一种产染料脱色过氧化物酶的假单孢杆菌及其应用

1.本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种产染料脱色过氧化物酶的假单孢杆菌及其应用。


背景技术：

2.3d打印技术是快速成型领域的一种新兴技术，它以数字模型文件为基础，运用粘合材料，通过逐层打印的方式来构造物体的技术。随着3d打印技术的发展和应用，材料成为限制打印技术未来走向的关键因素之一。因此，找到更合适的材料决定着打印能否有更广泛的应用。其允许个性化和本地化的制造方式改变了热塑性塑料的常规供应链模式，能避免或减少塑料废料产生的优势。聚乳酸的工业高成熟度以及生物可降解性，使其成为3d打印领域最有前途的生物基热塑性塑料之一。然而，由于聚乳酸的机械性能和热性能较差，需要寻找合适的可降解共聚物混合以提供更高的强度和更大的弹性。木质素用于聚乳酸的成核剂是提高木质素的工业利用价值的一种潜在方式，通过酶对碱木质素进行预处理，改变木质素的结构从而提高碱木质素成核剂的性能，但木质素添加到聚乳酸中而产生的黑褐色的颜色限制了其在热塑性塑料市场中的接受度。
3.染料脱色过氧化物酶（dyp）是一种氧化还原酶，由于可以高效利用过氧化氢氧化各种化合物，因此在生物合成降解等过程中发挥重要作用。现有的染料脱色过氧化物酶在应用过程中适应生长条件较苛刻，例如部分真菌来源的染料脱色过氧化物酶生长周期长、酶活低；部分细菌来源的染料脱色过氧化物酶最适ph为酸性环境，而实际应用中大部分环境为中性或碱性。并且在现有3d打印技术中，现有将碱木质素作为成核剂加入聚乳酸中，导致3d打印过程中不可避免产生黑褐色，限制了其在热塑性塑料市场中的接受度。另外，还存在染料脱色酶活性较低，造成脱色成本高等问题。


技术实现要素：

4.有鉴于此，为了解决上述技术问题之一。本发明入深研究假单孢杆菌中染料脱色过氧化物酶并探讨其脱色的酶学性质和机制，提供一种产染料脱色过氧化物酶的假单孢杆菌及其应用。所提供的假单孢杆菌hu109a (pseudomonas sp. hu109a)能生产染料脱色过氧化物酶，利用基因工程技术将染料脱色过氧化物酶进行转化或转移到特定的载体内进行高效表达，从而获得大量纯化的染料脱色过氧化物酶。其对木质素分解产物具有高效的脱色活性。
5.为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：本发明提供了一种假单孢杆菌，所述的假单孢杆菌为pseudomonas sp.hu109a，于2022年01月10号保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmcc no.24273。建议的分类命名：假单胞菌pseudomonas sp.；保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
6.进一步地，本发明还提供了一种染料脱色过氧化物酶，所述的染料脱色过氧化物
酶来源于上述的假单孢杆菌，其氨基酸序列如seq id no：1所示。
7.进一步地，本发明还提供了一种编码如上所述染料脱色过氧化物酶的基因，其dna序列如seq id no：2所示。
8.本发明还提供了一种包含如上所述染料脱色过氧化物酶的酶制剂。
9.进一步地，本发明还提供了一种包含如上所述染料脱色过氧化物酶的重组表达载体，所述重组表达载体是将上述染料脱色过氧化物酶基因与质粒片段连接，得到重组表达载体；所述的重组表达载体为大肠杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、枯草芽孢杆菌表达载体、酵母菌表达载体或丝状真菌表达载体。
10.进一步地，本发明还提供了一种重组细胞，所述的重组细胞将上述重组表达载体通过化学转化方法导入到宿主细胞中，得到重组细胞；进一步地，所述宿主细胞包括细菌细胞的原核细胞、酵母或丝状真菌。
