaacagtaacaaccatagtatcaaaattatgtttagggg gtaaactatttgatatgtgccattgaggagtaaaaggttttgaaacttgcaatt gtaaagtttactctgccttacataccacaccaagttcccatcttctgaaatatg ccaatgtggagatatttagaccatgtttccctttttcttatcttcctcattcctg cacctaattccattgcttccatctcatctaccaccgacatattgacggagaatg gccatatgacaagctccagtgacaagattggtgaaggaaaatcactggttgtg gctggcggcctcagctcgcagggggtggacctctgctgttcggtgtcctctgag catggccagacagggctagagctgggtaggaggcgagacggagatggatgcc gaccttgacctcgacgggataggtggagtggcaccggctagctggctctatta ggcattaggcggctgaactacctcgggtgatgttttgtcgctattctagtgtta tatagtctagtttttatgtaatatgcttgctaatttcttgggtttgactagttgg gttgacctaggcgctaggtgccacctagctgcccgactagctgccttcttgaac catgagttcatattgcaatggcatgattctaaggcacaacttcataatggcatt tttcaaaattggtaacttcataatggtatatatttacctattctaaagggctctt tgagggacaacattaactagaaagatctggccgttgattaggtggattgtaat acgtggccatatgtcatactaagagtttgtattatacaaatcatttagataaaa taagagtccacctcattttaaaaagagagtccatatatcatatgtaatctactc cttaataattctgaattttggaattattaaactgtgaaaaagaactaattatag agctccaaactgagtaaaactcaatatctatcgattccagattttagaattatt aatccatgaaacatgctaaactaaaactccaacacaaatacaattagatacct tttaattccaaaatattaaataaattgtgaaaacaacggaagatacattagaa tggattctgaatttagcattatattaatttaaatctaaaatgtgggagaattag aaaatggaacagttggtgatcatgtgaaatgggcatgctttgttcttgattatg tctaatgaactccgaccaagctcaggtgagatgtgagtattcagataggctta ggctgtgtttggtagttggaggtgggaactgggaactaatccctcgtgcactta gaacagaacgactcattagtgcatgattaattaagtattagtttttctttaaaa aatggattaatatgattttttaaagcaactttcctatagaaactttctaaaaat taaatcgtgtagcagtttgggaagcgaaagggttgagtttgggaaagttgagt gaagaacacagccttatatgagcctgtgatttgttggttattgggggaagaga tctccaaatgcaaaatgtatccgtatctgcagaaatgcagagttttgttggatc agctctatggtctgcagggccttgtccaaaccttggtttggcaggaaatcactg cccatcctgtattcgtatctctataagaatgattactctgttactttttaacttt ggttcctggcaattctgattccttgtagtttttagggcatgtctggtttgttgtc caaacgagccttaccaaaatctagcgatgttaaaccttgggcatattttctgct aaagtataggctatataggctacaagtcacgaagtatggccaattccgttaat gttaccaaatttaggtatggcttgaaatggaaataaaccatatgcagcctccct tctctggagctgtttggcagtgctggctgcagtgcagctgcgctggagcaacc agccacagctgccttaaagacagccatgcttgggcgagttagacggctacagc