检测位于生物全血中血细胞外侧的至少一种核酸的体外方法以及用于该目的的装置和试剂盒与流程

检测位于生物全血中血细胞外侧的至少一种核酸的体外方法以及用于该目的的装置和试剂盒
1.提供用于检测位于生物全血中血细胞外侧的至少一种核酸(优选dna和/或rna、特别优选dna)的体外方法、装置和试剂盒。根据本发明的方法的优点在于，与现有技术的已知方法相比，该方法的实施需要更少的时间和装置工作，并且使污染的风险和待扩增的无细胞核酸(例如无细胞dna)损失的风险最小化。因此，该方法比已知的无细胞核酸(例如无细胞dna)的检测方法更经济并且具有更高的检测精度。此外，与现有技术中基于全血稀释的检测方法相比，尤其提高了检测灵敏度。此外，还提出使用提供的装置和提供的试剂盒。
2.可以在生物全血中发现核酸(例如dna和/或rna)，所述核酸位于血细胞外侧或不包含在全血中的生物双层膜中，因此可以说在生物血液中“自由”循环。这种所谓的无细胞核酸，例如可以是无细胞dna(“cfdna”)，在血浆中的浓度可变，约为1ng/ml至1500ng/ml。它由垂死细胞产生，但例如肿瘤细胞和胎儿细胞也释放cfdna(例如在胎儿细胞的胎盘上)。cfdna是双链的，主要大小在约60至300个碱基对的范围内(下文中“碱基对”缩写为“写为“)。cfdna的长度通常为140bp，因为这大约对应于核小体的dna部分。
3.自由循环的dna目前成为许多肿瘤学问题的焦点。血液(血浆或血清)浓度的增加与癌症发展的急性期的临床阶段相关。体细胞cfdna仍然包含一部分肿瘤cfdna，其也称为“其也称为部分。
4.作为所谓“液体活检”的一部分，确定癌症患者的ctdna能够监测治疗，并且将允许在未来采取治疗措施(所谓的“精准医疗”)。
5.血浆中自由循环dna量的增加也会发生在多种疾病中(例如自身免疫疾病、心脏病发作、中风和败血症)，也可以在过度肌肉劳损时观察到。由于物理应变急性释放的cfdna与促炎免疫标志物高度相关，并且主要来源于免疫细胞，因此cfdna是物理应变产生的所谓无菌炎症的重要促炎标志物。在这方面，释放的cfdna的量是身体劳损和伴随不同疾病的炎症反应的炎症程度的标志。
6.从血液样本中量化无细胞核酸(如cfdna)的简单快速的方法将会受到极大关注，并且对各种医学问题非常有帮助。对于模棱两可的结果，这种方法可以提供进一步诊断测试方法可行的方向的指示。
7.从血液中检测无细胞核酸例如无细胞dna，先前是通过从全血样本中获取血浆，随后进行核酸纯化，并且最终借助于聚合酶链反应(“先前是通)进行核酸扩增来完成的。或者，首先从全血样本中获取血浆，将血浆稀释，并且最终通过pcr进行直接扩增。
8.现有技术中已知的这些检测方法的缺点在于，它们包括在cfdna的实际扩增反应即检测反应开始之前用于制备全血的费力的制备步骤。例如，在已知方法中，首先以耗时的方式从全血获取血浆，即，将全血中存在的血细胞与无细胞全血分离。随后是核酸纯化或稀释步骤。
9.核酸纯化非常耗时。稀释血浆的替代方案当然更快，但由于样本的稀释，必然导致检测阈值的劣化(即预期检测灵敏度较低)。现有技术方法还使用pcr，其从开始到结束需要很长时间(通常几个小时)进行扩增，并且在样本制备中需要相对大量的认知和耐心。
10.因此，已知的检测方法均与高时间消耗相关，并且检测需要多个装置(例如离心机和pcr装置)。某些装置(例如pcr装置)只能由经过培训的人员操作。此外，在现有技术的检测方法中任何所需的处理步骤中均可能发生材料损失，并且由于步骤的数量和持续时间，样本有可能被外源dna污染和在检测方法中获得假阳性结果的可能性增加。此外，在从全血样本中获取血浆的步骤中甚至不能排除血细胞的裂解。结果是还存在样本被自身dna污染的风险，该自身dna在采集样本之前(体内)存在于血细胞中并且不存在于血细胞外侧的血液中，在这种情况下，自身dna在测量过程中导致假阳性结果。
11.现有技术中已知方法的总体特征在于高工作量和装置费力以及低的检测精度(由于污染风险增加)。在基于样本稀释的过程中，必然存在低的检测灵敏度。
12.以此为出发点，本发明的目的是提供不具有上述现有技术缺点的方法和用于实施该方法的装置与试剂盒。该方法、装置和试剂盒特别应该能够以更小工作量、更小装置工作量、更高检测精度和尽可能高的检测灵敏度来检测生物全血中血细胞外侧的至少一种核酸(例如dna和/或rna)。
