副地衣芽孢杆菌及其应用

1.本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种副地衣芽孢杆菌及其应用。


背景技术：

2.副地衣芽孢杆菌是中生芽孢的革兰氏阳性需氧菌，在自然界分布非常广泛，且被广泛应用于医药、农药、食品、饲料加工、环境污染治理等行业，但通过副地衣芽孢杆菌制备硒多糖鲜有报道。


技术实现要素：

3.本发明的主要目的是提出一种副地衣芽孢杆菌及其应用，旨在提出一种副地衣芽孢杆菌，从该菌种中能够提取分离得到硒多糖。
4.为实现上述目的，本发明提出一种副地衣芽孢杆菌，所述副地衣芽孢杆菌为副地衣芽孢杆菌(bacillus paralicheniformis)t3，保藏编号为cctcc no：m20211385，保藏时间为2021年11月08日。
5.本发明还提出一种硒多糖，所述硒多糖由如上所述的副地衣芽孢杆菌加硒处理后提取胞外多糖得到。
6.本发明还提出一种如上所述的副地衣芽孢杆菌在分解淀粉上的应用。
7.本发明还提出一种如上所述的副地衣芽孢杆菌在制备抗氧化剂上的应用。
8.本发明还提出一种纳米硒，所述纳米硒由如上所述的副地衣芽孢杆菌还原无机硒得到。
9.本发明的技术方案中，副地衣芽孢杆菌t3加硒处理后提取的硒多糖具有较好的抗氧化能力，易于被机体吸收和利用，具有在医药、农药、食品和饲料等应用的优势；副地衣芽孢杆菌t3能够在300mm亚硒酸钠浓度的环境中正常生长，耐硒能力强，对亚硒酸钠有较高的耐受性，便于纳米硒的生物制备；并且，较高的耐受性也使得副地衣芽孢杆菌t3能够对高硒环境进行污染治理；副地衣芽孢杆菌t3在添加亚硒酸钠后α-淀粉酶活性发生了显著提高，进一步提升分解淀粉能力，可用于开发新型发酵饲料及酶制剂产品，在饲料行业具有较广阔的应用前景。
附图说明
10.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
11.图1为本发明提出的副地衣芽孢杆菌t3的分离纯化方法的一实施例的流程示意图；
12.图2为本发明副地衣芽孢杆菌t3的系统发育树；
13.图3为本发明提出的纳米硒的制备方法的一实施例的流程示意图；
14.图4为本发明副地衣芽孢杆菌t3的菌落形态；
15.图5为本发明副地衣芽孢杆菌t3在含不同浓度亚硒酸钠培养基中的生长曲线；
16.图6为本发明副地衣芽孢杆菌t3的纳米硒还原率测定结果；
17.图7为本发明副地衣芽孢杆菌t3的抗氧化活性测定结果；
18.图8为本发明副地衣芽孢杆菌t3的产淀粉酶活性测定结果；
19.图9为本发明纳米硒的dls测定测定结果；
20.图10为本发明纳米硒的sem扫描电镜图；
21.图11为本发明实施例11中的葡萄糖标准曲线；
22.图12为本发明实施例11中的icp-ms法测定硒含量标准曲线；
23.图13为本发明实施例12中的硒多糖和粗多糖的清除自由基能力测定结果。
24.本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
25.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
26.需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“a和/或b”为例，包括a方案、或b方案、或a和b同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
27.副地衣芽孢杆菌是中生芽孢的革兰氏阳性需氧菌，在自然界分布非常广泛，且被广泛应用于医药、农药、食品、饲料加工、环境污染治理等行业，但通过副地衣芽孢杆菌制备硒多糖鲜有报道。
