一株耐盐且高效降解没食子酸的肺炎克雷伯氏菌及其应用的制作方法

1.本发明涉及没食子酸降解技术领域，尤其涉及一株耐盐且高效降解没食子酸的肺炎克雷伯氏菌及其应用。


背景技术：

2.没食子酸，又称倍酸、五倍子酸，化学名称3,4,5-三羟基苯甲酸，分子式为c7h6o5，分子结构如下：我国是没食子酸及其衍生物的主产国，国内厂家大多数以含水解单宁的植物五倍子为原料来生产没食子酸，每生产1t没食子酸产品约产生10～20t废母液。没食子酸生产废水中含有没食子酸(15～20g/l)、葡萄糖、焦糖色素、nacl等物质，多呈黑色，色度大于3500度，且cod常高于60000mg/l，直接排放会造成严重的环境污染。
3.生化法处理废水主要利用微生物的分解作用，将废水中的有机物转化为简单的无机物，实现废水的净化，相较于物化处理而言具有操作难度小、能耗和成本低等优点。然而，没食子酸不易被微生物降解，在低浓度下即具有杀菌、抑制微生物的作用，并且，没食子酸生产废水具有tds值高(nacl浓度约为100g/l)、酸度高(约为0.6)等特点，导致没食子酸生产废水的可生化性低，生化处理困难。
4.已有研究表明，没食子酸会抑制肺炎克雷伯氏菌(klebsiella pneumoniae)中荚膜多糖的合成，抑制肺炎克雷伯氏菌的生长。目前，在关于肺炎克雷伯氏菌的研究中，尚未报道过有属于该种的菌株具有高效降解没食子酸的能力，并同时兼具较好的耐盐性能。


