一种非改性探针及其在实时荧光PCR方法中的应用

一种非改性探针及其在实时荧光pcr方法中的应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学领域，涉及核酸分析检测，具体涉及一种非改性探针及其在实时荧光pcr方法中的应用。


背景技术：

2.实时荧光pcr是基因检测中最常用的方法，一般包括两种：染料法和探针法。染料法是在pcr反应体系中，加入过量荧光染料(如sybr green i)，荧光染料特异性地掺入dna双链后，在特定波长能发射出强烈荧光信号，而不掺入链中的sybr染料分子荧光信号保持不变，从而保证荧光信号的增加与pcr产物的增加完全同步。探针法最常用的是taqman探针，taqman探针是一条两端分别标记有荧光分子和荧光淬灭分子的dna分子，它的序列和pcr扩增区间的序列互补，在pcr反应进行过程中能够与扩增出的一条单链dna杂交形成双链。由于taq dna聚合酶具有的5
’‑3’
的外切酶活性，当它沿引物从5
’‑3’
进行延伸遭遇探针时，就会将探针序列进行剪切。这样荧光分子和荧光淬灭分子在空间分离，荧光分子的荧光不再被淬灭。随着反应的进行，越来越多的探针被剪切，整个反应体系的荧光就逐渐增加。taqman探针检测方法是在pcr反应中扩增出目的的基因片断后才能发生相应的探针剪切而产生荧光，所以特异性的荧光探针是酶链聚合检测中最为快捷准确的方法。现有的基于taqman探针的传统实时荧光pcr虽然特异性、灵敏度、重复性都非常好，能够检测1个拷贝的目标分子，但是存在以下不足：
3.第一，检测时间长，通常需要1-2小时，如果该方法用于临床诊断时直接导致病人筛查效率低，对传染病疫情防控将造成很大的压力；
4.第二，检测试剂盒的价格高昂，由于该类探针是经过化学修饰的核酸探针，合成成本不菲，因此基于taqman探针的检测试剂盒大多价格昂贵，致使相应的病原检测成本居高不下；
5.第三，taqman探针合成的时间较长，普通dna合成一般只需一天，由于探针需要化学修饰后进行高效液相色谱纯化，合成的总时间需要一个星期；
6.第四，与普通dna相比，taqman探针荧光基团稳定性较差，需避光低温保存。
7.因此，开发一种非改性的特异性探针和利用其实现实时荧光pcr检测具有很重要的现实意义。
8.g-四链体富含鸟嘌呤，是近年来研究较多的一种结构。有的g-四链体能与氯高铁血红素(hemin)结合，具有类似于过氧化物酶的活性；有的g-四链体能与原卟啉，锌卟啉等小分子结合，产生荧光或颜色的变化。但是上述小分子化合物耐热性较差，且与g-四链体的结合不具有热稳定性，在pcr加热时，小分子化合物会分解或结合物会分离。因此以往的报道都需要在pcr结束后，开盖加入小分子产生荧光或颜色信号的变化。这种终点检测的方法不能实时监测pcr的过程，而且开盖可能产生pcr产物的污染，影响检测的准确性。硫磺素t是一种稳定的小分子，它能够与特定序列的g-四链体结合，并且产生显著的荧光，目前有大量研究报道了硫磺素t及其衍生物与不同序列的g-四链体结合能够产生荧光，并且已经应
用于检测dna、rna、金属离子和蛋白质的生物传感器中。但是目前还没有报道基于硫磺素t和g-四链体在实时荧光pcr反应中的应用。