28.鉴于此，本发明提出一种副地衣芽孢杆菌，所述副地衣芽孢杆菌为副地衣芽孢杆菌(bacillus paralicheniformis)t3，已于2021年11月08日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为cctcc no：m20211385。
29.副地衣芽孢杆菌t3通过将选自湖北恩施植物碎米荠附近的土壤分离纯化得到。该菌株在添加亚硒酸钠后发酵得到发酵液，再经提取胞外多糖即为硒多糖，该硒多糖具有较好的抗氧化能力，易于被机体吸收和利用，具有在医药、农药、食品和饲料等应用的优势。
30.副地衣芽孢杆菌t3能够在300mm亚硒酸钠浓度的环境中正常生长，耐硒能力强，对亚硒酸钠有较高的耐受性，便于纳米硒的生物制备；并且，较高的耐受性也使得副地衣芽孢杆菌t3能够对高硒环境进行污染治理。
31.并且，副地衣芽孢杆菌t3的发酵液的α-淀粉酶活性较高，分解淀粉能力较强，在用于制造饴糖、葡萄糖和糖浆等时，能够显著提高产量；而相比于副地衣芽孢杆菌t3的未添加
亚硒酸钠后的发酵液，副地衣芽孢杆菌t3的添加亚硒酸钠后的发酵液中α-淀粉酶活性发生了显著提高，进一步提升分解淀粉能力，可用于开发新型发酵饲料及酶制剂产品，在饲料行业具有较广阔的应用前景。
32.本发明还提出一种副地衣芽孢杆菌的分离纯化方法，如图1所示，包括以下步骤：
33.步骤s11、将土样烘烤，再分散到lb平板上，培养后挑取单菌落，继代培养，纯化，得到纯化单菌落。
34.步骤s12、将所述纯化单菌落涂布于含200mm亚硒酸钠的lb固体培养基平板上，培养，挑取长势较好且颜色较红的单菌落，即为初筛菌株。
35.步骤s13、对所述初筛菌株进行液体培养试验，筛选出长势最好且颜色最红的单菌落，即为副地衣芽孢杆菌t3。
36.本发明对副地衣芽孢杆菌t3进行16s rrna序列鉴定，步骤如下：
37.将副地衣芽孢杆菌t3活化后提取总dna，扩增菌株的16s rrna基因，并送生工生物工程(上海)股份有限公司进行16s rrna测序；测序结果经blast比对后利用mega 7.0软件构建系统发育树。
38.提取副地衣芽孢杆菌t3的dna，27f和1492r为引物扩增其16s rdn a，产物在1％(质量分数)琼脂糖凝胶，得到约1500bp的片段，清晰可见，无杂带。
39.将得到的测序结果输入ezbiocloud数据库与已知序列进行同源性比较分析，结果显示副地衣芽孢杆菌t3与副地衣芽孢杆菌bacillus paralicheniformi s的同源性高达92％。
40.副地衣芽孢杆菌t3系统发育树(n-j法构建)结果如图2所示，图中方框标记为本研究分离菌株，鉴定其为bacillus paralicheniformis t3。
41.本发明还提出一种硒多糖，所述硒多糖由如上所述的副地衣芽孢杆菌加硒处理后提取胞外多糖得到。
42.具体提取步骤如下：将添加有亚硒酸钠的副地衣芽孢杆菌t3发酵液进行沸水浴，冷却至室温，离心取上清，加入三氯乙酸-水溶液，震荡混匀，静置，离心取上清，加入无水乙醇，静置，离心取沉淀，将沉淀复溶后透析，得到硒多糖。
43.以添加5mm浓度的亚硒酸钠为例，最终得到的硒多糖产量在116.2mg/l，且硒多糖中硒含量为2972.2μg/g，副地衣芽孢杆菌t3具备较好的硒多糖生产能力、硒多糖中硒含量高。
44.本发明还提出一种如上所述的副地衣芽孢杆菌在分解淀粉上的应用。
45.副地衣芽孢杆菌t3具有较高的α-淀粉酶活性，尤其是在添加亚硒酸钠后α-淀粉酶活性发生了显著提高，能够在食品领域进行应用，如生产饴糖、葡萄糖和糖浆，以提高产量。
46.本发明还提出一种如上所述的副地衣芽孢杆菌在制备抗氧化剂上的应用。
47.经副地衣芽孢杆菌t3得到的纳米硒或次生代谢产物，羟基自由基清除能力、abts自由基清除能力和dpph自由基清除能力较高，具有较好的抗氧化能力，能够将该纳米硒或次生代谢产物用于制备具有抗氧化功效的医药、农药、食品和饲料。