13.该目的通过具有权利要求1的特征的方法、根据权利要求12的装置和/或试剂盒以及根据权利要求24的用途来实现。从属权利要求显示有利的实施方案。
14.本发明提供用于检测位于生物全血中血细胞外侧的至少一种核酸(优选dna和/或rna、特别优选dna)的体外方法。该方法包括以下步骤：
15.a)提供与至少一个引物对一起适于进行等温扩增反应的反应混合物，其中反应混合物包含至少一个引物对，所述至少一个引物对适于扩增全血中存在的至少一种核酸(优选dna和/或rna、特别优选dna)；或将至少一个这样的引物对加入到反应混合物中；
16.b)将生物全血加入到反应混合物中；
17.c)在≤45℃的温度下进行等温扩增反应；和
18.d)借助至少一种检测试剂检测dna，其中检测在步骤c)期间或步骤c)之后进行，
19.其特征在于，反应混合物适于防止包含在生物全血中的血细胞裂解。
20.根据本发明，术语“核酸”优选理解为dna和/或rna、特别优选dna。因此，待检测的核酸或待扩增的核酸可以例如是dna和/或rna。术语“核酸”优选还涵盖rna
‑
dna杂合体。这种rna
‑
dna杂合体是例如已相互连接的单个短dna和rna链(特别是长度为20
‑
22个核苷酸的链)。
21.如果待检测的核酸包含或组成为rna，则反应混合物优选包含酶，或向其中加入酶，该酶可以将rna复制到dna中(例如逆转录酶)。
22.反应混合物可以包含来自核酸连接酶组(例如t7 rna聚合酶)的蛋白质或来自核酸连接酶组的蛋白质可以加入其中。
23.游离rna或存在于rna
‑
dna杂合体中的rna的等温扩增可以例如通过nasba过程来实现。在该过程中，rna在恒定温度(例如室温，25℃)下通过酶rnase h、逆转录酶、sd聚合酶和t7 rna聚合酶的相互作用在反应混合物中扩增(借助至少一种包含t7启动子序列的引物)。因此优选反应混合物包含这些酶和至少一种具有t7启动子序列的引物，或者将这些酶和该引物加入其中。
24.可替代地或另外，游离rna或rna
‑
dna杂合体中存在的rna的等温扩增可以通过对nasba过程的修饰来实现，该过程称为“接头连接”头连接
””
过程。在该过程中，通过酶poly
(a)聚合酶、rnase h和t7 rna聚合酶的相互作用，在恒定温度(例如，室温，25℃)下在反应混合物中(借助至少一种包含t7启动子序列的引物)扩增rna。在该修饰中优选反应混合物包含这些酶和至少一种具有t7启动子序列的引物，或者将这些酶和该引物加入其中。
25.上述nasba过程也可以与rpa过程组合进行。在该过程中，全血中存在的dna首先通过rpa过程(nasba扩增)转化为rna，然后通过nasba过程将rna扩增。
26.已经发现，当不按照现有技术的惯例使用纯化血样，而当直接使用全血(即没有预处理)时，使用根据本发明的方法检测存在于生物全血中血细胞外的至少一种核酸(例如dna和/或rna)(用dna作为核酸，所谓的无细胞dna或缩写为cfdna)也是可能的。对此的要求是反应混合物适于防止包含在生物全血中的血细胞裂解。可以通过使用这种反应混合物来防止存在于含有细胞核(例如白细胞)的血细胞中的核酸(例如dna和/或rna)对检测过程产生负面影响，即提供假阳性结果。
27.在根据本发明方法的一个优选实施方案中，反应混合物通常适于防止包含核酸、被脂质双层膜包围并且包含在生物全血中的区室的裂解。根据本发明，术语“包含核酸、被脂质双层膜包围的区室”进行广泛理解，即，它涵盖包含核酸并且被生物脂质双层膜包围的所有可想到的区室。例如，它们包括线粒体、细胞外囊泡(外泌体和微粒)、过氧化物酶体、病毒、单细胞生物和细菌。
28.与已知方法相比，根据本发明的方法的优点在于不需要样本制备，即全血的纯化。因此，根据本发明的方法需要更少的方法步骤并且可以更快地执行。
29.此外，不需要在已知方法中用于纯化全血、即用于制备样本所需的装置。因此，与已知方法相比具有相当大的成本优势。