11.进一步优选的，所述的宿主细胞为大肠杆菌（escherichia coli bl21、escherichia coli jm109、escherichia coli dh5a）、乳酸菌（lactococcus lactis nz3900）、酵母菌(pichia pastoris)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilits bs168)或丝状真菌(aspergillus niger)的真核细胞。
12.进一步地，本发明将上述重组细胞诱导培养，离心得到菌体，采用超声破碎的方式得到蛋白，再经镍柱纯化除标签得到高纯度的染料脱色过氧化物酶。
13.进一步地，本发明还提供了如上所述的假单孢杆菌在中热塑性材料的应用；所述的应用为降低。
14.进一步地，本发明还提供了如上所述的染料脱色过氧化物酶在热塑性材料中的应用；所述的应用为对热塑性材料进行脱色。
15.进一步地，本发明还提供了如上所述的酶制剂在3d打印领域中进行脱色的应用。
16.进一步地，本发明还提供了如上所述的酶制剂在木质素处理领域中的应用，所述应用为对木质素进行脱色改性。
17.与现有技术相比较，本发明的有益效果是：本发明根据假单孢杆菌（pseudomonas sp.hu109a）全基因组序列获得染料脱色过氧化物酶dyp-p1的全长序列，并且与psmart-i表达载体相连构建重组质粒后插入到e.coli bl21（de3)感受态细菌中，从而获得工程菌株；再通过镍柱纯化，获得纯化后的染料脱色过氧化物酶（dyp-p2）。将本发明提供的染料脱色过氧化物酶对木质素进行改性后作为成核剂加入到聚乳酸中，可以使其深棕色变浅，更符合公众的喜爱程度。投入到工业应用中，具有巨大的应用潜力及可利用价值。
附图说明
18.图1是小量诱导表达凝胶电泳结果图；图2是蛋白镍柱纯化凝胶电泳结果图；图3是蛋白除标签凝胶电泳结果图。
具体实施方式
19.本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，
所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。下例实施实例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
20.试剂：质粒cn28302-1来源于苏州泓讯生物科技股份有限公司。
21.实施例1：筛选从镇江南山景区黄胸散白蚁肠道中筛选得到一株能降解木质素及环境内分泌干扰物的假单孢杆菌hu109a(pseudomonassp.hu109a)。筛选过程为：在显微镜下用镊子抽取黄胸散白蚁的肠道30条，将抽出的30条黄胸散白蚁肠道放入装有1ml0.4%无菌nacl溶液的1.5ml离心管中；然后用高温灭菌后的匀浆器将白蚁肠道研磨至均匀悬浮状；用100ul移液器吸取80ul肠道匀浆悬浮液至m9液体培养基中，将菌液放在30℃220r/min的恒温摇床中培养；待菌液出现浑浊后，将培养后的菌液再次转接到新的液体培养基中，重复此操作3次；最后将菌液在lb固体平板进行富集培养，再挑取单菌落进行培养，最终获得可降解相应木质素及衍生化芳香化合物的菌种，将其命名为假单孢杆菌hu109a。
22.在mm63固体平板上接种2ul假单孢杆菌hu109a，根据菌种在平板上的生长状况（如菌株数量、菌落大小），比较细菌利用壬基酚、双酚a、双酚s、双酚f、四溴双酚a的生长状况。表1是hu109a在不同环境内分泌干扰物上的生长情况对照表。
23.表1.hu109a在不同环境内分泌干扰物上的生长情况 代表细菌生长非常迅速和显著； 代表以正常速度生长的细菌； 表示细菌以非常缓慢的速度生长；-表示没有任何可观察到的细菌生长。