48.本发明还提出一种纳米硒，所述纳米硒由如上所述的副地衣芽孢杆菌还原无机硒得到。
49.该纳米硒颗粒粒度大小均一、分散均匀，粒径在100～200nm之间，生物活性很高。
当作为补硒剂添加至保健食品和医药品时，更易于被人体吸收和利用。
50.无机硒盐包括亚硒酸钠。进一步地，亚硒酸钠的浓度不高于300mm。
51.本发明还提出一种纳米硒的制备方法，如图3所示，包括以下步骤：
52.步骤s21、将如上所述的副地衣芽孢杆菌t3制成种子液。
53.步骤s22、将所述种子液接种至含亚硒酸钠的lb液体培养基中，振荡培养，至发酵液呈红色，收集发酵液，得到纳米硒发酵液。
54.步骤s23、将所述纳米硒发酵液离心取沉淀，清洗，得到混合物。
55.步骤s24、将所述混合物研磨，重悬后得到纳米硒悬液。
56.步骤s25、将所述纳米硒悬液过滤，收集滤液，再向所述滤液中加入正己烷，混匀，静置，收集下层液体，将所述下层液体离心取沉淀，清洗，得到纳米硒。
57.以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
58.实施例1副地衣芽孢杆菌的分离纯化
59.称取1g土样置于烘箱中1h，采用弹射法将烘烤后的土样分散到lb平板上，37℃培养24h，挑取单菌落，继代培养，纯化，得到纯化单菌落。使用无菌的涂布棒将所述纯化单菌落均匀涂布于含200mm亚硒酸钠的lb固体培养基平板上，倒置于37℃中培育24h。再挑取多株长势较好且颜色较红的单菌落分别接种至含亚硒酸钠的lb液体培养基中培养，挑取长势最好且颜色最红的单菌落，即为副地衣芽孢杆菌t3。
60.实施例2纳米硒的制备
61.(1)将实施例1获得的副地衣芽孢杆菌t3涂布于lb平板上，活化后获得活化单菌落，然后将活化单菌落接种至lb液体培养基中，于180rpm转速和37℃条件下活化12h，得到od
600nm
值为0.8的种子液。
62.(2)将所述种子液按1％的接种量接种至含亚硒酸钠的lb液体培养基中，在180rpm转速和37℃条件下振荡培养，至发酵液呈红色，收集发酵液，得到纳米硒发酵液。
63.(3)在10 000rpm转速下将所述纳米硒发酵液离心30min，收集沉淀，用无菌水清洗2～3次，得到混合物。
64.(4)将所述混合物与液氮混合，研磨，加入无菌水重悬，于冰上细胞超声破碎8min，得到纳米硒悬液。
65.(5)将所述纳米硒悬液依次过20μm、10μm、5μm、3μm、1.2μm和0.8μm的滤膜，收集滤液，再向所述滤液中加入5倍于所述滤液体积的正己烷，混匀，静置，收集下层液体，在10 000rpm转速下将所述下层液体离心30min，收集沉淀，用无菌水清洗2～3次，得到纳米硒。
66.实施例3副地衣芽孢杆菌t3的形态学鉴定
67.具体步骤如下：将副地衣芽孢杆菌t3置于lb固体培养基中活化，活化后挑取至lb液体培养基中，在180rpm转速和37℃条件下恒温振荡活化12h，od
600nm
约为0.8，制为种子液。
68.稀释106倍后均匀涂布于lb固体平板和含有300mm亚硒酸钠的lb固体平板中，在37℃下恒温培养，观察菌落形态。得到结果如图4所示，菌落形态不透明、呈灰白色、圆形，表面有褶皱、边缘完整、较粘稠。
69.实施例4副地衣芽孢杆菌t3的生理生化鉴定
70.vp实验、碳源利用等生理生化实验进行鉴定。
71.最终鉴定结果如表1所示，其与《伯杰氏手册》中地衣芽孢杆菌对比结果一致，结合实施例1的副地衣芽孢杆菌t3的形态学鉴定和系统发育进化树的构建，判断副地衣芽孢杆菌t3属于副地衣芽孢杆菌属。
72.表1副地衣芽孢杆菌t3与地衣芽孢杆菌生理生化特性比较
[0073][0074]
实施例5副地衣芽孢杆菌t3的生长曲线测定
[0075]