30.此外，根据本发明的方法特别适于在实验室外实施。这意味着患者可以门诊确定(即，在其家中使用适于该目的的装置或使用适于为此目的进行该方法的试剂盒)是否有至少一种无细胞核酸(例如cfdna)通常存在于他的血液中(使用非特异性引物)或他的血液中是否存在至少一种特异性无细胞核酸(例如特定的cfdna)(使用特异性引物)。测试人员可以是运动员和/或患者，例如事故患者或急诊患者，可以在运动后直接或在事故或医疗紧急情况后直接在现场检查是否至少有一种(特定)核酸(例如cfdna)或增加量的至少一种(特定)核酸(例如cfdna)存在于他的血液循环中。获得的信息可以表现出显著的优势以迅速启动对患者适当的治疗。
31.此外，在每个方法步骤中，即在用于纯化全血样本的现有技术中典型的方法步骤中，通常还存在待检测的核酸(例dna)损失的风险(例dna和/或rna可能吸附在特定表面)，因此在实际检测过程中可能无法再被检测到。结果是检测灵敏度低或假阴性结果。由于直接使用全血，根据本发明的方法降低了在检测的过程中损失待检测的核酸(例如dna和/或rna)的风险。因此检测灵敏度和检测精度高于已知方法。根据本发明的方法适于检测全血中所谓的低拷贝数基因或甚至所谓的单拷贝数基因。
32.与现有技术的已知方法中纯化全血样本的步骤不同，根据本发明的方法也不存在样本在这些步骤之一过程中被外来核酸(例如，进行该方法的人的dna或细菌的dna)污染的风险。因此，通过根据本发明的方法，减少假阳性信号的风险，从而进一步提高已知方法的检测精度。
33.根据本发明的方法的特征可以在于，反应混合物与全血形成液体混合物，其中液
体混合物与血细胞基本上等渗。
34.此外，反应混合物可以与血细胞形成液体混合物，液体混合物具有的渗透压基本上对应于全血的渗透压，优选渗透压为230mosmol/kg至350mos
‑
mol/kg、优选260mosmol/kg至320mosmol/kg、特别优选270mosmol/kg至310mosmol/kg、特别是280mosmol/kg至300mosmol/kg。
35.在一个优选的实施方案中，反应混合物不包含任何浓度适于实施血细胞裂解的表面活性剂，优选没有适于实施血细胞裂解的物质或物质混合物。特别要理解的是，反应混合物不包含浓度适于实施血细胞的裂解的任何表面活性剂，或任何物质或物质混合物。该特征任选地不仅涉及血细胞，而且通常还涉及包含被包含在生物全血中的脂质双层膜包围的核酸的区室。已如上所述，术语“包含被脂质双层膜包围的核酸的区室”在此进行广泛理解，即它包括包含核酸并且被生物双层膜包围的所有可想到的区室。例如，这包括线粒体、外泌体、单细胞生物和细菌。
36.方法中使用的反应混合物可以包含以下物质中的至少一种，或者可以将以下物质中的至少一种加入反应混合物中：
37.i)三磷酸核苷，优选datp、dctp、dgtp、dttp、atp、gtp；和/或
38.ii)肌酸激酶和磷酸肌酸；和/或
39.iii)镁盐，优选乙酸镁；和/或
40.iv)聚乙二醇。
41.此外，反应混合物可以还包含以下蛋白质中的至少一种或以下蛋白质中的至少一种可以加入反应混合物中：
42.i)链置换聚合酶，优选地选自sau dna聚合酶、bsu dna聚合酶、klenow片段、phi29以及它们的组合；和/或
43.ii)重组酶，优选reca重组酶和/或t4 uvsx；和/或
44.iii)单链结合蛋白，优选ssb和/或t4 gp32；和/或
45.iv)核酸外切酶，优选核酸外切酶iii和/或核酸外切酶iv。
46.在一个优选的实施方案中，本方法所用的检测试剂不适于通过全血中所含血细胞的细胞膜。特别地，该特征不仅适于血细胞，而且通常适于包含被脂质双层膜包围的核酸的区室的膜。该实施方案中，有利的是，扩增核酸(例如dna)的检测也可以在没有包含dna的细胞或上述区室的任何事先分离的情况下进行，因为不存在通过在细胞内或上述区室内将检测试剂结合dna而获得假阳性结果的风险。因此，该方法可以更简单和更快地进行(例如，不需要任何步骤来使反应混合物从反应空间通过分隔壁流动到单独的检测空间)。
47.检测试剂可适于检测单链和/或双链dna并且用于检测。
48.检测试剂可选自荧光探针、结合dna的染料分子、用于检测焦磷酸盐的试剂以及它们的组合。
49.荧光探针可以包含或组成为寡核苷酸，该寡核苷酸包含或组成为：猝灭剂、荧光团和存在于猝灭剂与荧光团之间的dna序列，其中dna序列适于(通过内部修饰)通过核酸内切酶或核酸外切酶切割，优选是dhf或ap