24.如表1所示，所获得的菌种假单孢杆菌hu109a，可高效利用环境内分泌干扰物壬基酚、双酚a、双酚f、双酚s以及四溴双酚a作为唯一碳源来生长，并可利用木质素作为唯一碳源生成聚羟基脂肪酸脂（pha）。该菌已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（cgmcc），保藏号为：cgmccno.24273，保藏时间2022年01月10号。建议的分类命名：假单胞菌pseudomonassp.；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
25.实施例2：氨基酸序列的获得与测定（1）硫酸铵沉淀：将10%~40%的假单孢杆菌hu109a接种于200mllb培养基（加入1g/l的木质素作为诱导剂）中培养24h，12000rpm离心收集菌体，用20ml缓冲液（tris-盐酸，ph8.0）洗涤一次后重新离心，然后置于冰上超声破碎，15000rpm高速离心20min，提取上清液，在磁力搅拌器上搅拌并慢慢分批加入20ml硫酸铵；离心获得不同阶段的蛋白质沉淀，收集硫酸铵沉淀阶段的蛋白质，透析除去硫酸铵。
26.（2）离子交换柱层析：将透析得到的蛋白溶液经过deae-sepharosecl-6b层析柱
纯化，用五倍柱床体积的50 mmol/l tris-hcl进行线性洗脱，流速1ml/min，收集样品经过sds-page确定富含蛋白的目的峰，超滤浓缩，获得纯化后的酶；冷冻保藏。
27.将得纯化后的酶进行edman降解法n末端测序（苏州泓讯生物科技股份有限公司），得到该脱色酶的氨基酸序列，其序列如seq id no：1所示。将该序列在genebank数据库中进行blastp比对分析，确定该蛋白属于染料脱色过氧化物酶（dyp酶）类，命名为dyp-p1。编码如上所述染料脱色过氧化物酶的基因，其dna序列如seq id no：2所示。
28.实施例3：dyp-p1工程菌的构建（1）dyp-p1基因合成：利用体外全基因合成方法合成染料脱色过氧化物酶dyp-p1的全长基因。
29.（2）dyp-p1基因的处理与连接：dyp-p1基因片段用t4dna polymerase处理后，与质粒cn28302-1的dna室温链接 20 min，得到重组质粒。
30.（3）重组质粒在大肠杆菌bl21的转化：取0.5ul步骤（2）中的重组质粒加入100ul e.coli bl21（de3) 感受态细胞中，至于冰上20min，42℃热激90s后继续冰浴2 min，加入250
µ
l lb培养基，37℃下培养30min。随后取150
ꢀµ
l菌液涂布于含有50μg /ml kan的lb平板，37℃倒置过夜培养，从而获得含有染料脱色过氧化物酶dyp-p1基因的工程菌。
31.（4）重组工程菌小量诱导表达： 挑取（3）中得到的工程菌接种于含50μg/ml kan的1 ml lb培养液的试管中，37℃ 220 rpm振摇培养6h左右，至od
600
约0.8；取出500μl菌液，加入诱导剂iptg（异丙基-β-d-硫代半乳糖苷）至终浓度为0.1mm，设立三个平行实验。220 rpm 37℃培养3h；10000 rpm，2min离心去上清收集菌体，加入50μl tbs重悬菌体，电泳检测蛋白表达。同时，以未加诱导剂iptg的为对照组；图1是小量诱导表达凝胶电泳结果图；图中，a是未诱导对照组，b、c、d为加诱导剂组， mk是marker。由图1可见，重组工程菌成功表达。
32.实施例4：蛋白的纯化（1）smart-ni（2ml）纯化：取甘油菌按1：1000比例，接种于50 μg/ml kan的600ml lb培养液中，37℃ 220 rpm振摇至菌体od
600
为0.8-1.0 ；600ml 发酵培养基中加入诱导剂iptg至终浓度为0.1mm，于37℃ 220 rpm培养4h，5000rpm 4℃离心5min，离心去上清收集发酵菌体，然后用超声波破碎。破碎后的菌体12000 rpm，4℃离心 10min，收集上清进行镍柱纯化，填料类型为 smart-ni。其中平衡液为：tbs，ph为7.4，洗脱液：tbs，250mm咪唑，ph7.4。按 20mm/50mm/250mm 咪唑梯度进行洗脱。图2是蛋白镍柱纯化凝胶电泳结果图；图中，a是20mm的咪唑洗脱，b是50mm的咪唑洗脱，c是250mm的咪唑洗脱，mk是marker。如图2所示，镍柱纯化后经过250 mm 咪唑进行洗脱得到的蛋白纯度最高。