具体步骤如下：制备含亚硒酸钠浓度为0、25mm、50mm、100mm不同浓度的lb液体培养基。按1％的接种量将副地衣芽孢杆菌t3的种子液分别接种于含100ml各亚硒酸钠浓度的lb液体培养基的三角摇瓶中，在180rpm转速和37℃条件下恒温振荡培养。对应各亚硒酸钠浓度的lb液体培养基进行5组种子液样品重复培养实验。每隔1h进行取样。将取样取出的菌液，在600nm波长下测定其吸光度值，绘制生长曲线，得到结果如图5所示。由图5可知，无亚硒酸钠添加的情况(ck)菌株在6h进入对数生长期，约26h进入稳定生长期。通过比较可知，随着加入亚硒酸钠的浓度增大，菌株的生长表现出被抑制效果，停滞期变长，且浓度越高，抑制效果越明显。
[0076]
实施例6副地衣芽孢杆菌t3对亚硒酸钠的耐受性测定
[0077]
具体步骤如下：取副地衣芽孢杆菌t3的种子液按1％接种量分别接种至含50mm、100mm、150mm、200mm、250mm、300mm亚硒酸钠的lb液体培养基中，在180rpm转速和37℃条件下恒温振荡培养48h，观察菌体生长状况。结果显示，副地衣芽孢杆菌t3在300mm亚硒酸钠的lb液体培养基依旧能够正常生长，说明副地衣芽孢杆菌t3对亚硒酸钠浓度的耐受性最高达到300mm，耐硒能力强。
[0078]
实施例7副地衣芽孢杆菌t3的纳米硒还原率测定(icp-ms法)
[0079]
(1)微波消解样品
[0080]
收集副地衣芽孢杆菌t3对数期的菌液；将菌液以1％的接种量接种至含5mm亚硒酸钠的lb液体培养基中，在培养至24h、36h、48h、60h、72h取得2ml样品；将所取样品超声破碎10min后于12 000rpm转速和4℃条件下离心15min，收集上清液；将各个时间收集的上清液准确移取1ml于微波消解内罐中，加人5ml硝酸，加盖放置1h或过夜，旋紧罐盖，按照微波消解仪标准操作步骤进行消解。冷却后取出，慢慢打开罐盖排气，用少量水冲洗内盖，将消解罐放在控温电热板上或超声水浴箱中，于55℃下加热30min或超声脱气2～5min。用水定容至25ml，混匀得到试样溶液备用，同时做空白试验得到空白溶液。
[0081]
(2)标准曲线的制作
[0082]
将混合标准溶液注人电感耦合等离子体质谱仪中，测定待测元素和内标元素的信号响应值，以待测元素的浓度为横坐标，待测元素与所选内标元素响应信号值的比值为纵坐标，绘制标准曲线。
[0083]
(3)试样溶液的测定
[0084]
将空白溶液和试样溶液分别注入电感耦合等离子体质谱仪中，测定待测元素和内标元素的信号响应值，根据标准曲线得到消解液中待测元素的浓度。
[0085]
(4)纳米硒还原率测定
[0086]
试样中低含量待测元素的含量按下式计算：x＝(ρ-ρ0)
×v×
f/m*1000。
[0087]
其中，x-试样中待测元素含量单位为毫克每千克或毫克每升(mg/kg或mg/l)；ρ-试样溶液中被测元素质量浓度，单位为微克每升(μg/l)；ρ
0-试样空白液中被测元素质量浓度，单位为微克每升(μg/l)；v-试样消化液定容体积，单位为毫升(ml)；f-试样稀释倍数；m-试样称取质量或移取体积，单位为克或毫升(g或ml)；1 000-换算系数；计算结果保留三位有效数字。
[0088]
得到测定结果如图6所示，纳米硒还原率在培养24小时后还原率大于60％，而在60小时后纳米硒还原率达到70％，说明副地衣芽孢杆菌t3能够将亚硒酸钠还原成纳米硒，且还原能力较好。
[0089]
实施例8副地衣芽孢杆菌t3的体外清除自由基能力测定
[0090]
抗氧化能力测定
[0091]
1)抗dpph自由基活性测定：吸取0.25mmol/l dpph溶液(无水乙醇配置)600μl，分别加入10、5、2.5、1、0.1、0.01mg/ml的次生代谢产物醇溶液70μl，用蒸馏水定容至670μl，于暗处反应30min，测定517nm处吸羟自由基的反应体系根据吸光度值计算dpph自由基清除率，计算公式如下公式所示：清除率％＝(1-a