‑
dna序列。结合dna的染料分子可以选自evagreen、sybr green、syto染料、topo染料以及它们的组合。优选地，为了特别灵敏的检测，使用具有与全血样本的相应光谱不同(优选显著不同)的吸收和发射光谱的染料分子。对于所用染料
分子的吸收光谱，小于525nm、介于545nm与570nm之间或大于590nm的吸收光谱是特别有利的，因为全血的相对局部吸收最小值存在于这些范围内。换言之，染料在525nm至545nm的波长处和/或在570nm至590nm的波长处不应具有(高)吸收。580nm至610nm、特别是590nm至610nm的发射光谱，特别有利于发射。用于检测焦磷酸盐的试剂可以是镁盐。
50.在方法的一个优选实施方案中，dna的检测通过检测单元进行，其中检测单元优选地选自吸收测量装置、荧光测量装置、浊度计、照相机、手机(例如手机的内部照相机，任选地与手机上的评价软件结合)以及它们的组合。
51.此外，在该方法中，扩增dna的量可以通过评价单元进行量化，其中评价单元优选地与检测单元(优选地，与上述检测单元)通信连接。
52.在该方法中，引物对的至少一个引物、任选的两个引物的长度可以为20bp至45bp、特别优选25bp至40bp、特别是30bp至35bp。
53.此外，引物对的至少一个引物，任选引物对的两个引物，可以适于结合生物dna中的重复dna序列，优选结合选自line序列、sine序列和alu序列的重复序列。
54.使用结合重复序列的引物或引物对的优势在于，它们适于对生物全血中存在的所有可想到的未知dna进行非特异性扩增并且包括重复dna序列。由于实际上每个dna或每个dna片段均有一定长度的重复dna序列，因此可通过这种引物或引物对将全血中存在的每个可想到的dna进行扩增。换言之，在扩增反应之前不必知道待扩增dna的序列。因此，该方法通常可以证明生物的血液中是否存在游离dna。
55.如果通过该方法在全血中实际上检测到游离dna，则当然可以使用常用方法对其进行测序。如果已知特定生物(例如特定患者)血液中的游离dna(free dna)(或游离dna(free dnas))的特定序列，则根据本发明的方法当然也可以用直接适于检测已知dna的引物对进行。因此，可以使用根据本发明的方法在特定时间段(例如数分钟、数小时、数天和/或数个月)内对患者全血中的特定游离dna进行监测。
56.引物对的一个引物、任选引物对的两个引物，可适于结合生物dna中的dna序列，该dna序列存在于生物患有疾病开始、期间或之后和/或过度肌肉劳损开始、期间或之后的血液循环中。
57.生物可以是人或动物。
58.方法中使用的等温dna扩增反应可以在以下温度下进行：20℃至44℃、优选25℃至42℃、特别优选30℃至41℃、特别是35℃至40℃。为此目的所需的温度可以由温度控制单元产生或设置。
59.如果在该方法中不使用温度控制单元，则反应可以在室温下进行，或者可以通过(人或动物的)体热产生所需的反应温度。后者是可能的，例如，因为装置的反应混合物移动得如此接近人或动物的身体，使得从身体到反应混合物的热传递是可能的。
60.等温扩增反应可以是半定量等温dna扩增反应或定量等温dna扩增反应。
61.等温dna扩增反应可以是选自重组酶聚合酶扩增反应、siba hda、nasba和sda扩增反应的扩增反应；其任选地选自重组酶聚合酶扩增反应、siba和sda扩增反应。其优选重组酶聚合酶扩增反应。扩增反应的反应混合物任选地包括解旋酶。优选的扩增温度是37℃，即反应混合物优选温度控制为37℃的温度。
62.在根据本发明的方法的步骤d)期间或之后，在(检测到)扩增dna的情况下，可以得
出存在疾病和/或过度肌肉劳损的结论。疾病特别选自炎症、癌症、自身免疫性疾病、冠状动脉、中风、败血症、染色体畸变、基因拷贝数的变化、基因突变以及它们的组合。
