检测人类肥胖易感基因多态性的探针及试剂盒的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，尤其涉及检测人类肥胖易感基因多态性的探针及试剂盒。


背景技术：

2.肥胖是当今世界上最大的健康问题之一，全世界超重和肥胖人口超过20亿，我国成人中超重或肥胖的比例也已经超过50％。饮食习惯及遗传背景都与人群的肥胖情况密切相关。多个欧美人群中的全基因关联研究表明fto(fat mass and obesity associated gene，脂肪量与肥胖相关基因)、adrb3等基因与肥胖的发生密切相关。但针对中国人群的肥胖易感基因的研究较少，原因之一是没有很合适的方便、精准、低成本的检测方法。
3.目前市场上并没有用于大规模人群肥胖基因风险位点筛查的试剂盒，传统的pcr-测序法则存在步骤繁琐、检测成本高等缺点，不适用于大规模人群筛查，使用基因芯片或基因测序法进行人群筛查则成本过高。其中，基因芯片法的优点是通量大，但是有成本比pcr法高，且操作复杂耗时长，有非特异性信号，灵敏度和重复性较差的缺点。此外，还有各种pcr法，如pcr-sanger测序法的优点是检测准确性高，设计简单但是通量较低，操作复杂，需要扩增，电泳，测序等多个步骤。
4.探针熔解曲线通过单链探针与扩增产物特异杂交的方式来提供熔解曲线。取代双链dna自身在从低温到高温中的熔解过程，利用荧光探针与不同的单链靶序列杂交后形成的双链dna熔解特征的差异来区分不同的靶序列。此技术无需染料，但要求探针在从低温到高温过程中，伴随着它与单链靶序列的结合与分离状态具有明显的荧光信号的变化，目前已常用于基因突变分析。对要检测的突变位点设计特异性探针，基于探针与互补碱基和非互补碱基形成之间的解离温度不同而将纯合野生型、杂合性和纯合突变型区分开来。
5.探针熔解曲线通过单链探针与扩增产物特异杂交的方式来提供熔解曲线。取代双链dna自身在从低温到高温中的熔解过程，利用荧光探针与不同的单链靶序列杂交后形成的双链dna熔解特征的差异来区分不同的靶序列。对要检测的突变位点设计特异性探针，基于探针与互补碱基和非互补碱基形成之间的解离温度不同而将纯合野生型、杂合性和纯合突变型区分开来。与基因芯片法相比操作简单耗时短，成本低，灵敏度高且重复性好；与pcr-sanger测序法相比，操作更加简单，通量更高。相较下探针熔解曲线法的缺点是探针设计难，有些snp由于附近的gc含量及自身发夹结构的问题，导致设计困难。
6.中国专利申请cn 105296619 a公开了中国人群肥胖易感基因snp分型用试剂盒及其使用方法，该专利申请选择有密切相关性的12个snp位点作为筛查目标，在一定程度上弥补目前现有snp分型筛查方法的不足，但仍无法实现有关人类肥胖易感基因位点的多重、高效检测。


技术实现要素：

7.为解决现有技术中存在的问题，本发明选择人类4个常见的肥胖易感基因位点
(fto基因rs1421085位点、apoa5基因rs662799位点、fabp2基因rs1799883位点、adrb3基因rs4994位点)进行多态性检测研究，通过调整探针的位置及其碱基组合，不断优化探针的tm值、gc含量及2级发夹结构，完成了检测人类肥胖易感基因多态性的探针设计与优化。本发明提供一种检测人类肥胖易感基因多态性的探针，并进而提供含该探针的试剂盒，实现了人类肥胖易感基因多态性的多重、高效检测。
8.本发明的目的将通过下面的详细描述来进一步说明。
9.本发明提供检测人类肥胖易感基因多态性的探针，包括针对fto基因rs1421085位点的第一探针aatcaatgtcatgccttagga，即seq id no:1；针对apoa5基因rs662799位点的第二探针ggcaaatctcactttcgctccag，即seq id no:2；针对fabp2基因rs1799883位点的第三探针gaatcaagcgcttttcgaaac，即seq id no:3；针对adrb3基因rs4994位点的第四探针ggccatcgcctggactccga，即seq id no:4。
10.优选地，所述第一探针的5’端用fam荧光激发基团修饰，3’端用bhq1荧光淬灭基团修饰。
11.优选地，所述第二探针的5’端用hex荧光激发基团修饰，3’端用bhq1荧光淬灭基团修饰。
12.优选地，所述第三探针的5’端用texas red荧光激发基团修饰，3’端用bhq2荧光淬灭基团修饰。
13.优选地，所述第四探针的5’端用cy5荧光激发基团修饰，3’端用bhq2荧光淬灭基团修饰。
14.此外，本发明还提供检测人类肥胖易感基因多态性的试剂盒，包括pcr mix混合液管，该混合液管包括所述的探针。
15.本发明提供的试剂盒相关检测方法学的设计和验证步骤如下：
16.a.分析fto基因rs1421085位点、apoa5基因rs662799位点、fabp2基因rs1799883位点、adrb3基因rs4994位点这4个基因位点所在序列的上下30bp，分别设计一条探针序列；
