一种白术多糖AMP1-1及其提取方法与应用

一种白术多糖amp1-1及其提取方法与应用
技术领域
1.本发明涉及多糖提取及失重性骨丢失防护技术领域，尤其涉及一种白术多糖amp1-1及其提取方法与应用。


背景技术：

2.失重性骨丢失是一种由于长时间暴露于失重状态下而引起骨量流失的疾病，其不但会引起机体代谢紊乱，并且在航天员返回地面后还会产生恢复不良等特殊病况，这严重影响了宇航员太空任务的执行以及自身身体健康。
3.目前对于失重性骨丢失的防护主要集中于运动训练和化学药物治疗。然而用于预防失重性骨丢失的对抗训练措施效果并不显著。化学药物治疗虽然可以有效缓解骨丢失的症状，但其不但毒性强而且还有诸多副作用。因此寻找一个防护活性高，毒副作用小，使用安全的骨丢失防护剂已成为航天医学刻不容缓的事情，也是重要任务之一。
4.白术为多年生草本白术的干燥根茎，主产于江西、湖北、湖南、浙江等地，其作为中国传统的药用植物具有多种有效成分和药理作用，广泛应用在临床治疗。白术中的主要药效成分分为挥发性成分、多糖类、内酯类、黄酮类、苷类等，针对白术化学成分的研究多集中在内酯类、挥发性成分及多糖类。白术可以作用在机体的多个方面，主要作用集中在胃肠道系统、免疫系统及泌尿系统，具有抗肿瘤、修复胃黏膜、抗炎镇痛、保肝、改善记忆力、调节脂代谢、降血糖、抗血小板、抑菌、免疫调节、调节水液代谢等多种药理作用。
5.白术多糖作为主要的活性物质一直备受研究者们的青睐并具有多种生物学活性。其中对免疫系统的影响尤为突出，白术多糖会使“t细胞”明显增加，提高th/ts比值，改善t细胞亚群分布紊乱状态可使il-2水平显著提高，并能增加t淋巴细胞表面il-2r的表达。另外其对抗氧化和抗衰老具有显著的作用。众多研究发现白术多糖可以抑制mda的含量，并促进胞超氧化物歧化酶(sod)以及谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)的活性。除此之外白术多糖还具有降血糖、抗肿瘤和作用心肌细胞的功效。然而对于白术多糖的抗骨丢失的活性还未见报道，并且白术多糖amp1-1的结构与生物活性更是首次发现。
6.因此，如何提供一种能够应用于失重性骨丢失防护剂的白术多糖amp1-1，增强对失重性骨丢失的治疗效果，避免化学药物的毒副作用是本领域亟待解决的难题。此外，白术多糖amp1-1新结构的鉴定与公开也成为解决此难题的重要一环。


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明提供了一种白术多糖amp1-1及其提取方法与应用，为失重性骨丢失防护剂提供了新的选择。
8.为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
9.一种白术多糖amp1-1，所述白术多糖amp1-1的结构为：
[0010][0011]
其中，所述白术多糖amp1-1的分子量为1253～1615da。
[0012]
本发明的另一目的是提供一种白术多糖amp1-1的提取方法，包括以下步骤：
[0013]
步骤1、用水提取白术根茎粉末，浓缩提取液得到浓缩液；
[0014]
步骤2、向浓缩液中加入乙醇，得到白术多糖粗提物；
[0015]
步骤3、运用deae-52离子交换色谱法对白术多糖粗提物进行分离纯化和洗脱处理，收集洗脱液；
[0016]
步骤4、运用sephadex g-100分子排阻色谱法对步骤3得到的洗脱液进行分离纯化，得到白术多糖amp1-1。
[0017]
优选的，所述步骤1中的白术根茎粉末与水的体积比为1：10～30。
[0018]
优选的，所述步骤1中提取的温度70～90℃；提取时间为3～8h。
[0019]
优选的，所述步骤1中提取时还包括超声波辅助提取，超声波辅助提取的功率为300～800w，超声波辅助提取的时间为20～40min，超声波辅助提取次数为2～4次。
[0020]
优选的，所述步骤2中乙醇为无水乙醇，浓缩液与无水乙醇的体积比为1:2～4。
[0021]
优选的，所述步骤3中的洗脱条件为：用deae-52装柱，径长比为1:10～30，洗脱液为蒸馏水，流速为1～1.5ml/min。
[0022]
优选的，所述步骤4中的洗脱条件为：用sephadex g-100装柱，径长比为1:10～30，洗脱液为蒸馏水，流速为1～1.5ml/min。
[0023]
本发明的另一目的是提供一种白术多糖amp1-1在制备失重骨丢失防护剂中的应用。
[0024]
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0025]
