一种电转染永生化猪成纤维细胞的方法

1.本发明涉及细胞培养领域，尤其是涉及一种电转染永生化猪成纤维细胞的方法。


背景技术：

2.细胞永生化是当前细胞生物学研究热点之一，它是指细胞在病毒、辐射、药剂等作用下获得无限增殖的能力，可长期传代，并多伴有核型改变。永生化的关键是一种称为端粒酶(human telomerase re-verse transcriptase,htert)的酶，在体细胞的正常体外培养过程中，细胞的复制过程会被端粒的不断缩短而受限制，但当端粒酶被激活时，端粒的缩短被抑制从而使得细胞获得无限增殖的能力，因此通过构建含有htert的载体来转染细胞是常用的细胞永生化方法。
3.但脂质体转染法以及病毒介导的转染对于一些难转染细胞，转染效率非常低，并且耗时长，常规病毒介导的转染需要3到5天时间，此外以上两种方法介导的转染由于操作复杂所以转染稳定性常常难以保证，而电转染不受细胞类型的限制，可以转染几乎所有的真核细胞，包括病毒转染效率很低的原代细胞、干细胞等，并且转染效率非常高，在进行条件优化后重复性好，操作简单。
4.h11位点已经在小鼠中证实是安全区域，不受旁侧启动子影响，因此更合适用于表达外源基因，外源性的基因定点插入这个位点不会影响其他基因的表达。此外2015年jin等人在大动物猪模型中同时利用crispr/cas9系统成功且高效地在ph11位点插入目的基因片段，所以h11位点常用来构建基因敲入小鼠，将永生化基因插入h11位点即将能够将永生化基因整合进基因组，克服常规的永生化手段经过多次传代永生化特性会减弱或消失的缺点。
5.猪的组织结构和生理生化特性与人类相近，近些年来，基因编辑猪在动物育种、基因治疗等领域的研究越来越广泛，猪成纤维细胞是常用的体细胞核移植技术的供体细胞因此猪成纤维细胞的培养具有更深远的意义。但猪成纤维细胞作为原代细胞，在正常体外培养条件下虽然可以生长和分裂，但受分裂次数的限制，在有限次数内原代细胞就会走向衰老和死亡。
6.因此，建立一种高效、操作简单、有效的永生化猪成纤维细胞的方法具有重要科学意义。