17.b.根据设计出来的探针序列，设计对应的野生型-未突变的target-tw，突变型的target-tm；
18.c.配制熔解曲线试剂，模拟人的基因型别，验证探针与target(靶序列)的熔解曲线，得出可以达到分型的tm值；如果得不出合格的tm值，则需要重新设计探针；
19.d.分析这4个基因位点所在序列的上下150bp，设计出与探针不会有发夹结构的引物对；
20.e.将引物，探针，pcr试剂混合，多重不对称扩增，根据熔解曲线的tm值，筛选出合适的引物对；
21.f.上述验证无误后，提取样本dna，将所述样本dna与本发明设计的引物对，探针试剂，pcr试剂混合，进行多重不对称荧光定量pcr扩增，得到熔解曲线的tm值；
22.g.根据所述的tm值，判断所述样本fto基因rs1421085位点、apoa5基因rs662799位点、fabp2基因rs1799883位点、adrb3基因rs4994位点的基因型。
23.优选地，所述检测人类肥胖易感基因多态性的试剂盒，还包括盒体、海绵隔板、fat-gene标准品对照品管和fat-gene阴性对照品管；所述海绵隔板嵌入在所述盒体内，所述盒体含盒盖，所述pcr mix混合液管、所述fat-gene标准品对照品管、所述fat-gene阴性
对照品管分别插入所述海绵隔板的管孔内。
24.与现有技术相比，本发明的有益效果包括：本发明提供的探针特异性好，灵敏度高，可实现对人类肥胖易感基因多态性的特异性、多重和高效检测。本发明提供的试剂盒在实现高效检测的同时，降低了检测成本，减少了杂交试剂和杂交探针的成本；无需开盖处理pcr产物，大大降低气溶胶风险。此外，本发明的相关检测方法具有操作步骤简单，扩增后无需杂交操作，有利于提高检测效率。
附图说明
25.图1fto基因rs1421085位点的熔解曲线图。
26.图2apoa5基因rs662799位点的熔解曲线图。
27.图3fabp2基因rs1799883位点的熔解曲线图。
28.图4adrb3基因rs4994位点的熔解曲线图。
29.图5样本1的肥胖易感基因检测结果图。
30.图6样本2的肥胖易感基因检测结果图。
具体实施方式
31.下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
32.本发明中，所涉及的试剂均为常规市售产品，或可通过本领域的常规技术手段获得；相关检测方法，按本领域的通用方法进行。
33.实施例一检测人类肥胖易感基因多态性的探针
34.根据熔解曲线对应的tm值可以对基因进行分型，据此本发明选择了fto基因rs1421085位点、apoa5基因rs662799位点、fabp2基因rs1799883位点、adrb3基因rs4994位点这4个基因位点序列，设计探针如表1所示。涉及到的这4个基因位点的target序列如表2所示。
35.表1探针序列表
[0036][0037]
表2 target序列表
[0038][0039][0040]
涉及到跑熔解曲线的试剂配方如下：3mm的mgcl2，1
×
pcrbuffer(含20mm(nh4)2so4，10mm tri-hcl，2mm mgcl2)，200μm的duplus dntpmix，1μm上述探针序列，1μm上述target序列。涉及到跑熔解曲线的pcr仪设置程序如下：步骤一：95℃30s；步骤二：30℃30s；步骤三：以0.3-1℃的升温速率(30～45)℃—(80～90)℃递增做熔解曲线，每隔0.6℃采集fam、hex、texas red、cy5这4个荧光信号；步骤四：12℃2min。fto基因rs1421085位点等位点的熔解曲线分别如图1至图4所示。
[0041]
涉及到的单重扩增pcr试剂如下：0.2u的hs taq聚合酶，3mm的mgcl2，1
×
pcr buffer(20mm(nh4)2so4，10mm tri-hcl，2mm mgcl2)，200μm的du plus dntp mix，上述的探针和上下游引物，具体终浓度如表3所示。
[0042]
表3探针和引物的浓度
[0043] rs1421085(t》c)rs662799(a》g)rs1799883(c》t)rs4994(a》g)正向引物f(μm)0.40.040.040.04反向引物r(μm)0.040.40.40.4探针(μm)0.10.20.20.1
[0044]
涉及到的pcr仪设置程序如下：步骤一:95～94℃ 7min；步骤二：95～94℃ 30s，65℃ 20s(每个循环降低1℃)，72℃ 15s，10个循环；步骤三：95～94℃ 15s，58～60℃ 15s，72℃ 15s，40个循环；步骤四：95℃ 30s；步骤五：30℃ 30s；步骤六：以0.3-1℃的升温速率(30～45)℃—(80～90)℃递增做熔解曲线，每隔0.6℃采集fam、hex、texas red、cy5这4个荧光信号；步骤七：12℃ 2min。
[0045]