63.使用的反应混合物可以包括多个引物对，任选地至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或10个引物对，每个引物对适于扩增存在于全血中的至少一种核酸(例如dna)。可替代地或另外，可以将多个这样的引物对加入反应混合物中，其中各引物对优选适于扩增不同核酸(例如dna)、优选存在于生物全血中的核酸(例dna)，所述生物过度肌肉劳损和/或患有选自如下的疾病：炎症、癌症、自身免疫性疾病、冠状动脉、中风、败血症、染色体畸变、基因拷贝数的变化、基因突变以及它们的组合。
64.在一个优选的实施方案中，反应混合物和检测试剂，任选地反应混合物、引物对和检测试剂被包含在侧流试纸条。
65.根据本发明，提供装置和/或试剂盒，其适于体外检测位于生物全血中的血细胞外侧的至少一种核酸(优选dna和或rna、特别dna)。装置和/或试剂盒包含
66.a)反应混合物，所述反应混合物与至少一个引物对一起适于在≤45℃的温度下进行等温扩增反应；
67.b)至少一个引物对，所述至少一个引物对适于扩增全血中存在的至少一种核酸(优选dna和/或rna、特别优选dna)，其中至少一个引物对任选地包含在反应混合物中；
68.c)用于检测dna的至少一种检测试剂，其中至少一种检测试剂任选地包含在反应混合物中，
69.其特征在于，反应混合物适于防止包含在生物全血中的血细胞裂解。
70.与根据本发明的方法相关的上述优点相应地适用于根据本发明的装置和根据本发明的试剂盒。根据本发明的装置可以具有与根据本发明的方法相关的上述特征，或者可以针对它们的性能进行配置。
71.如果待检测的核酸包含或组成为rna，则反应混合物优选包含可以将rna复制到dna中的酶(例如逆转录酶)。
72.反应混合物可以包含来自核酸连接酶(例如t7 rna聚合酶)的组的蛋白质。
73.反应混合物优选包含rnase h、逆转录酶、sd聚合酶、t7 rna聚合酶和至少一种具有t7启动子序列的引物。
74.反应混合物还可以优选包含酶poly(a)聚合酶、rnase、t7 rna聚合酶和至少一种具有t7启动子序列的引物。
75.包含在装置和/或试剂盒中的反应混合物可适于与全血形成与血细胞基本上等渗的液体混合物。
76.反应混合物还可适于与全血形成液体混合物，其具有基本上对应于血细胞的渗透压的渗透压，优选渗透压为230mosmol/kg至350mosmol/kg、优选260mosmol/kg至320mosmol/kg、特别优选270mosmol/kg至310mosmol/kg、特别是280至300mosmol/kg。
77.在装置和/或试剂盒的一个优选实施方案中，装置和/或试剂盒不包含适于实施血细胞裂解的任何表面活性剂，优选没有适于实施血细胞裂解的物质或物质混合物。特别要理解的是，反应混合物不包含浓度适于实施血细胞的裂解的任何表面活性剂或任何物质或物质混合物。该特征任选地不仅与血细胞有关，而且通常也与包含被包含在生物全血中的脂质双层膜包围的核酸的区室有关。如上所述，术语“包含被脂质双层膜包围的核酸的区
室”在此进行广义理解，即它包括包含核酸并且被生物双层膜包围的所有可想到的区室。这包括例如，线粒体、外泌体、单细胞生物和细菌。
78.反应混合物可包含以下物质中的至少一种：
79.i)三磷酸核苷，优选datp、dctp、dgtp、dttp、atp、gtp；和/或
80.ii)肌酸激酶和磷酸肌酸；和/或
81.iii)镁盐，优选乙酸镁；和/或
82.iv)聚乙二醇。
83.此外，反应混合物还可以包含以下蛋白质中的至少一种：
84.i)链置换聚合酶，优选地选自sau dna聚合酶、bsu dna聚合酶、klenow片段、phi29以及它们的组合；和/或
85.ii)重组酶，优选reca重组酶和/或t
4 uvsx；和/或
86.iii)单链结合蛋白，优选ssb和/或t
4 gp32；和/或
87.iv)核酸外切酶，优选核酸外切酶iii和/或核酸外切酶iv。
88.在一个优选的实施方案中，装置和/或试剂盒中包含的检测试剂不适于通过全血中所含血细胞的细胞膜。该特征不仅适于血细胞，而且还通常适于包含被脂质双层膜包围的核酸的区室的脂质双层膜。该实施方案中，有利的是，检测扩增也可以在没有包含dna的细胞或上述区室的任何事先分离的情况下进行，因为不存在通过在细胞内或上述区室内将检测试剂结合dna而获得假阳性结果的风险。装置和/或试剂盒因此可以保持在更小尺寸中(例如，不需要反应空间和具有设置在其间的分隔壁的单独检测空间)。
89.检测试剂可适于检测单链和/或双链dna。