技术实现要素：

5.为了解决上述技术问题，本发明提供了一株耐盐且高效降解没食子酸的肺炎克雷伯氏菌及其应用。本发明的菌株mszs12能高效降解没食子酸，并能适应较宽的ph范围和较高的nacl浓度，在含没食子酸废水的生化处理中具有较好的应用前景。
6.本发明的具体技术方案为：第一方面，本发明提供了一株耐盐且高效降解没食子酸的肺炎克雷伯氏菌，其特征在于，所述肺炎克雷伯氏菌命名为mszs12，已在2021年10月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.23660，微生物分类命名为肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种klebsiella pneumoniae subsp.pneumoniae。
7.本发明的菌株mszs12提取自制药厂的新鲜污泥，经鉴定属于肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种。该菌株具有以下性能：
(1)对没食子酸具有较好的耐受性，能以没食子酸为唯一碳源高效降解没食子酸。经试验，在静态体系中，菌株mszs12对初始5g/l没食子酸在3d内的cod去除率在90％以上。
8.(2)具有较好的耐盐性。经试验，菌株mszs12在3wt％nacl浓度下仍能高效分解没食子酸，对初始5g/l没食子酸在3d内的cod去除率可达65％左右。
9.(3)能适应较宽的ph范围。经试验，菌株mszs12在5.0～9.0的ph下均具有较好的没食子酸分解能力，对初始5g/l没食子酸在3d内的cod去除率能够维持在50％以上。
10.(4)耐盐性和对没食子酸的分解能力具有较好的传代稳定性。经试验，在传代30次后，在3wt％的nacl浓度下，菌株mszs12对初始5g/l没食子酸在3d内的cod去除率仍能维持在65％以上。
11.在现有技术中，并未报道过属于肺炎克雷伯氏菌的菌株兼具上述性能。而由于本发明的菌株mszs12兼具以上性能，因而能够将其用于没食子酸的生物降解中，并能适应含没食子酸废水较宽的ph范围，以及较高的nacl含量，为含没食子酸废水的生化处理提供了重要的菌种资源。
12.第二方面，本发明提供了一种含有所述肺炎克雷伯氏菌的菌体培养物。
13.作为优选，所述菌体培养物为菌液或菌剂。
14.第三方面，本发明提供了一种由所述肺炎克雷伯氏菌制得的全发酵液、胞内物质提取物或粗酶液。
15.第四方面，本发明提供了所述肺炎克雷伯氏菌或所述菌体培养物在含没食子酸的废水处理中的应用。
16.作为优选，所述应用包括以下步骤：对含没食子酸的废水进行预处理后，将所述肺炎克雷伯氏菌或所述菌体培养物接种到其中，进行生物处理。
17.作为优选，所述预处理包括以下过程：将含没食子酸的废水中的氯化钠浓度调节至0～4wt％。
18.进一步地，所述预处理包括以下过程：将含没食子酸的废水中的氯化钠浓度调节至0～1wt％。
19.菌株mszs12能耐受0～3wt％的氯化钠浓度，降解没食子酸的最佳nacl浓度为0～1wt％，并在4wt％的nacl浓度下仍能维持较高的没食子酸降解效率。
20.作为优选，所述预处理包括以下过程：将含没食子酸的废水的ph调节至5.0～9.0。
21.进一步地，所述预处理包括以下过程：将含没食子酸的废水的ph调节至6.0～7.0。
22.菌株mszs12能耐受5.0～9.0的ph，降解没食子酸的最佳ph范围为6.0～7.0，并在ph为5.0和9.0时仍能维持较高的没食子酸降解效率。
23.与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明的菌株mszs12能够以没食子酸为唯一碳源，高效降解没食子酸，并能适应较宽的ph范围和较高的nacl浓度，且耐盐性和对没食子酸的分解能力具有较好的传代稳定性，在含没食子酸废水的生化处理中具有较好的应用前景。
附图说明
24.图1为nacl盐度对菌株mszs12降解没食子酸的影响。
25.图2为驯化菌群属水平相对丰度图。其中，“others”类别代表相对丰度《0.5％的
属。
26.图3为ph对菌株mszs12降解没食子酸的影响。
27.图4为传代次数对菌株mszs12降解没食子酸的影响。
具体实施方式
28.下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
29.实施例1：菌种驯化及分离(1)培养基配制：按照以下配方，配制无机盐培养基和lb培养基：无机盐培养基(g/l)：nacl 10、kh2po
4 0.5、k2hpo
4 6.8、mgso4·
7h2o 0.1、mnso4·
h2o 0.1、cacl
2 0.1、feso4·
7h2o 0.1、na2moo4·
2h2o 0.006、cuso4·
5h2o 0.006、znso4·
7h2o 0.007，ph＝7。以没食子酸作为唯一碳源。固体培养基加入质量分数2％的琼脂粉。
30.lb培养基(g/l)：蛋白胨10.0、酵母提取物5.0、nacl 10.0，ph＝7。固体培养基加入质量分数2％的琼脂粉。
31.(2)菌种驯化：将取自各制药厂的新鲜污泥混合液10ml接种至装有100ml无机盐培养基(没食子酸含量为2g/l)的三角瓶中，置于30℃、130r/min振荡培养箱中培养1周，定期取样检测体系中的cod值。当体系明显浑浊并且cod去除率达到80％后，再按照10％接种量接种于新培养基中进行驯化，培养基中没食子酸浓度逐渐提高至5g/l，当cod去除效果显著时，视为驯化成功。
32.(3)菌种分离：取驯化成功的菌群采用高通量测序，以进行微生物菌群分析，高通量分析结果如图2所示。由图2可知，驯化菌群中klebsiella属(克雷伯氏菌属)相对丰度为88.6％，故菌群中大多数为该属，推测klebsiella属为没食子酸降解功能菌种。
33.按10-2
至10-8
的稀释度，将驯化成功后获得的菌液稀释涂布至含2g/l没食子酸的无机盐固体培养基上，于30℃静置培养，定期观察平板上菌落生长状况。当菌落形态明显形成后，反复划线纯化，而后挑取单菌落至lb培养基中，30℃、120r/min下震荡培养后，待菌体明显生长后进行甘油保种。同时，将单菌种进行16s rdna测序鉴定，并将16s rdna序列信息提交至ezbiocloud数据库(https://www.ezbiocloud.net/identify)中比对，结果见表1。根据16s rdna比对结果，分离到的菌株属于肺炎克雷伯氏菌肺炎属(klebsiella pneumoniae subsp.pneumoniae)，本发明人将其命名为mszs12，2021年10月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.23660。
34.表1
菌株名最相似菌种相似度mszs12klebsiella pneumoniae subsp.pneumoniae dsm 30104
t
99.71％
实施例2：ph对菌株mszs12降解没食子酸性能的影响(1)种子液制备：将菌株mszs12甘油悬浊液按照1％接种量接种于无菌的lb培养基中，菌株待生长至对数生长期后在进行离心(6000r/min、离心5min)，弃去上清，收集菌体。取0.9％生理盐
水对菌体进行重悬，调配菌体浓度od
600
＝1.0作为种子液。
35.(2)ph对菌株mszs12的影响：按照实施例1中的配方配制含没食子酸5g/l的无机盐培养液，调节ph分别为5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，用0.22μm过滤膜进行过滤。将种子液按照10％接种量接种到过滤后的无机盐培养液中，30℃、130r/min下培养3d，定期测定cod数据，以评估处理效果，测定结果见图3。
36.由图3可知，菌种mszs12降解没食子酸最佳ph为6.0～7.0，3d可将体系cod去除约80％。
37.实施例3：盐度对菌株mszs12降解没食子酸性能的影响按照实施例1中的配方配制含没食子酸5g/l的无机盐培养液，调节nacl盐度分别为0、10、20、30和40(即nacl浓度分别为0wt％、1wt％、2wt％、3wt％和4wt％)，用0.22μm过滤膜进行过滤。将实施例2中制得的种子液按照10％接种量接种到过滤后的无机盐培养液中，30℃、130r/min下培养3d，定期测定cod数据，以评估处理效果，测定结果见图1。
38.由图1可知，降解没食子酸最佳nacl盐度为0～1.0wt％，cod去除率约80％；但在3wt％高nacl盐度下，菌种仍具有较高处理效果，cod去除率约65％。故菌种mszs12具有较高的耐盐性能，在高盐胁迫下仍能有效降解没食子酸。
39.实施例4：菌株mszs12对没食子酸降解的稳定性将菌株mszs12在lb培养基中进行传代，取传代第0次、10次、20次、30次进行没食子酸降解实验，体系控制在3wt％nacl、ph 7.0、30℃、130r/min条件下进行，处理3d后，测定cod含量，以评估处理效果，测定结果见图4。
40.由图4可知，经过多次传代后，在3wt％nacl高盐胁迫环境下，菌株mszs12对没食子酸cod的去除率仍维持在65％左右，表明该菌株对没食子酸的降解能力具有较好的稳定性。
41.本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
42.以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。