a-ac/ab)
×
100。
[0092]
其中，aa为样品与dpph溶液混合后的吸光值；ac为样品与乙醇溶液混合后的吸光值；ab为dpph与水混合后的吸光值。
[0093]
2)抗abts自由基活性测定：吸取abts工作液(0.2ml abts 0.2ml k2s2o8(黑暗环境下室温放置12h)，无水乙醇稀释，控制734nm吸光度在0.7左右)600μl，分别加入10、5、2.5、1、0.1、0.01mg/ml的次生代谢产物醇溶液70μl，用蒸馏水定容至670μl，于37℃培养箱中反应30min，测定734nm处吸光值。
[0094]
根据吸光度值计算abts自由基清除率，计算公式如下公式所示：清除率％＝(1-a
a-ac/ab)
×
100。
[0095]
其中，aa为样品与abts溶液混合后的吸光值；ac为样品与水混合后的吸光值；ab为abts溶液与水混合后的吸光值。
[0096]
3)抗羟基自由基活性测定：在试管中依次加入9mmol/l feso4溶液200μl、9mmol/l水杨酸-乙醇溶液200μl，分别加入10、5、2.5、1、0.1、0.01mg/ml的活性次生代谢产物溶液70μl，用蒸馏水定容至470μl，以及30％的h2o2溶液200μl，静置30min，510nm波长处测定吸光度。
[0097]
根据吸光度值计算羟基自由基清除率，计算公式如下公式所示：清除率％＝(1-a
a-ac/ab)
×
100。
[0098]
其中，aa为样品与羟自由基的反应体系混合后的吸光值；ac为样品与水混合后的吸
光值；ab为羟自由基的反应体系与水混合后的吸光值。
[0099]
测得抗氧化能力如图7所示，其中图7a为dpph自由基清除能力结果图，图7b为abts自由基清除能力结果图；图7c为羟基自由基清除能力结果图。由图7可知，dpph自由基清除率最高可达45％左右，abts自由基清除率最高可达100％，羟基自由基清除率最高可达77％左右，dpph自由基清除能力、abts自由基清除能力、羟基自由基清除能力较好，说明副地衣芽孢杆菌t3具有较好的体外益生能力。
[0100]
实施例9副地衣芽孢杆菌t3的产淀粉酶活性能力测定
[0101]
(1)粗酶液的制备
[0102]
淀粉液体培养基：可溶性淀粉20g、酵母3g、蛋白胨3g、mgso4·
7h2o0.2g、k2hpo
4 1g、nacl 1g，调至ph 7。将菌株种子液以2％的接种量加入至液体发酵培养基中，37℃，200rpm条件下在摇瓶中震荡培养50ml(250ml)锥形瓶，取不同时间段的发酵液(0～72h)，离心8 000g，离心20min，取上清为粗酶液。
[0103]
(2)α-淀粉酶活性的测定
[0104]
①
取试管4支，注明两支为测定管。
[0105]
②
于每管中各加粗酶液1ml，在70℃恒温水浴中(水温度的变化不应超过
±
0.5℃)准确加热15min，在此期间β-淀粉酶受热而钝化，取出后迅速在自来水中冷却。
[0106]
③
在试管中各加入1ml ph 5.6柠檬酸缓冲液。
[0107]
④
向对照管中加入4ml 0.4n氢氧化钠，以钝化酶的活性。
[0108]
⑤
将测定管和对照管置40℃(
±
0.5℃)恒温水浴中保温15min，再向各管分别加入40℃下预热的淀粉溶液2ml，摇匀，立即放入40℃水浴中准确保温5min后取出，向各测定管迅速加入4ml 0.4n氢氧化钠，以终止酶的活动，然后准备下步糖的测定。
[0109]
(3)麦芽糖含量的测定
[0110]
①
取25ml刻度试管7个，编号，分别加入麦芽糖标准液(1mg/ml)0、0.2ml、0.6ml、1.0ml、1.4ml、1.8ml、2.0ml，置沸水浴中准确煮沸5min，取出冷却，用蒸馏水稀释至25ml，用分光光度计在520nm波长下进行比色，记录吸光度值，以吸光值为纵坐标，以麦芽糖含量为横坐标绘制标准曲线。