acaactgcagccgcagccgcagccaatgtttctaaaaagcccctctaccttttg ctcacgtgctttatgatccacactccaggctaattgtttctaatacatggatgc ctcttggtgtgaaatatgcatgatttttctacccaatatgctggggcattgtttc tacttaatgttgtccgtagccgtaatactcctgcattttttaattatatctggta atttattttttgctgcaaatgtattctattggtacaggacttgaaattctgtgta tgaagtagcatttactggagaaagctcaagggaaactatc
[0062]
2、gus染色及显微观察
[0063]
(1)将步骤1获得的t0代gus转基因株系苗的根部浸入表1配方的正常营养液(200μm pi)中，在培养室培养，培养室光周期为14h光培养/10h暗培养；昼夜温度分别为30/22℃；灯泡光源，光照强度为200μmol m
‑2s
‑1；湿度为60％。以下实施例水稻水培环境如无特别说明均为此条件培养。
[0064]
表1、营养液配方
[0065][0066]
将gus转基因株系苗在正常营养液中培养7天后，整株苗浸入装满表2配方的 gus染液的50ml离心管中，常温(25
‑
30℃)抽真空20min，然后37℃温浴，待样品出现蓝色之后，转入faa固定液中(甲醛：冰乙酸:体积浓度70％乙醇水溶液＝1: 1:18，v:v:v)，抽真空1min，终止反应，相机拍照(nikon d70s)，见图3中a。取a中根部，在leica mz95体视镜下观察，用leica dc100摄像头拍照，样品中的蓝色位点即为gus表达位点(图3中g)，从根的表面看，ospp74基因在根尖和根的表皮都有明显表达。将拍照后的gus转基因株系苗的根用琼脂糖包埋后，使用震动切片机进行切片，分别进行横切(图3中f)和纵切(图3中h)，leica mz95 体视镜下观察，用leica dc100摄像头拍照，证明ospp74基因在根的表皮表达较强，而在中柱几乎不表达。
[0067]
表2、gus染液组成
[0068][0069]
[0070]
(2)选取另一株培养7天的gus转基因株系苗的叶片，剪取长0.5cm左右，浸泡在装满表2gus染液的2ml离心管中，同步骤(1)整株苗一样染色后，将叶片转入体积浓度70％乙醇水溶液中脱色2
‑
3次，至叶片呈白色为止，后使用震动切片机进行切片，leica mz95体视镜下观察，用leica dc100摄像头拍照，图3中b，发现ospp74基因在叶片中的维管束和叶肉细胞中都有表达。
[0071]
震动切片过程为：样品用4％的琼脂糖包埋，琼脂糖凝固后修块，将修好的样品块用502胶水粘固在样品台上，使用震动切片机切片(leica)，切片厚度为50μm。
[0072]
(3)将t1代gus转基因株系苗根部浸入表1正常营养液(200μm pi)，同步骤(1)在培养室培养2个月，期间7天换一次营养液，到花期时用镊子夹取10个未完全开放的花浸泡在装满表2gus染液的2ml离心管中，按上述步骤(1)方法gus 染色后，在leica mz95体视镜下观察，用leica dc100摄像头拍照，观察到在花 ospp74在颖壳外表面有少量的表达(图3中d)，在柱头和花柱(图3中d,e)以及花药(图3中d,f)上有大量表达。
[0073]
实施例3、ospp74的亚细胞定位
[0074]
1.pcambia1300
‑
35s
‑
ospp74
‑
gfp表达载体构建
[0075]
用引物pcambia1300
‑
35s
‑
gfp f和pcambia1300
‑
35s
‑
gfp r，按照实施例1 步骤1的方法，扩增出的pp74目的片段(seq id no.1所示)进行sali单酶切，并用cloneⅱone step cloning kit(购自诺唯赞)试剂盒连于相同酶切的 pcambia1300
‑
35s
‑
gfp载体(yue et al.,2010)，转化大肠杆菌dh5α(购自takara)，测序正确后，用质粒抽提试剂盒(购自macherey
‑
nagel)抽质粒，获得 pcambia1300
‑
35s
‑
ospp74
‑
gfp载体，即为35s
‑
ospp74
‑
gfp。
[0076]
将pcambia1300
‑
35s
‑
ospp74
‑
gfp转入农杆菌eha105(购自takara)，通过农杆菌浸染整合进野生型水稻日本晴基因组中(wang et al.,2014)，获得35
‑
ospp74
‑
gfp 转基因苗t2代苗。
[0077]
pcambia1300
‑
35s
‑
gfp f：acgcgtcgacatggatgccaactccagttt
[0078]
pcambia1300
‑
35s