本发明得到的白术多糖amp1-1具有较好的失重性骨丢失防护活性，这种活性可以在微重力效应下直接促进骨生成和抑制骨吸收，以此达到对骨骼的防护作用。其中amp1-1可以分别通过促进和抑制骨组织中的alp与trap活性来促进骨生成。除此之外，对骨生成的促进作用分别由其上调成骨细胞的分化基因(runx2，osx)以及下调破骨细胞的分化基因(nfatc1，cathepsink)表达来实现的。
附图说明
[0026]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0027]
图1为实施例1得到的白术多糖amp1-1重均分子量分布图；
[0028]
图2为实施例1得到的白术多糖amp1-1的红外谱图；
[0029]
图3为实施例1得到的白术多糖amp1-1的1h nmr和
13
c nmr图谱；
[0030]
图4为实施例1得到的白术多糖amp1-1的二维核磁图谱；
[0031]
图5为实施例1得到的白术多糖amp1-1对失重效应下大鼠股骨微结构的影响图，其中，control代表地面对照组；hls代表尾悬吊处理组；hls 20代表尾悬吊的同时用20mg/kg/damp1-1处理组；hls 40代表尾悬吊的同时用40mg/kg/damp1-1处理组；hls 60代表尾悬吊的同时用60mg/kg/damp1-1处理组；图注：与地面对照组比较：*p《0.05,**p《0.01，***p《0.001；与模拟失重效应组比较#p《0.05，##p《0.01，###p《0.001。
[0032]
图6为实施例1得到的白术多糖amp1-1在失重效应下对大鼠股骨生物力学性能作用图，其中，control代表地面对照组；hls代表尾悬吊处理组；hls-amp代表尾悬吊的同时用60mg/kg/damp1-1处理组；图注：与地面对照组比较：*p《0.05，**p《0.01；与模拟失重效应组比较#p《0.05，##p《0.01。
[0033]
图7为实施例1得到的白术多糖amp1-1在失重效应下对大鼠股骨alp和trap活性作用图，其中，control代表地面对照组；hls代表尾悬吊处理组；hls-amp代表尾悬吊的同时用60mg/kg/damp1-1处理组；图注：与地面对照组比较：*p《0.05，**p《0.01；与模拟失重效应组比较#p《0.05，##p《0.01。
[0034]
图8为实施例1得到的白术多糖amp1-1对成骨细胞分化和成熟基因的作用图，其中，smg 30ng/ml代表在失重效应下加30ng/mlamp1-1处理；smg 60ng/ml代表在失重效应下加60ng/mlamp1-1处理；smg 90ng/ml代表在失重效应下加90ng/mlamp1-1处理；图注：与地面对照组比较：*p《0.05，**p《0.01；与模拟失重效应组比较#p《0.05，##p《0.01。
[0035]
图9为实施例1得到的白术多糖amp1-1对raw246.7细胞系的作用图，其中，smg 30ng/ml代表在失重效应下加30ng/mlamp1-1处理；smg 60ng/ml代表在失重效应下加60ng/mlamp1-1处理；smg 90ng/ml代表在失重效应下加90ng/mlamp1-1处理；图注：与地面对照组比较：*p《0.05，**p《0.01；与模拟失重效应组比较#p《0.05，##p《0.01。
具体实施方式
[0036]
本发明提供了一种白术多糖amp1-1，所述白术多糖amp1-1由α-d-葡萄糖和β-d-果糖组成，分子量为1253～1615da，具有由α-d-glcp-(1
→
和
→
1)-β-d-fruf-2
→
糖苷键构成的主链，是一种线性结构的多糖。白术多糖amp1-1的结构式为：α-d-glcp-1
→
(2-β-d-fruf-1)n(n＝6～8)，
[0037][0038]
本发明还提供了一种白术多糖amp1-1的提取方法，包括以下步骤：
[0039]
步骤1、用水提取白术根茎粉末，浓缩提取液得到浓缩液；
[0040]
步骤2、向浓缩液中加入乙醇，得到白术多糖粗提物；
[0041]
步骤3、运用deae-52离子交换色谱法对白术多糖粗提物进行分离纯化，收集洗脱
液；
[0042]
步骤4、运用sephadex g-100分子排阻色谱法对步骤3得到的洗脱液进行分离纯化，得到白术多糖amp1-1。
[0043]
在本发明中，运用sephadex g-100分子排阻色谱进行分离纯化处理后还包括采用gpc法检测其相对分子量。
[0044]
在本发明中，所述步骤1中的白术根茎粉末与水的体积比为1：10～30，优选为1：15～25，进一步优先为1：20。
[0045]
在本发明中，提取时优选采用蒸馏水。
[0046]