最终根据靶序列和单重扩增的熔解曲线的结果，提取对应型别的tm值，就可以判断其基因型别。根据上述方法结果所做出来的tm值判定型别，如表4所示。
[0046]
表4 tm值判定型别表
[0047][0048]
实施例二检测人类肥胖易感基因多态性的试剂盒
[0049]
本发明提供的检测人类肥胖易感基因多态性的试剂盒，包括：盒体1、海绵隔板2、pcr mix混合液管3、fat-gene标准品对照品管4、fat-gene阴性对照品管5，海绵隔板2嵌入在盒体1内，盒体1含盒盖，pcr mix混合液管3、fat-gene标准品对照品管4、fat-gene阴性对照品管5分别插入海绵隔板2上的管孔内。pcr mix混合液管3装的试剂包括：1u的hs taq聚合酶，0.5u的ung酶，3.25mm的mgcl2，1
×
pcr buffer(20mm(nh4)2so4，10mm tri-hcl，2mm mgcl2)，200μm的du plus dntp mix，实施例一中的探针序列及相应的上下游引物。
[0050]
试剂盒中，pcrmix混合液各组分来源：hs taq聚合酶是购于宝日医生物技术有限公司，hs taq酶具有高保真性，能够保证扩增产物的碱基错配率在测序允许的标准范围内。ung酶是购于宝日医生物技术有限公司，用我们试剂盒扩增的pcr产物中含有尿嘧啶，在25℃时反应10min，ung酶能将前期不小心引入的扩增产物中尿嘧啶切断，使其不能成为扩增模板，ung酶在95℃失活，不影响接下来人dna作为模板的扩增，从而有效预防由pcr产物的污染导致的假阳性结果。1
×
pcr buffer是由购于上海生工生物工程有限公司的10
×
pcr buffer(含(nh4)2so4、20mm mgcl2)稀释10倍得到的。du plus dntp mix是购于宝日医生物
技术有限公司，含有datp(2.5mm)，dctp(2.5mm)，dgtp(2.5mm)，dutp(7.5mm)。3.25mm的mgcl2是本发明根据多重扩增的效果，自己配制。fat-gene标准对照品是自行配制的，分别由合成的fto基因rs1421085位点的ct型质粒，apoa5基因rs662799位点的ga型质粒，fabp2基因rs1799883位点的ct型质粒，adrb3基因rs4994位点的ag型质粒按照1：1：1：1比例混合，终浓度各为1μm。fat-gene阴性对照品是不含目的片段灭菌水。
[0051]
实施例三应用试剂盒进行样本检测
[0052]
使用实施例二的试剂盒对经过测序已知基因型别的样本进行检测，考察试剂盒检测样本的特异性和准确性。选出2个样本，将这2个样本送往进行基因测序，这2个样本的部分位点测序结果如表5。
[0053]
表5 2个样本的部分位点的检测结果
[0054]
样本编号rs1421085rs662799rs1799883rs49941号ctagccaa2号ctggctaa
[0055]
按照下面的步骤对样本进行检测，对所选的2个样本及试剂盒中的fat-gene标准品对照品和fat-gene阴性对照品进行检测，具体包括如下步骤：
[0056]
s01：样本的dna提取；可以采用市售的dna提取试剂盒进行dna提取。
[0057]
s02：样本dna质检：使用nano-1000超微量分光光度计对提取的dna进行浓度和纯度的检测。dna浓度需要大于0.2ng/μl，纯度a260/a280的范围是1.7-2.0。
[0058]
s03：pcr反应液的配制：分装23μl的pcr mix混合液至荧光pcr管中，然后加2μl的待检样本dna或fat-gene标准对照品或fat-gene阴性对照品。
[0059]
s04：将上述装有pcr反应液的pcr反应管置于荧光pcr仪器(bio-rad cfx 96)上进行pcr扩增和熔解曲线分析，具体反应程序为：
[0060]
(1)25℃ 10min，95℃ 7min；
[0061]
(2)95℃ 30s
→
65～56℃ 15s(-1℃/cycle)
→
72℃ 15s，10个循环，其中65～56℃ 15s每个循环下降1℃；
[0062]
(3)95℃ 15s
→
55℃ 20s
→
76℃ 15s，40个循环；
[0063]
(4)95℃ 30s
→
30℃ 30s
→
35～79.5℃，其中35～79.5℃以0.3℃/5s的升温速率进行熔解曲线分析，且在此阶段采集探针所对应通道(fam、hex、texas red、cy5)的荧光信号；
[0064]
s05：结果分析：2个待检样本及两个对照品在各通道的熔解曲线分析结果如图5、图6所示，由荧光pcr仪自带的熔解曲线分析软件读取标准对照及2个样本在各通道的tm值，将样本各tm值与tm值判读表(表4)进行对照，读出样本对应的基因型别。
[0065]
结果：本实施例检测的2份样本的基因型均与其测序结果的基因型一致，准确性及特异性均为100％。
[0066]
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。