90.此外，装置和/或试剂盒的检测试剂可以选自荧光探针、结合dna的染料分子、用于检测焦磷酸盐的试剂以及它们的组合。
91.荧光探针可以包含或组成为寡核苷酸，该寡核苷酸包含或组成为：猝灭剂、荧光团和存在于猝灭剂与荧光团之间的dna序列，其中dna序列是适于通过核酸内切酶或核酸外切酶切割，优选是dhf或ap
‑
dna序列。结合dna的染料分子可以选自evagreen、sybr green、syto染料、topo染料以及它们的组合。为了特别灵敏的检测，优选使用具有与全血样本的相应光谱不同(优选显著不同)的吸收和发射光谱的染料分子。对于所用染料分子的吸收光谱，小于525nm、介于545nm与570nm之间或大于590nm的吸收光谱是特别有利的，因为全血的相对局部吸收最小值存在于这些范围内。换言之，染料在525nm至545nm的波长处和/或在570nm至590nm的波长处不应具有(高)吸收。580nm至610nm、特别是590nm至610nm的发射光谱，特别有利于发射。用于检测焦磷酸盐的试剂可以是镁盐。
92.在一个优选的实施方案中，装置和/或试剂盒包含用于检测dna的检测单元，其中检测单元优选地选自吸收测量装置、荧光测量装置、浊度计、照相机、手机(例如手机的内部照相机，任选地与手机上的评价软件结合)以及它们的组合。
93.此外，装置和/或试剂盒还可以包含用于量化扩增dna的量的评价单元，其中评价单元优选地与检测单元通信连接。
94.引物对的至少一个引物、任选的两个引物的长度可以为20bp至45bp、特别优选25bp至40bp、特别是30bp至35bp。
95.此外，引物对的至少一个引物，任选引物对的两个引物，可以适于结合生物dna中
的重复dna序列，优选结合选自line序列、sine序列和alu序列的重复序列。
96.此外，引物对的至少一个引物、任选引物对的两个引物，可适于结合生物dna中的dna序列，该dna序列存在于生物患有疾病开始、期间或之后和/或过度肌肉劳损开始、期间或之后的血液循环中。
97.生物可以是人或动物。
98.装置和/或试剂盒可以包括温度控制单元，该温度控制单元配置为将反应混合物调节至≤45℃范围内的温度，优选调节至以下温度：20℃至44℃、特别优选25℃至42℃、特别优选30℃至41℃、特别是35℃至40℃。温度控制单元优选由电压范围为1v至12v的电压源提供能量。
99.然而，也可以预想装置和/或试剂盒包含/不包含任何温度控制单元。然后反应可以在室温下进行或通过(人或动物的)体热产生。后者是可能的，例如，因为装置的反应混合物移动得如此接近人或动物的身体，使得从身体到反应混合物的热传递是可能的。
100.等温扩增反应可以是半定量等温dna扩增反应或定量等温dna扩增反应。
101.此外，等温dna扩增反应可以是选自重组酶聚合酶扩增反应、siba hda、nasba和sda扩增反应的扩增反应；其任选地选自重组酶聚合酶扩增反应、siba和sda扩增反应。其优选重组酶聚合酶扩增反应。扩增反应的反应混合物任选地包括解旋酶。优选的扩增温度是37℃，即反应混合物优选温度控制为37℃的温度。
102.在通过检测试剂检测dna的情况下，装置和/或试剂盒配置为显示疾病和/或过度肌肉劳损的存在，任选地通过可见光透明的装置的边界显示。疾病特别选自炎症、癌症、自身免疫性疾病、冠状动脉、中风、败血症、染色体畸变、基因拷贝数的变化、基因突变以及它们的组合。
103.在一个优选的实施方案中，装置和/或试剂盒包含多个引物对，任选地至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个引物对，其中引物对各自适于扩增全血中存在的至少一种核酸(例如dna)，其中各引物对优选适于扩增不同核酸(例如dna)，优选存在于生物全血中的核酸(例如dna)，所述生物过度肌肉劳损和/或患有选自如下的疾病：炎症、癌症、自身免疫性疾病、冠状动脉、中风、败血症、染色体畸变、基因拷贝数的变化、基因突变以及它们的组合。
104.装置优选为侧流试纸条。
105.试剂盒的优选特征在于，其具有侧流试纸条，侧流试纸条包括反应混合物；或包括反应混合物和检测试剂。