33.（2）酶切，透析，除标签：分别取 20mm/250mm咪唑洗脱下的融合蛋白，加入sumo 蛋白酶，酶切过夜，再置于 tbs 透析过夜。离心后取上清液。镍柱纯化除标签，填料类型为 smart-ni。平衡液：tbs，ph7.4。洗脱液：tbs，250mm咪唑，ph7.4。按 20mm/50mm/250mm咪唑的梯度进行洗脱，图3是蛋白除标签凝胶电泳结果图；图中，a是250mm的咪唑洗脱，b是50mm的咪唑洗脱，mk是marker。如图3所示，250 mm 咪唑进行洗脱得到的蛋白纯度最高。将最终使用250mm咪唑洗脱的蛋白（dyp-p2）用于冷冻保藏。
34.实施例5：重组染料脱色过氧化物酶dyp-p2酶活测试对实施例4中多的的蛋白dyp-p2进行酶活力测定。酶活力测定过程中以abts( 2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)为底物，检测波长为414 nm。测定体系为1 ml，体系中
含有50 mm ph值为4.0的hac-naac缓冲液，2.0 mm abts，0.15 mm h2o2和0.1 μm的dyp-p2。1 μmol底物转化为产物所需的酶量为一个国际制酶活单位。经测定，当其在ph为4，温度为30℃时，酶活达到最高，最高为3194.4u。
35.实施例6：染料脱色过氧化物酶dyp-p2前处理木质素作为成核剂制作方法称量nacl 1.57g 、tris 0.9g、 cucl2·
2h2o 0.02g 加入h2o
2 185ml，用hcl调节ph至7，加入木质素0.55g得到溶液体系；将实施例4中冷冻保存的 dyp-p2于冰上融化后，取40ml加入溶液体系中反应，并于37℃、220rpm恒温培养24h。培养完成后于8000rpm，20min离心除去未溶解木质素，取上清液；煮沸10min，待冷却后取上清液离心（8000rpm，20min）；冷冻干燥得到酶改性处理的木质素。
36.实施例7：碱处理木质素在3d打印中的应用在本实施例中分别将实施例6中得到的酶改性处理木质素和对照物碱木质素作为3d打印材料中的成核剂，通过3d打印制作长丝。根据长丝特性对比dyp-p2酶的特性。
37.分别将聚乳酸、热塑性聚氨酯弹性体橡胶（tpu）颗粒于80℃进行真空干燥5h，将实施例6中酶改性处理的木质素放入真空干燥箱中175℃加热过夜；干燥完成后将聚乳酸、tpu按质量百分比90%：10%混合；加入聚乳酸重量的5%的干燥后的碱木质素。为保证混合均匀，加入聚乳酸质量3%~8%的聚乙二醇。将聚乳酸、tpu、碱木质素、聚乙二醇四种物质完全混合搅拌均匀。混匀后采用单螺杆毛细管流变仪，以500g/h 的进料速度挤出共聚物共混物。最大螺杆转速为 110~118rpm，挤出机内温度为50~60℃，将挤出的长丝首先浸泡在60℃的水浴中，同时以 385~400 毫米/分钟的速度输送到微型履带牵引装置，保证长丝均匀形成。长丝制作完成后，将其清洗后用拉力器进行拉伸试验、热分析仪对其进行热分析、熔体体积率分析仪对其进行熔体体积率试验，最后将干丝使用熔融沉积法对长丝进行3d打印并观察其颜色。
38.作为对比，以同样的方法制作长丝，区别仅在于用同质量的碱木质素替换实施例6中经dyp-p2酶改性处理的木质素。表2是经dyp-p2酶改性木质素和碱木质素的特性对比表。
39.表2.酶改性木质素和碱木质素特性对比表由表2可见，木质素在经过氧化物染料脱色酶dyp-p2处理后，其极限拉伸力具有很大的提升，同时体现出更好的热稳定性、机械性能及流变性能。最重要的是，经过氧化物染料脱色酶dyp-p2处理后颜色由黑棕色转变为乳白色，浅颜色更为大众所喜爱，具有更加广
阔的市场应用前景。
40.以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。