在本发明中，所述步骤1中提取的温度70～90℃，优选为80℃；提取时间为3～8h，优选为4h。
[0047]
在本发明中，所述步骤1中提取时还包括超声波辅助提取，超声波辅助提取的功率为300～800w，优选为400～600w，进一步优选为500w；超声波辅助提取的时间为20～40min，优选为20～30min，进一步优选为25min；超声波辅助提取次数为2～4次，优选为3次。
[0048]
在本发明中，所述浓缩的终点为原体积的1/5。
[0049]
在本发明中，所述步骤2中乙醇为无水乙醇，浓缩液与无水乙醇的体积比为1:2～4，优选为1：3。
[0050]
在本发明中，所述步骤3中的洗脱条件为：用deae-52装柱，径长比为1:10～30，优选为1:20；洗脱液为蒸馏水，流速为1～1.5ml/min，优选为1.3ml/min。
[0051]
在本发明中，所述步骤4中的洗脱条件为：用sephadex g-100装柱，径长比为1:10～30，优选为1:20；洗脱液为蒸馏水，流速为1～1.5ml/min，优选为1.3ml/min。
[0052]
本发明的再一目的是提供一种白术多糖amp1-1的制备以及其在失重性骨丢失防护中的应用。
[0053]
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0054]
实施例1
[0055]
将白术(atractylodes macrocephala)根茎粉末和蒸馏水以1：10的体积比在80℃下的水浴3小时(期间采用500w的功率超声波辅助提取三次，每次20min)，收集上清液，浓缩为原体积的1/5。加入浓缩液2倍体积的无水乙醇形成絮状沉淀物，收集沉淀并干燥得到白术多糖的粗提物。运用离子交换色谱法对粗提物进行分离纯化，用deae-52装柱，径长比为1:20，洗脱液为蒸馏水，流速为1ml/min。收集洗脱液后，运用分子排阻色谱法对洗脱液进行分离纯化，用sephadex g-100装柱，径长比为1:20，洗脱液为蒸馏水，流速为1ml/min。收集洗脱液并经gpc法检测相对分子质量后，得到一种新型水溶性多糖——白术多糖amp1-1。
[0056]
实施例2
[0057]
将白术植物根茎粉末和蒸馏水以1：20的体积比在70℃的水浴4小时(期间采用800w的功率超声波辅助提取两次，每次30min)，收集上清液，浓缩为原体积的1/5。加入浓缩液3倍体积的无水乙醇形成絮状沉淀物，收集沉淀并干燥得到白术多糖的粗提物。运用离子交换色谱法对粗提物进行分离纯化，用deae-52装柱，径长比为1:30，洗脱液为蒸馏水，流速
fruf-2,1)-c6(β-d-fruf-2,1)；h4(β-d-fruf-2,1)-c3(β-d-fruf-2,1)；h4(β-d-fruf-2,1)-c5(β-d-fruf-2,1)的三个交叉峰。此外amp1-1的异头质子共振区存在一个强烈的交叉峰h1(α-d-glcp-1)-c2(β-d-fruf-2,1)，表明存在α-d-glcp-1
→
2-β-d-fruf-1
→
。基于表1得知位于δ5.35/3.46，δ3.46/3.70，δ3.70/3.39，δ3.39/3.78处的四组化学位移分别代表葡萄糖残基上h1-h2，h2-h3，h3-h4，h4-h5的相关性，此外，位于δ4.18/4.01，δ4.01/3.78，δ3.78/3.68处的三组化学位移分别代表果糖残基上h3-h4，h4-h5和h5-h6的相关性。
[0071]
表1白术多糖amp1-1的
13
c nmr图中的化学位移
[0072][0073]
4、白术多糖amp1-1的gc-ms谱分析
[0074]
称量amp1-1样品(2.5mg)置于玻璃反应瓶中进行甲基化反应，条件为磁力搅拌水浴30℃反应60min，随后终止反应。
[0075]
将甲基化后的多糖进行乙酰化，加入1ml的2mol/l三氟乙酸(tfa)水解90min，然后60mg硼氢化钠还原8h，接着加入1ml乙酸酐100℃下乙酰化反应1h，冷却。
[0076]
将乙酰化后的产物用3ml ch2cl2溶解后转移至分液漏斗，其中ch2cl2层用无水硫酸钠干燥，定容10ml，放入液相小瓶。分析采用shimadzu gcms-qp 2010气相色谱-质谱联用仪测定乙酰化产物样品。
[0077]
gc-ms条件：rxi-5silms色谱柱30m
×
0.25mm
×
0.25um；程序升温条件为：起始温度120℃，以3℃/min升温至250℃/min；保持5min；进样口温度为250℃，检测器温度为250℃/min，载气为氦气，流速为1ml/min。
[0078]
由表2可知amp1-1具有fruf-(2
→
,glcp-(1
→