106.此外，提出根据本发明的装置或根据本发明的试剂盒在用于直接、半定量或定量检测全血中的至少一种核酸(例如dna和/或rna)、优选用于直接检测存在于生物全血中的血细胞外侧的至少一种核酸(例如dna和/或rna)中的用途，所述生物患有疾病和/或过度肌肉劳损。
107.将参考以下附图和实施例更详细地解释根据本发明的主题，但无意将其限制于此处所示的特定实施方案。
108.图1显示通过直接使用全血的探针对特异性cfdna进行定量等温扩增反应的结果(参见实施例2)。从扩增曲线可以看出，探针的检测也适于(未纯化)全血的直接使用。此外，变得明显的是，作为培训的结果，可以在全血来源的受试人员中检测到cfdna的增加。
109.图2显示通过直接使用全血的dna嵌入荧光染料对特异性cfdna进行定量等温扩增反应的结果(参见实施例4)。从扩增曲线可以看出，荧光染料的检测也适于(未纯化)全血的直接使用。此外，变得明显的是，作为培训的结果，可以在全血来源的试验人员中检测到cfdna的增加。
110.图3显示特定cfdna通过探针的定量等温扩增反应的结果，该探针直接使用已被不同量溶血产物污染的人gdna(参见实施例3)。从扩增曲线可以看出，溶血产物对扩增反应有显著抑制作用，仅在用水以1:10000(体积/体积)强烈稀释后消失。
111.实施例1
–
通过探针直接使用全血检测无细胞dna
112.使用包含无细胞dna(所谓的cfdna)的全血样本，在40℃的温度下进行等温扩增反应，以扩增至少一种特异性无细胞dna。通过探针检测扩增的dna。
113.使用以下方案：
114.■
制备再水化混合物(总体积：63.08μl)
115.6.72μl正向引物(“301”引物)和反向引物(“302”引物)的引物混合物，用于检测肌肉劳损时进入血液循环(每10μm)的cfdna；
116.0.96μl探针(10μm)；
117.47.2μl重泡胀缓冲液(rehydration buffer)(来自“exo”kit,twistdx inc.,cambridge,usa)，其包含tris缓冲液、乙酸钾和peg 35000，优选25mm tris缓冲液、100mm乙酸钾和5.46％(重量/体积)的peg35000(参见，例如wo 2010/141940 a1中的段落[0054])；
[0118]
8.2μl水。
[0119]
■
混合；
[0120]
用63μl再水化混合物(通过上下移液)重新悬浮和溶解“twistamp(r)exo”试剂盒(twistdx inc.,cambridge,usa)的冻干颗粒；
[0121]
■
混合；
[0122]
■
将相应19.6μl溶解的颗粒转移到0.5ml eppendorf杯中；
[0123]
■
将1μm小鼠血浆作为对照加入一个eppendorf杯中，将相应的1μledta全血作为样本加入另一个eppendorf杯中；
[0124]
■
混合；
[0125]
■
加入相应的6.4μm乙酸镁溶液(浓度：80mm)；
[0126]
■
混合；
[0127]
■
从每个eppendorf杯中将相应的7μl加入到pcr孔板上；
[0128]
■
混合pcr孔板；
[0129]
■
在40℃下在cfx thermo cycler中孵育prc孔板(具有开口的盖子，即“lid off”)。
[0130]
结果如图1所示。可以清楚地认识到，根据本发明，使用探针作为检测试剂，并且直接使用(未纯化)全血的检测方法是有效的。训练前受试人员全血中的cfdna浓度(参见2处的信号)比训练后(参见1处的信号)小。来自小鼠的对照血浆样本(ntc血浆)未显示目标cfdna的任何扩增(参见3处的信号)，这证明此处显示的人cfdna扩增反应的特异性。
[0131]
实施例2
‑
通过荧光染料直接使用全血检测无细胞dna
[0132]
使用包含无细胞dna(所谓的cfdna)的全血样本，在40℃的温度下进行等温扩增反应，以扩增至少一种特异性无细胞dna。通过荧光染料("dye",biotium inc.,fremont,usa)检测扩增的dna。
[0133]
使用以下方案：
[0134]
■
制备再水化混合物(总体积：63.52μl)
[0135]
6.72μl正向引物(“63”引物)和反向引物(“66”引物)的引物混合物，用于检测肌肉劳损时进入血液循环(每10μm)的cfdna；