‑
gfp r：acgcgtcgacctggaacatcctgaggaagt
[0079]
2.水稻根中gfp荧光的观察
[0080]
将实施例3第1步获得的35
‑
ospp74
‑
gfp转基因苗t2代苗根部浸入表1配方的正常营养液(200μm pi)中，在培养室培养，培养室光周期为14h光培养/10h暗培养；昼夜温度分别为30/22℃；灯泡光源，光照强度为200μmol m
‑2s
‑1；湿度为60％。培养20天。取根部幼嫩的根尖约10cm放到载玻片上，加适量的水防止根失水，后盖上盖玻片；用双光子显微镜(lsm710nlo)进行荧光观察制片，结果见图5，发现ospp74 在水稻根尖表皮细胞的细胞质和细胞核中都有表达(图5中35
‑
pp74
‑
gfp)， 35s
‑
pp74
‑
gfp为pp74
‑
gfp融合蛋白的gfp荧光观察结果，bright为明场视野，merged 为gfp和明场合并的结果。根据gfp的定位可知ospp74是一个核质共定位蛋白。
[0081]
3.聚乙二醇(peg)介导的原生质体的转化
[0082]
将步骤1获得的35s
‑
ospp74
‑
gfp质粒和商业化内质网定位标记marker载体er
‑
rk (购自abcam)共转水稻原生质体，步骤如下：
[0083]
(1)愈伤悬浮细胞培养和原生质体制备
[0084]
在超净工作台，用镊子挑取诱导培养基上球状淡黄色的自然分裂的野生型水稻日
本晴(oryza sativa japonica group(taxid:39947))的胚性愈伤组织(具体愈伤组织的培育参考(wang et al.,2014))，取数颗愈伤放入含50ml r2s培养基的150ml的灭菌锥形瓶中，在26℃、120rpm摇床中进行暗培养。愈伤悬浮细胞每周要继代一次，每次继代从原锥形瓶中吸取3ml的悬浮愈伤颗粒到新的无菌锥形瓶中。将继代4天后的愈伤颗粒，倒入50ml灭菌离心管中，待愈伤沉淀到管底后，弃上清；将10ml酶解液倒入愈伤中，将酶解液连带着愈伤一起转移到9cm直径的培养皿里，在30℃培养箱中晃动的暗培养3
‑
5h后静止30min，在光学显微镜下用细胞板(购自thermofisher) 计算原生质体数量；酶解结束后，轻轻吹打几次将混合物一起通过0.45μm微孔尼龙膜(购自millipore)，将原生质体(即滤液)过滤到新50ml离心管中；将培养皿和尼龙膜用四倍体积预冷的w5溶液洗涤，将滤液滤到含有原生质体的离心管中，将离心管放置到冰上30分钟；将离心管离心100
‑
120g、10min、室温(降速调为1，降速约为2rpf/s)；用悬浮液重悬原生质体沉淀，即为原生质体悬液，原生质体浓度达到 1.5
‑
2.5*106/ml。
[0085]
r2s培养基组成：kno
3 4g/l、(nh4)2so
4 335mg/l、mgso4·
7h2o 250mg/l、 cacl2·
2h2o 150mg/l、nah2po4·
h2o 241mg/l、na2edta
·
2h2o 7.5mg/l、 feso4·
7h2o 5.5mg/l、mnso4·
h2o 1.41mg/l、znso4·
7h2o 2.2mg/l、cuso4·
5h2o 0.125mg/l、na2moo4·
2h2o 0.125mg/l、h3bo
3 3mg/l、2,4
‑
d(2,4
‑
二氯苯氧乙酸) 2mg/l、100xkao&michayluk维生素液(sigmak3129)10ml/l、蔗糖30mg/l，溶剂为水，用1m koh调ph到5.6
‑
5.8。
[0086]
每10ml酶解液组成：r2s培养基10ml，甘露糖醇0.73g，纤维素酶r
‑
10 (cellulase"onozuka"r
‑
10，yakult 130918
‑
01)0.4g，离析酶r
‑
10 (macerozymer
‑
10，yakult 180509
‑
01)0.02g，driselease(sigma d9515)0.08g。将酶解液各组分室温搅拌至完全溶解，用1m koh调ph＝5.6，用0.22μm滤膜过滤备用。
[0087]
每升悬浮液配方(溶剂为水，用1m koh调整ph＝5.7)：
[0088][0089]
(2)peg介导的原生质体的转化
[0090]
在2ml离心管中将35s
‑
ospp74
‑
gfp和er
‑
rk质粒各加10μl(各10
‑
20μg)和100μl 由步骤1)制备的原生质体悬液混匀；沿离心管壁缓缓加入110μl 40％peg溶液，并立即混匀，室温孵育20min；等孵育结束，加入440μl w5溶液，轻轻混匀后120g、 1min离心；加入50μl w5溶液重悬沉淀，用枪吹打混匀后加入1ml含0.4m甘露醇 (mannitol)的r2s培养基，轻轻摇匀，30℃过夜培养，观察荧光。结果见图4，发现ospp74在原生质体中定位于细胞核和细胞质中，在内质网上也有定位，但是在核仁和液泡内没有，再次证明ospp74确实是一个核质共定位蛋白。