和
→
1)-fruf-(2
→
三种不同的糖苷键。并且其摩尔比为3.32:13.87:82.81。
[0079]
表2白术多糖amp1-1的甲基化gc-ms数据
[0080][0081]
实施例5白术多糖amp1-1的失重骨丢失防护活性研究
[0082]
白术多糖amp1-1对成骨细胞和raw246.7细胞系分化和成熟基因的作用
[0083]
利用双向多样本回转器(2d-rwvs)来建立模拟失重效应(smg)。原代成骨细胞和raw246.7细胞系分别以5
×
105/ml和1
×
105/ml浓度的细胞悬液接种在已经覆盖血薄片的6孔板中，培养12h后将其进行72h的模拟失重效应的培养。模拟失重效应处理后收集细胞提取它们的mrna。
[0084]
提取后的rna使用逆转录试剂盒逆转录成cdna，随后根据实时定量pcr试剂盒说明书的步骤操作上样，用abi 7500系统检测mrna的表达量。最后通过2-δδct
的方法计算出原代成骨细胞中runx2和osx mrna的表达量以及raw246.7细胞系中nfatc1和cathepsinkmrna的表达量。
[0085]
1.2白术多糖amp1-1对失重效应处理的股骨结构的影响
[0086]
利用大鼠吊尾模型来建立失重性骨丢失模型。购买30只年龄为12周的健康雄性sprague-dawley(sd)大鼠，体重为200
±
20g。在适应生活1周后，将大鼠随机分为3组，每组10只。对照组的大鼠可以自由活动，无需任何处理。其他两组中的大鼠将尾巴悬挂起来，期间可以自由进食，处理时间为4周，在此期间用amp1-1(60mg/kg/d)对大鼠进行灌胃处理，同时对照组大鼠给予等量水。4周后将大鼠安乐死，并取之股骨用microct对其进行检测。
[0087]
1.3白术多糖amp1-1对失重效应处理的股骨机械性能的影响
[0088]
大鼠吊尾4周后，所有大鼠安乐死并收集股骨进行生物力学检测。将大鼠股骨放置在万能试验机操作台上，使置放股骨两个支架之间的距离为16mm。然后，压力调节器以0.4mm/min的恒定速度下移，直到股骨断裂。
[0089]
1.4白术多糖amp1-1对失重效应处理的股骨alp和trap活性
[0090]
动物模型中的股骨按照alp和trap活性检测试剂盒的说明书要求操作并进行检测和分析。
[0091]
2.统计与分析
[0092]
所有数据均用mean
±
sd表示，用t-test检验差异的显著性，与地面对照组比较显著用#表示，p《0.05，极显著用##表示，p《0.01；与模拟失重效应组比较著用*表示，p《0.05，极显著用**表示，p《0.01。
[0093]
3.结果
[0094]
如图5所示，大鼠股骨的微结构在失重效应下明显受损，但amp1-1对此种由失重效
应诱发的股骨微结构损伤有明显的防护作用。此外由失重效应诱发的tb.n、tb.th、bv/tv、bs/tv和bmd的降低也受amp1-1的防护，经amp1-1处理后可以显著促进这些指标。其中对于tb.sp，amp1-1同样具有防护作用，其可以降低由失重效应引起的tb.sp升高。
[0095]
如图6所示，大鼠股骨的弹性模量(mpa)、弹性载荷(n)、最大应变(％)和弯曲刚度(n.mm-1
)均受失重效应影响显著降低。在amp1-1灌胃处理组中amp1-1对由于失重效应导致的生物学性能降低有显著的抑制作用。
[0096]
如图7可知，失重效应可以显著降低成骨作用的标志性酶alp的活性，在经过amp1-1处理后这种由失重环境导致的alp活性降低受到明显的抑制作用。另外失重效应还会引起trap活性升高，促进骨吸收的发生。但是amp1-1对此现象也有显著的防护作用，其在微重力效应下可以抑制trap的活性。
[0097]
如图8所示，由颅骨提取的成骨细胞中runx2和osx的mrna表达量均受模拟失重效应的影响，使之表达量降低。然而使用白术多糖amp1-1处理的成骨细胞其runx2和osx的表达与模拟失重效应的组比较显著上调。并且其促进作用与amp1-1的剂量成正相关。
[0098]
如图9可知，以raw246.7细胞系模拟的破骨细胞中nfatc1和cathepsin k的mrna表达量受模拟失重效应的影响显著增加，然而在模拟失重处理同时加入amp1-1，可以明显的抑制这种由失重效应诱发的nfatc1和cathepsinkmrna表达量上升的情况，并且其抑制作用以计量依赖式递增。
[0099]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0100]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。