[0136]
4μl染料(20
×
)(biotium inc.,fremont,usa)；
[0137]
47.2μl重泡胀缓冲液(来自“exo”kit,twistdx inc.,cambridge,usa)，其包含tris缓冲液、乙酸钾和peg 35000，优选25mm tris缓冲液、100mm乙酸钾和5.46％(重量/体积)peg 35000(参见，例如wo 2010/141940 a1中的段落[0054])；
[0138]
5.6μl h2o。
[0139]
■
混合；
[0140]
■
用63μl再水化混合物(通过上下移液)重新悬浮和溶解“twistamp(r)exo”试剂盒(twistdx inc.,cambridge,usa)的冻干颗粒；
[0141]
■
混合；
[0142]
■
将相应19.6μl溶解的颗粒转移到0.5ml eppendorf杯中；
[0143]
■
将1μm小鼠血浆作为对照加入一个eppendorf杯中，将相应的1μledta全血作为样本加入另一个eppendorf杯中；
[0144]
■
混合；
[0145]
■
加入相应的6.4μm乙酸镁溶液(浓度：80mm)；
[0146]
■
混合；
[0147]
■
从每个eppendorf杯中将相应的7μl加入到pcr孔板上；
[0148]
■
混合pcr孔板；
[0149]
■
在40℃下在cfx thermo cycler中孵育prc孔板(具有开口的盖子，即“lidoff”)。
[0150]
结果如图2所示。可以清楚地认识到，根据本发明，使用嵌入荧光染料作为检测试剂，并且直接使用(未纯化的)全血的检测方法是有效的。训练前受试人员全血中的cfdna浓度(参见2处的信号)低于训练后(参见1处的信号)。来自小鼠的对照血浆样本(ntc血浆)未显示目标cfdna的任何扩增(参见3处的信号)，这证明此处显示的人cfdna扩增反应的特异性。
[0151]
实施例3
‑
在等温扩增反应过程中检测到缺少全血裂解
[0152]
首先制备溶血产物，通过多次解冻和冷冻循环处理小鼠血液，由此发生血细胞裂解。
[0153]
制剂：用于全血的rpa探针；
[0154]
引物：正向引物(“301”引物)和反向引物(“302”引物)，用于检测肌肉劳损时进入血液循环的cfdna；
[0155]
模板：1μl人gdna(50ng/ml)与1μl水，或1μl未稀释的溶血产物，或不同量的裂解全
血(溶血产物)与水的混合物。对于溶血产物与水的混合液，将按溶血产物分别用水以1:10(体积/体积)、1:100(体积/体积)、1:1000(体积/体积)和1:10000(体积/体积)的比例稀释。
[0156]
结果如图3和表1所示。含有1μl人gdna(50ng/ml)和1μl水的样本可以在1处看到。在2、3、4、5和6处可以看到含有1μl人gdna(50ng/ml)和不同量的溶血产物的样本。这里，溶血产物:水＝1:10000(体积/体积)的信号显示在2处；对于溶血产物:水＝1:1000(体积/体积)显示在3处；对于溶血产物:水＝1:100(体积/体积)显示在4处；溶血产物:水＝1:10(体积/体积)显示在5处；并且对于未稀释的溶血产物显示在6处。从图3中可以清楚地认识到，在等温扩增反应期间，反应混合物中溶血产物的数量不断增加，抑制目标cfdna的扩增反应。1:10000稀释的溶血产物部分已经显著损害反应动力学(参见1和2处的信号)。在没有溶血产物的情况下获得的反应动力学，与按照本发明使用实施例1和实施例2的全血的方法中的反应动力学相当。荧光阈值循环的各获得值汇总于表1中(参见表1)。
[0157]
模板:荧光阈值循环(cq)未稀释的溶血产物nd溶血产物：水＝1:10(v.v)nd溶血产物：水＝1:100(v.v)30.6溶血产物：水＝1:1000(v.v)24.1溶血产物：水＝1:10,000(v.v)19.4无溶血产物(仅有水)19.4
[0158]
表1.nd＝不可确定的
[0159]
从这些结果可以得知，全血中的血细胞在根据本发明的方法的等温扩增反应过程中没有被破坏，因此在扩增反应期间不释放抑制它的物质。因此，根据本发明的方法在使用全血时也可以确保高的检测灵敏度和检测精度。