[0091]
每升w5溶液组成(溶剂为水，用1m koh调整ph＝5.8)：
[0092][0093]
每10ml 40％peg组成(溶剂为水，用1m koh调节ph＝7.0)：
[0094][0095]
实施例4、ospp74转基因株系构建
[0096]
1.ospp74超表达株系
[0097]
将实施例3获得pcambia1300
‑
35s
‑
ospp74
‑
gfp载体转入农杆菌eha105(购自 takara)，通过农杆菌整合进野生型水稻日本晴基因组中(wang et al.,2014)，通过潮霉素(hygromycin)抗性筛选获得ospp74超表达株系ov
‑
3，ov
‑
4，ov
‑
5。
[0098]
2.ospp74rnai转基因株系
[0099]
rna干扰(rna interference,rnai)是指在进化过程中高度保守的、由双链 rna(double
‑
stranded rna，dsrna)诱发的、同源mrna高效特异性降解的现象。 rnai载体构建的具体步骤为：
[0100]
1)通过序列比对查找ospp74编码cds基因的特异区域(与水稻其他基因同源性较低的区域)作为干涉的靶位点，设计引物(pp74
‑
rnai
‑
f、pp74
‑
rnai
‑
r)，以野生型水稻日本晴(oryza sativa japonica group(taxid:39947))cdna为模版，按照实施例1的方法，经pcr克隆该区域的一段大小为180bp的靶序列，记为pp74片段，核苷酸为seq id no.4所示。
[0101]
pp74
‑
rnai引物：
[0102]
pp74
‑
rnai
‑
f：gaggaaaccatgagagcaagagca
[0103]
pp74
‑
rnai
‑
r：caccatcaacactaaagagacctc
[0104]
扩增的部分ospp74编码cds基因的特异区域为(seq id no.4)： gaggaaaccatgagagcaagagcatgaataagatatatggttttgagggagaa gtgaggtcgaagttgggagaagcatttattgaactatttgcggaagcattctgt tgcctaccccttgctcatgtcatcaacaacaaggtctttgttgttcatggaggtc tctttagtgttgatggtg。
[0105]
2)将pcr产物直接用gel and pcr clean
‑
up试剂盒(购自macherey
‑
nagel) 片段回收后，与pucm
‑
t载体(购自transgen biotech图10中b)连接。转化大肠杆菌dh5α(购自takara)，接种至lb培养基，37℃培养12h后，挑取单克隆菌株，转接5ml lb培养基中。37℃、250rpm培养12h后，用质粒抽提试剂盒(购自 macherey
‑
nagel)抽质粒，获得pucm
‑
t
‑
pp74片段质粒。
[0106]
3)因为pbssk
‑
in载体(ren et al,2012)中含有内含子(intron)，该内含子来自于phaseolus vulgaris nitrite reductase(nir基因)，利用该内含子两侧的多克隆位点将已经获得的pp74片段反向重复地连在内含子两侧的多克隆位点，形成发夹结构，步骤如下：
[0107]
将步骤2)的pucm
‑
t
‑
pp74片段质粒，抽取10ul先用pst i和bamh i(购自thermo
fisher scientific)酶切后，用t4连接酶(购自takara)连入相同酶切的pbssk
‑
in载体(ren et al,2012)，连接后的载体结构为pbssk
‑
pp74片段
‑
intron。
[0108]
再将步骤2)pucm
‑
t
‑
pp74片段质粒，抽取10ul用nsii和sali(购自thermo fisherscientific)酶切，用t4连接酶(购自takara)连入相同酶切的pbssk
‑
pp74片段
‑
intron，连接后的载体结构为pbssk
‑
pp74片段
‑
intron
‑
pp74片段。
[0109]
4)用saci和sali(购自thermo fisher scientific)将步骤3)载体pbssk
‑
pp74片段
‑
intron
‑
pp74片段中的两pp74片段以及它们之间的intron酶切回收后，连入超表达载体pcambia1300中(yue et al.,2010)，获得载体pcambia1300
‑
pp74片段
‑
intron
‑ꢀ
pp74片段。
[0110]
5)将步骤4)构建好的载体pcambia1300
‑
pp74片段
‑
intron