[0111]
②
样品的测定：取以上各管中酶作用后的溶液及对照管中的溶液各2ml，分别放入25ml具塞刻度试管中，再加入2ml 3，5-二硝基水杨酸试剂，混匀，置沸水中准确煮沸5min，取出冷却，用蒸馏水稀释至25ml，混匀。用分光光度计在520nm波长下进行比色，记录吸光值，从麦芽糖标准曲线中查出麦芽糖含量，然后进行结果计算。
[0112]
得到副地衣芽孢杆菌t3的产淀粉酶活性测定结果如图8所示，ck代表无亚硒酸钠添加，na2seo3代表添加有5mm的亚硒酸钠。由图8可知，添加亚硒酸钠后α-淀粉酶活性在48h后数值接近10u/ml，而在96小时后较高数值超过10u/ml；而相比于未添加亚硒酸钠的情况，α-淀粉酶活性发生了显著提高，说明添加5mm亚硒酸钠后菌株纳米硒的生成有助于提升α-淀粉酶活性。
[0113]
实施例10纳米硒的dls测定及sem扫描电镜分析
[0114]
dls测定：将分离纯化的纳米硒超声30s，以使硒颗粒在液体介质中分布均匀。通过动态光散射(dls)(马尔文粒度仪)的方法对senps的粒径进行测定，从样品中取出200μl加入到石英皿中，调节仪器参数，设置测定温度25℃、折射率1.33、吸收系数1.0，将装有样品
的石英皿放入仪器中，测定纳米硒颗粒的粒径，记录数据。
[0115]
测得结果见图9所示。
[0116]
sem扫描电镜分析：副地衣芽孢杆菌t3的种子液以1％接种量接入100ml lb液体培养基中，在180rpm转速和37℃条件下恒温振荡培养至生长对数期，加入50mm亚硒酸钠，培养6h，在10 000rpm转速下离心30min，取沉淀用生理盐水洗涤3次，加入电镜固定液进行sem扫描。测得结果见图10所示，由图10可知，副地衣芽孢杆菌t3制备的纳米硒在细菌细胞表面为球状分子，颗粒粒度大小均一、分散均匀，粒径在100～200nm之间。
[0117]
实施例11硒多糖的测定
[0118]
(1)粗胞外多糖的提取
[0119]
具体步骤如下：取10ml副地衣芽孢杆菌t3的发酵液，沸水浴10min，冷却到室温，在10 000rpm转速和4℃条件下离心15min，上清液取4.75ml加入80％质量分数的三氯乙酸50μl至终浓度4％(m/v)，震荡混匀后，4℃条件下静置6h，10 000rpm离心20min，取上清2ml至干净干燥的50ml离心管，加入3倍体积的无水乙醇，4℃条件下静置过夜，在10 000rpm转速和4℃条件下离心20min，去上清，沉淀用4ml去离子水复溶，装入透析袋(截留分子量8000-14000da)，去离子水4℃透析24h，中间换水3次，得到胞外多糖样品，胞外多糖产量用苯酚硫酸法测定。
[0120]
(2)葡萄糖标准曲线的建立
[0121]
具体步骤如下：准确称取制作标准曲线的葡萄糖100mg定容至100ml容量瓶；摇匀得到1mg/ml的葡萄糖溶液。再吸取5ml至50ml容量瓶中,定容摇匀后得到0.1mg/ml的葡萄糖标准溶液。取8支洗干净烘干的试管,分别吸取0.1mg/ml的葡萄糖标准溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7ml于每支试管中，每支试管再用去离子水补足至1ml。在各个试管中分别加入1ml 6％新制苯酚溶液，摇匀后迅速加入5ml浓硫酸，混匀后，室温下静置30min，在490nm波长下测定各试管中溶液的吸光度值，并以不同稀释液的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。葡萄糖标准曲线如图11所示。
[0122]
(3)样品葡萄糖含量的测定
[0123]