技术实现要素：

7.针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种电转染永生化猪成纤维细胞的方法。本发明效率高、适应性强，永生化特性不易消失，适用于大多数难转染的细胞。
8.本发明的技术方案如下：
9.一种电转染永生化猪成纤维细胞的方法，包括以下步骤：
10.(1)将pcag-floxp-neo-ph11载体通过单酶切得到线性载体，而后通过引物退火延伸得到htert片段，克隆到所述线性载体上；
11.(2)将所述线性载体转化至感受态，进行菌落培养、pcr鉴定；
12.(3)pcr鉴定正确的质粒进行测序鉴定，序列正确的htert重组质粒进行扩大培养，然后通过质粒纯化试剂盒纯化，从而构建永生化载体pcag-h11-htert；
13.(4)将pcag-h11-htert及px459-h11-v2电转染至猪原代成纤维细胞；
14.(5)用含有嘌呤培养基对细胞进行筛选，得到永生化成功细胞。
15.优选的，步骤(1)所述单酶切采用not i进行。
16.优选的，步骤(2)所述感受态为e.coil dh5α；所述菌落培养基为含有氨苄抗生素的lb培养基，培养条件为36-40℃培养12-16h；所述pcr鉴定是将培养后的菌落的菌液碱裂解法提质粒进行。
17.优选的，步骤(3)所述质粒纯化试剂盒为endotoxin-free的质粒纯化试剂盒。
18.优选的，步骤(3)所述htert的正确序列如序列表所示。
19.优选的，步骤(4)所述电转染中，两个质粒比例为1:1，共转染质粒6μg，细胞特异性核转染液和pmaxgfp阳性质粒比例41：9，共100ul，使用仪器为lonza 4d-nnclea opector，转染参数为do-113。
20.优选的，步骤(5)中，由于px459-h11-v2中携带嘌呤抗性，若成功插入可以整合到猪的基因组中，因此用含有嘌呤培养基对阳性细胞进行筛选，筛选浓度为3.5ug/ml；同时设置一盘未电转细胞作对照，对照细胞和电转细胞依据细胞密度进行换液或者传代，直至对照细胞全部死亡，则存活的电转细胞视为含有嘌呤抗性的细胞即永生化成功细胞。
21.本发明有益的技术效果在于：
22.1、目前常规的永生化细胞的方法为包病毒转染，常规包病毒转染方法需要3-5天的时间，耗时长，此外效率低、不适用于所有细胞，而本发明采用的电转染方法可以克服这些缺点，不仅操作简单，耗时短，并且适用于大多数难转染的细胞，包括原代细胞、干细胞等。
23.2、本发明是将永生化相关基因htert插入h11位点，从而达到整合进细胞基因组的目的，这样能克服传统永生化方法经过多次传代可能导致永生化特性消失的缺点，永生化效果非常好，细胞增殖能力大大提高，操作简单，耗时短，适应性强，不仅可用于猪耳成纤维细胞，也适用于其他原代细胞。
附图说明
24.图1是ph11位点鉴定结果；
25.图2是htert位点鉴定结果；
26.图3是永生化猪原代成纤维细胞细胞生长状态；
27.图4是永生化猪原代成纤维细胞生长曲线。
具体实施方式
28.下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
29.实施例：
30.一、新生巴马猪耳成纤维细胞提取及建系
31.1.组织取样
32.7日龄巴马猪，于耳尖处血管较少处进行刮毛，酒精棉消毒后，使用止血钳夹住耳朵中部，耳尖处碘棉消毒后酒精棉脱碘。使用眼科剪剪取一部分组织，于75％酒精浸泡1min，用双抗pbs洗涤2-3次，置于干净的培养皿中备用。分离耳部表皮及皮下组织，刮取耳内白色组织，将组织置于1.5ml ep管中剪成1mm3的小块，1500rpm离心5min，弃上清。
33.2.消化
34.加入适量0.25％胰酶，涡旋混匀后，置于37℃水浴锅中，每5min涡旋一次，涡旋10次左右。
35.3.细胞培养
36.1500rpm离心5min，弃上清。加入少量含20％的fbs的dmem培养基终止消化，吹打混匀后将悬液过100um的滤网，过滤后将组织块铺于25cm2的细胞培养瓶中。
37.待组织周围开始有大量纤维状细胞生长出时，可用胰酶消化后冻存于液氮中，记为p0。所有原代细胞均在含20％胎牛血清(fbs；gibco)的高葡萄糖dulbecco's medium eagle培养基(gibco,gaithersburg,md,usa)中培养。
38.二、永生化载体pcag-h11-htert构建
39.利用已有的pcag-floxp-neo-ph11载体，用notⅰ进行单酶切得到线性化载体，再用引物退火延伸得到的htert片段，通过一步克隆连接到线性化载体上，转化至感受态e.coil dh5α，置于37℃培养箱12-16h，挑选单个菌落接种于含有氨苄抗生素的lb培养基中，用两毫升菌液碱裂解法提质粒进行pcr鉴定，pcr鉴定正确的质粒进行测序鉴定，序列正确的htert重组质粒进行扩大培养，用endotoxin-free的质粒纯化试剂盒纯化永生化载体pcag-h11-htert。
40.三、猪成纤维细胞电转
41.1.弃培养基，加入少量pbs充分，添加1ml 0.25％胰酶放入37℃培养箱中消化4min，待大部分细胞变圆脱壁，加入1ml含10％的fbs的dmem培养基终止消化，用移液器充分吹打混匀悬浮细胞，取10ul细胞悬液进行计数，终浓度为1
×
106/ml，1500rpm离心5min后尽量吸净上清。
42.2.取两个灭菌1.5mlep管，一个ep管中加入3μg px459-h11-v2与3μg pcag-h11-htert，涡旋混匀，另一个ep管中加入82ul p3 primary cell nucleofector solution溶液与18ul pmaxgfp
tm vector，涡旋混匀后加入到第一个ep管中轻轻混匀，避免产生气泡。用混匀后的液体重悬细胞沉淀，用毛细管将重悬后的液体转移至电转杯中，使用仪器为lonza 4d-nnclea opector，转染参数为do-113，加入1ml含10％的fbs的dmem培养基终止，电转后的细胞铺于10cm dish中。
43.四、永生化细胞筛选
44.由于px459-h11-v2中携带嘌呤抗性，若成功插入可以整合到猪的基因组中，因此用含有嘌呤培养基对阳性细胞进行筛选，筛选浓度为3.5ug/ml，同时设置一盘未电转细胞作对照，对照细胞和电转细胞依据细胞密度进行换液或者传代，直至对照细胞全部死亡，则存活的电转细胞视为含有嘌呤抗性的细胞即永生化成功细胞。
45.五、阳性细胞鉴定
46.提取筛选后的细胞基因组dna，吸走培养基，pbs充分润洗，加入500ul lysis buffer,，上下涡旋混匀10次，将细胞悬液转移到spin column中，4000
×
g离心1min，spin column加入500ul wash buffer 1，12000
×
g离心1min，spin column加入500ul wash buffer 2，12000
×
g离心1min，转移到新的1.5ml离心管中，加入20ul elution buffer并在70℃水浴锅中孵育1min，12000
×
g离心1min。
47.pcag-h11-htert细胞的鉴定步骤如下：
48.1.首先进行ph11位点检测，引物序列如下：
[0049][0050][0051]
2.对ph11阳性个体进行后续检测。即对htert位点进行检测，引物序列如下：
[0052][0053]
ph11位点鉴定结果如图1所示；htert位点鉴定结果如图2所示。
[0054]
六、绘制生长曲线
[0055]
取永生化后细胞以及p0猪原代成纤维细胞，弃培养基，加入pbs充分洗涤，添加1ml 0.25％胰酶放入37℃培养箱中消化4min，待大部分细胞变圆脱壁，加入1ml含10％的fbs的dmem培养基终止消化，根据细胞计数结果按每个孔1.36
×
104/ml作传代培养接种到6孔板中，共接种6个细胞，每两天进行一次细胞计数，每次计数三遍，取平均值，连续计数12天，根据细胞计数结果，以单位细胞数(细胞数
×
104)为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线，如图3和图4所示。
[0056]
从图中可以看到，本发明成功构建了电转染永生化的质粒，成功永生化猪成纤维细胞。永生化后猪成纤维细胞增殖能力大大增加，可不断传代，将htert通过h11位点可整合进基因组，克服了传统永生化方法多次传代后永生化特性消失的缺点。此质粒及系统不止适用于猪成纤维细胞永生化，也适用于其他原代细胞。
[0057]
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，对于本领域的普通技术人员而言，在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。