‑
pp74片段转化农杆菌eha105，并按照实例3进行水稻愈伤侵染。得到ospp74转基因苗，通过潮霉素 (hygromycin)抗性筛选得ospp74rnai转基因株系ri
‑
4，ri
‑
16，进行进一步的鉴定。
[0111]
实施例5、ospp74转基因苗的鉴定
[0112]
1.ospp74转基因苗的rt
‑
pcr鉴定：
[0113]
对实施例4步骤1和步骤2获得的超表达株系(ov
‑
3，ov
‑
4，ov
‑
5)和转基因株系(ri
‑
4,ri
‑
16)提取rna，做反转录，用qrt
‑
pcr方法检测ospp74的相对表达量，具体过程如下：
[0114]
按照实施例2的水稻培养方法，将实施例4获得的超表达株系(ov
‑
3，ov
‑
4， ov
‑
5)和转基因株系(ri
‑
4,ri
‑
16)培养2周，后取50
‑
100mg水稻叶片用锡箔纸包裹后，放入液氮中，随后进行rna提取。
[0115]
1)rna提取：
[0116]
用trizol(thermo fisher scientific)提取总rna，方法如下：
[0117]
(1)液氮中研磨样品，然后将样品置于2ml离心管，马上加入1ml trizol，旋涡震荡后放置15min，离心(13,000rpm，4℃，10min)。
[0118]
(2)取上清加入250μl氯仿，震荡静置分层。离心(13,000rpm，4℃，10min) 取上清。
[0119]
(3)加入trizol 0.7体积的异丙醇，轻轻混匀，
‑
20℃放置30min析出rna。
[0120]
(4)离心(13,000rpm，4℃，10min)倒掉上清。加入75％乙醇(depc水配制)洗涤rna沉淀，离心(13,000rpm，4℃，1min)后倒掉洗涤液。重复洗涤一次。用枪头吸干残余乙醇溶液，超净台上挥发乙醇(不能过度干燥，否则rna很难溶解)。
[0121]
(5)使用30
‑
50μl depc水溶解rna，加入dnase i(qiagen)去除dna污染。跑胶检测rna质量，测总rna浓度。
‑
80℃保存。
[0122]
2)反转录:
[0123]
cdna的合成采用invitrogen公司的superscript ii rt试剂盒完成，反转录体系中总rna的用量为1μg，具体过程参照试剂盒附带说明书。
[0124]
3)qrt
‑
pcr：
[0125]
荧光定量pcr使用faststart universal sybr green master试剂盒(roche)具体过程参照试剂盒附带说明书。定量分析使用lightcycler 480real
‑
time pcr(roche) 仪器。使用osactin作为内参基因。
[0126]
定量pcr反应体系(5μl)：
[0127][0128]
pcr反应条件为：
[0129]
定量所需引物
[0130][0131]
ospp74转基因苗的rt
‑
pcr鉴定结果(图6)表明实施例4步骤1获得的ospp74 超表达株系ov
‑
3，ov
‑
4，ov
‑
5中的ospp74基因的相对表达量明显高于野生型 (nip)，相对表达水平是野生型的20
‑
30倍。而在实施例4步骤2获得的rnai转基因株系ri
‑
4,ri
‑
16中ospp74基因表达量显著降低，约是野生型表达量的1/4。说明ospp74的超表达株系和rnai转基因株系确实达到了增强表达和干涉基因表达的效果，表明我们成功获得了增强表达和rna干扰的转基因材料，可用于进行下一步实验。
[0132]
2.水稻转基因苗表型分析
[0133]
水稻的培养：野生型水稻日本晴(oryza sativa japonica group(taxid:39947)nip) 和实施例4获得的ospp74超表达株系ov
‑
3,ov
‑
4,ov
‑
5及rnai转基因株系ri
‑
4, ri
‑
16的水稻种子各20粒，浸入10ml体积浓度1％稀硝酸水溶液中，室温放置20h 后，将稀硝酸换成自来水，放入37℃烘箱中催芽至露白，露白种子播种在网纱板上，按实施例2培养方法，培养7天，随后移栽至正常营养液(200μm pi)培养(配方及培养条件见实施例2)，一周后分别放入正常营养液(高磷200μm pi)和低磷营养液 (10μm pi，实施例2配方中stock2用量改为0.5ml/10l，另外加0.2mm kcl 9.5 ml/10l来补足钾离子含量，下面所用到的低磷营养液配方相同)培养，每7天更换一次相应的高磷(200μm pi)和低磷(10μm pi)营养液，至苗30天；
[0134]