具体步骤如下：由上述步骤获得的粗胞外多糖样品，稀释适当的倍数，取1ml于每支试管中，再在各个试管中分别加入1ml 6％新制苯酚溶液，摇匀后迅速加入5ml浓硫酸，剧烈摇晃，室温下静置30min，在490nm波长下测定各试管中溶液的吸光度值。将吸光值代入葡萄糖标准曲线方程中计算胞外多糖产量。
[0124]
计算得到胞外多糖产量见表2，表2中0mm亚硒酸钠代表副地衣芽孢杆菌t3的发酵液在发酵时未添加亚硒酸钠；5mm亚硒酸钠代表副地衣芽孢杆菌t3的发酵液在发酵时添加有5mm浓度的亚硒酸钠(得到的粗胞外多糖即为硒多糖)。
[0125]
表2胞外多糖产量
[0126][0127]
用icp-ms测各胞外多糖含硒量，首先建立icp-ms法测定硒含量标准曲线，见于图12所示。根据图12标准曲线计算得到各胞外多糖中含硒量，并记载于表2。由表2可知，添加5mm浓度的亚硒酸钠后，胞外多糖的产量虽略有降低，但得到的硒多糖的硒含量高。
[0128]
实施例12硒多糖的抗氧化能力测定
[0129]
(1)供试品的制备
[0130]
取冻干之后的粗多糖、硒多糖粉末，超纯水溶解，配制为10mg/ml的样品母液。并将样品母液逐级稀释成质量浓度为15、30、75、150、745、1 045μg/ml的样品溶液备用。其中，粗多糖指代实施例9中副地衣芽孢杆菌t3的发酵液(未添加亚硒酸钠发酵)提取得到的胞外多糖，硒多糖指代实施例9中副地衣芽孢杆菌t3的发酵液(添加5mm亚硒酸钠发酵)提取得到的胞外多糖。
[0131]
(2)清除自由基能力测定
[0132]
dpph自由基清除率的检测：利用无水乙醇配制浓度为0.25mmol/l的dpph溶液。吸取dpph溶液600μl，加入不同浓度的粗多糖、硒多糖样品溶液70μl，于暗处反应30min，测定od
517nm
值。
[0133]
dpph自由基清除率：dc＝(1-(as-ac)/ab)*100％。
[0134]
其中，as，样品与dpph溶液混合后的吸光值；ac，样品与无水乙醇混合后的吸光值；ab，dpph溶液与水混合后的吸光值。
[0135]
abts自由基清除率的检测：配制7.4mol/l abts溶液以及2.6mmol/l过硫酸钾溶液，等比混合，室温避光反应12h，用无水乙醇溶液稀释至od
734nm
值为0.75，即为abts工作液。吸取abts工作液600μl，加入不同浓度的样品溶液70μl，于37℃恒温反应30min，测定od
734nm
值。
[0136]
阳离子自由基清除率：dc＝(1-(as-ac)/ab)*100％。
[0137]
其中，as，样品与abts工作液混合后的吸光值；ac，样品与水混合后的吸光值；ab，abts工作液与水混合后的吸光值。
[0138]
羟自由基清除率的检测：在试管中依次加入9mmol/l feso4溶液200μl、9mmol/l水杨酸-乙醇溶液200μl，不同浓度样品溶液70μl，再加入30％(体积分数)的h2o2溶液200μl，静置30min，测定od
510nm
值。
[0139]
羟自由基清除率：dc＝(1-(as-ac)/ab)*100％。
[0140]
其中，as，样品与羟自由基的反应体系混合后的吸光值；ac，样品与水混合后的吸光值；ab，羟自由基的反应体系与水混合后的吸光值。
[0141]
最终得到清除自由基能力测定结果见于图13所示，由图13可知，硒多糖的羟基自由基清除率、abts自由基清除率和dpph自由基清除率较高，尤其abts自由基清除率稳定在
20％以上，也就是说，该硒多糖具有较好的抗氧化能力；此外，相比于未添加亚硒酸钠得到的胞外多糖(也即粗多糖)，硒多糖的羟基自由基清除能力、abts自由基清除能力和dpph自由基清除能力总体上有所提升，尤其在大于745μg/ml的硒多糖浓度下，硒多糖的羟基自由基清除能力和dpph自由基清除能力显著提升。
[0142]
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。