技术实现要素：

9.本发明的目的在于提供一种非改性探针及其在实时荧光pcr方法中的应用。
10.本发明提供了一种用于实时荧光pcr的非改性探针，其特征是：包含a、b、c三部分，a是与目标核酸模板杂交的序列，位于探针的中间部分；b是与g-四链体完全或部分互补的序列，位于探针的其中一端；c为g-四链体序列，位于探针的另一端；在退火温度及退火温度以下时，非改性探针b部分和c部分能通过碱基互补作用对g-四链体序列进行全部或部分封闭，使c部分不形成g-四链体二级结构。
11.其中所述的非改性探针，其特征是：当存在待测核酸时，g-四链体序列被释放，能够与小分子化合物结合产生信号；反之，探针中的g-四链体保持被封闭状态，不与小分子化合物结合产生信号。
12.其中所述的小分子化合物，其特征是：硫磺素t或硫磺素t衍生物。
13.其中所述的所述g-四链体序列，其特征是：富含g碱基的、能够与硫磺素t或硫磺素t衍生物结合产生荧光信号的序列。
14.本发明提供了一种利用非改性探针的实时荧光pcr方法，其特征是：探针与待测核酸结合的区域位于正、反向引物结合域之间；在pcr体系中加入正向引物和反向引物、探针、硫磺素t或硫磺素t衍生物、核酸聚合酶及其他常规pcr反应组分；pcr时，高温变性阶段，待测核酸双链解开，非改性探针中的b部分和c部分也将打开，退火和延伸阶段，引物和探针都结合到待测核酸链上，由于pcr体系中所用的核酸聚合酶具有5
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外切酶活性，核酸聚合酶能将结合在引物下游的非改性探针剪切，释放g-四链体序列，释放的g-四链体与pcr体系中已加入的硫磺素t或硫磺素t衍生物结合能产生荧光，随着pcr循环数的增加，释放的g-四链体呈指数倍增加，实时荧光pcr仪能监测到荧光值的变化，呈典型的荧光扩增曲线；没有待测核酸存在的情况下，由于pcr反应不会发生，g-四链体序列不能释放，从而实时荧光pcr仪上不能监测到的荧光值的变化。
15.其中所述的核酸聚合酶，其特征是：具有5
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外切酶活性的耐热性核酸聚合酶。
16.其中所述的利用非改性探针的实时荧光pcr方法，其特征在于：pcr的反应程序为92-98℃预变性0-5min；92-98℃，0-30s；45-65℃，0-30s，fam通道或sybr green通道收集荧光信号；72℃，0-30s；共25-45个循环。通过是否产生显著高于阴性对照背景信号的典型荧光扩增曲线判断是否检测到目标核酸。通过标准曲线可以对待测目标核酸进行定量。
17.本发明所公开的一种利用非改性探针的实时荧光pcr方法关键在于：利用dna聚合酶的5
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外切酶活性；利用g-四链体能与硫磺素t结合产生荧光的性质；利用了g-四链体与硫磺素t结合的热稳定性；利用了实时荧光pcr仪能够检测到g-四链体能与硫磺素t结合产生荧光。
18.本发明具有明显优于现有技术的优点，其主要优点包括：
19.(1)创新性。本发明首次利用有机小分子硫磺素t来进行序列特异性的pcr检测，实现不开盖的实时荧光监测。
20.(2)价格低廉，具有普适性。本发明提供的非改性探针不需要任何额外的荧光标
记，容易合成，合成成本比taqman探针的成本低得多，在常温甚至高温下都很稳定，而荧光探针成本高，合成周期长，对保存条件要求苛刻，荧光基团容易掉落，保存时间不宜过长。
21.(3)实用性。实时荧光pcr检测与扩增同时进行，灵敏准确，适用于实际样本的检测分析。
22.(4)不开盖。实时荧光pcr方法全程都在封闭管中进行，不需要开盖添加试剂，能避免实验室污染。
23.本发明由于使用小分子作为荧光探针，不需要对核酸探针进行化学修饰，大大降低了检测的成本。具有很强的创新性。此外，本发明中所提供的非改性的g-四链体核酸探针有望以最简单、最经济、最稳定等优势替代现有的taqman探针进行实时荧光定量检测。
24.本发明提供的一种利用非改性探针的实时荧光pcr方法对待测核酸样本的来源没有限制，所有生物体来源的dna或rna等都可用本发明的方法进行检测。本发明还提供了所述方法的应用，将其应用于人类乙型肝炎病毒的检测。
25.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
26.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
27.图1是本发明提供的一种非改性探针和一种实时荧光pcr方法的原理图
28.图2是具体实施例1用核酸探针1检测人类乙型肝炎病毒基因的结果图
29.图3是具体实施例2用核酸探针2检测食品中猪肉源成分的结果图
具体实施方式
30.实施例1用核酸探针1检测人类乙型肝炎病毒基因
31.(1)正反引物1、核酸探针1、人类乙型肝炎病毒基因部分序列
32.正向引物1：5
’‑
gtgtctgcggcgttttatc-3’33.反向引物1：5
’‑
ggacaaacgggcaacatac-3’34.核酸探针1：
[0035]5’‑
cccacaccgcccatcctgctgctatgcctcatcttgggcggtgtgggaagagggaagagggg-3’[0036]
人类乙型肝炎病毒基因部分序列：
[0037]5′‑
gtgtctgcggcgttttatcatcttcctytgcatcctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactatcraggtatgttgcccgtttgtcc-3
′
[0038]
(2)反应体系及pcr条件
[0039][0040]
超纯水将体系补足到20μl。
[0041]
pcr方案是：94℃1min预变性；94℃2s，50℃15s，40个循环，fam通道或sybr green通道收集荧光信号。
[0042]
(3)检测方法
[0043]
通过西安天隆科技有限公司的型号为gentier 96e的实时荧光定量pcr仪在fam通道或sybr green通道收集荧光信号得到的扩增曲线进行分析。
[0044]
(4)检测结果
[0045]
结果如图2所示，人类乙型肝炎患者血清全基因组dna提取液(阳性)组有扩增曲线，ct值为21，阴性对照无扩增曲线。
[0046]
实施例2用核酸探针2检测食品中猪肉源成分
[0047]
(1)正反引物2、核酸探针2、猪细胞色素b基因部分序列
[0048]
正向引物2：5
’‑
gctgatagtagatttgtgatgaccgta-3’[0049]
反向引物2：5
’‑
catcaaacatctcatcatgatgaaa-3’[0050]
核酸探针2：
[0051]5’‑
cccacaccgcccgatatttgtcctcagggcaggacggggcggtgtgggaagagggaagagggg-3’[0052]
猪细胞色素b基因部分序列：
[0053]5′‑
gctgatagtagatttgtgatgaccgtagctcctcagaatgatatttgtcctcagggcaggacgtagcctatgaaggctgttgctataacggtaaatagtaggactactccaatgtttcatgtttctaggaatatataggatccgtagtataggcctcggcctacgtggatgaataggcaaataaagaacatggatgctccgtttgcatgtaggtagcgaataactcatccgtaatttacgtctcgacagatgtgtgtaactgatgagaaagctgttgttgtgtctgatgtgtaatgtattgctaagaacaggcctgttaggatttgcaagattaggcagatgcctaagagggaaccgaagtttcatcatgatgagatgtttg-3
′
[0054]
(2)反应体系及pcr条件
[0055]
[0056]
超纯水将体系补足到20μl。
[0057]
pcr方案是：94℃1min预变性；94℃2s，55℃25s，40个循环，fam通道或sybr green通道收集荧光信号。
[0058]
(3)检测方法
[0059]
通过上海宏石slan-96s全自动荧光定量pcr仪在fam通道或sybr green通道收集荧光信号得到的扩增曲线进行分析。
[0060]
(4)检测结果
[0061]
结果如图3所示，猪肉全基因组dna提取液(阳性)组有扩增曲线，ct值为23，阴性对照无扩增曲线。