结果发现：转基因苗在正常磷(200μm pi)培养条件下7天时，ospp74超表达株系不定根数和野生型相比显著减少；而rnai转基因株系不定根数与野生型相比没有显著差异(图7中a、b)。ospp74超表达株系的株高和主根长度与野生型相比都显著减小(图7中d、e)；rnai转基因株系与野生型相比主根长度没有显著差异，但株高显著减小(图7中c、d、e)。在正常磷培养条件下生长30天的ospp74超表达及rnai转基因株系和野生型相比主根长和株高都明显减小(图7中f、g)。对其叶片的叶尖进行拍摄发现ospp74超表达株系的叶尖有锈斑
存在，而野生型和rnai 转基因株系的叶尖没有(图7中h)，可能是磷中毒引起的表型。
[0135]
3、元素含量测定：
[0136]
1)水稻转基因苗有效磷含量测定
[0137]
(1)取样：将上一步(实施例5的第2步)高磷(200μm pi)和低磷(10μm pi) 培养30天的野生型水稻日本晴(oryza sativa japonica group(taxid:39947)nip)和 ospp74超表达株系ov
‑
3,ov
‑
4,ov
‑
5及rnai转基因株系ri
‑
4,ri
‑
16转基因苗的叶片剪取新叶、倒二叶、倒三叶、倒四叶，根在去离子水中漂洗、擦干水分后，剪取新生长出的不定根。取样的质量范围为0.05
‑
0.08g。使用2ml离心管取样，取样前后均需使用万分之一天平对离心管进行称重；
[0138]
(2)打样：于每个2ml离心管中加入2粒氧化锆打样珠，用移液枪向每管中加入 500μl 5m硫酸(购自沪试)水溶液，紧闭离心管盖，在打样机中打成匀浆状；
[0139]
(3)稀释：向每管样品中分次加入共计5ml的去离子水，同时转移到15ml离心管中，颠倒摇匀；
[0140]
(4)过滤：将稀释后的样品，经3层折叠的定量分析滤纸过滤后，转移到新离心管；
[0141]
(5)测定：将样品放置于流动分析仪(skalar,skalar san plus system)上测定水稻中有效磷含量。
[0142]
结果，在高磷(200μm pi)条件下，ospp74超表达株系有效磷含量与野生型相比显著性升高，在倒二叶、倒三叶、倒四叶和根中有效磷含量约为野生型的2倍(图8 中a)；而rnai转基因苗相比野生型没有显著差异，但在rnai
‑
4株系中倒三叶中有效磷含量显著性降低，在根中显著性升高，但其他叶片中和野生型相比并没有显著差异(图8中b)。这有可能是有因为实验误差的问题，也有可能是株系本身存在差异，具体的原因还需要进一步实验测定及对更多的株系进行测磷来进行确定。
[0143]
在低磷(10μm pi)条件下，ospp74超表达株系在老叶中(倒四叶)有效磷含量升高较明显，和野生型相比有显著性差异。除此之外在ospp74超表达和rnai转基因株系有效磷含量和野生型相比没有显著性差异(图8中c、d)。
[0144]
2)、水稻中各营养元素(氮除外)含量测定步骤：
[0145]
(1)水稻的培养：上一步(实施例5的第2步)高磷(200μm pi)培养30天的野生型水稻日本晴(oryza sativa japonica group(taxid:39947)nip)和ospp74超表达株系ov
‑
3,ov
‑
4,ov
‑
5及rnai转基因株系ri
‑
4,ri
‑
16转基因苗；
[0146]
(2)取样：将水稻用剪刀分为地上部分和根，将全部的地上部分折叠后塞入牛皮信封，将根在去离子水中漂洗、擦干水分后，同样放入牛皮信封中保存；
[0147]
(3)烘干：将含有样品的牛皮信封，放入65℃烘箱3天，将样品烘干；
[0148]
(4)准备：提前洗好消解管子，去离子水2遍，超纯水1遍，烘箱烘干；
[0149]
(5)消解：称取烘干的组织样品0.1g左右，放入消解的管子中，用5ml的hno3： h2o2(30:1，v/v)使用微波消解仪消解；
[0150]
(6)排酸：打开金属浴，设定温度为160℃进行排酸。约1h后，待样品剩余约1ml 时酸基本挥发掉，关闭heating block，待冷却后定容；
[0151]
(7)定容：用去离子水润洗3次将处理后样品转移到50ml进口离心管中，并定容到50ml；
cz.2020.protein phosphatase95regulates phosphate homeostasis by affecting phosphate transporter trafficking in rice.plant cell32:740
‑
757.(在水稻内蛋白磷酸酶 pp95通过调控水稻磷转运体的磷酸化水平影响植物体内磷稳态，植物细胞， 32:740
‑
757)
[0164]
yue r,wang x,chen j,et al.2010.a rice stromal processing peptidase regulates chloroplast and root development.plant and cell physiology51(3):475
‑
485.(一个“基质加工肽酶”调控叶绿体和根的发育,植物和细胞生理学，51(3):475
‑
485)