酶催化合成手性氨基醇化合物

1.本发明属于生物催化领域，涉及利用生物催化剂亚胺还原酶催化α-羟基酮与小分子胺反应生成光学纯手性氨基醇化合物。


背景技术：

2.手性氨基醇化合物是一类应用极其广泛的化合物。近年来，随着人们对手性化合物研究的深入，手性氨基醇化合物的应用也有更多的研究。手性氨基醇做为手性助剂或手性配体，在各种不对称合成中起着重要的作用。除此之外，手性氨基醇经常存在于次级代谢产物和活性药物成分中，很多具有手性邻氨基醇结构的天然产物都有一定的生理活性，如麻黄碱从麻草中提取出来，主要用作感冒药和止咳药；bestatin是具有二肽结构的化合物，可以在临床上辅助癌症化疗；hapalosin是从绿蓝藻中提取的化合物，也是一种抗癌药物；sulfobacin b是一类含邻氨基醇的类脂化合物，具有抗血栓的作用；大多数治心律失常的药物也含有氨基醇结构，如索他洛尔、普萘洛尔、盐酸美西津和马来酸噻吗洛尔，它们都具有很好的临床效果；甲砜霉素、氯霉素和氟苯尼考是广谱抗生素，临床上广泛用于预防和治疗动物感染性疾病，它们也是含有氨基醇结构的化合物。
3.手性氨基醇化合物因其具有独特的生理活性而被广泛应用于药物的合成。目前报道的文献中，手性氨基醇化合物的合成主要有化学法和生物法。根据文献报道，化学合成手性氨基醇的方法主要有以下几种：通过还原氨基酸及其衍生物来合成，如利用lialh4还原氨基酸酯合成氨基醇化合物；通过采用醛或酮和亚胺或硝基物的偶合反应来合成，经典有机反应henry反应的一个例子是醛和硝基化合物在手性lewis酸的催化作用下可以得到顺式邻羟基硝基化合物，这类化合物再经还原可以得到氨基醇类化合物；通过环氧化合物的氨化开环来合成，这是制备邻氨基醇的一种常用方法，如环氧丙烷氨化制备异丙醇胺是很成熟的技术；通过氮杂环丙烷衍生物和含氧的亲核试剂开环反应也可以生成氨基醇化合物；此外，以α-氨基(硝基)羰基化合物、α-羟基亚胺衍生物原料也可以得到氨基醇化合物。生物法合成氨基醇化合物主要是通过酶催化反应。脂肪酶和酰化酶被用于催化合成光学纯的手性邻氨基醇化合物通过动力学拆分，但是产物得率最大只能到50％；ω-转氨酶被报道也可以催化合成手性邻氨基醇，但是存在得率低、副产物多等问题；ω-转氨酶和脱羧酶、转酮醇酶串联反应也可以得到手性氨基醇化合物；arnold研究团队报告了利用细胞色素c将烯烃转化生成氨基醇化合物的方法；最近，许建和课题组开发了一种利用胺脱氢酶合成手性邻氨基醇的新方法，合成一系列氨基醇化合物。与化学合成相比，生物催化具有反应条件温和、立体选择性好等优点，生物催化剂成为手性氨基醇化合物合成的一个有利工具。


技术实现要素：

4.本发明提供了可以产生10种不同亚胺还原酶的基因工程菌，以及利用这些菌体制备不同手性氨基醇化合物的方法(如化学方程式1)。
[0005][0006]
化学方程式1合成路线
[0007]
本发明所述的产亚胺还原酶的基因工程菌，来自于本实验室亚胺还原酶酶库，从酶库49种亚胺还原酶基因工程菌中筛选获得。产亚胺还原酶的基因工程菌的具体构建方法是：将亚胺还原酶的基因进行基因合成，构建到能表达外源基因的质粒载体中，然后转化到能表达外源基因的宿主菌中，并对基因工程菌进行发酵培养，实现了亚胺还原酶的异源表达。本发明提供的亚胺还原酶基因工程菌ir-27，ir-30，ir-36，r-38，ir-40，ir-44，ir-51，ir-54，ir-56，ir-57，对应的氨基酸序列分别为seq id no.1—no.10。
[0008]
在本发明中，任何一种人工的或者天然的含有碳源、氮源、无机和其他营养物质的介质，只要能满足宿主菌体的生长并且能表达出目的蛋白均可使用。培养方法和培养条件没有明确的限制，可以根据培养方法和类型等的不同而进行适当的选择，只要能够满足宿主的生长并且能产生相应的亚胺还原酶即可。
[0009]
用于制备手性氨基醇化合物的亚胺还原酶可以是上述亚胺还原酶基因工程菌的培养物，也可以是通过将培养基离心之后得到的菌体细胞或其加工制品。其中加工制品指的是菌体得到的提取物、破碎液或者是对提取物亚胺还原酶进行的分离和/或纯化的得到的分离产品。在本发明中用的最多的是将培养基离心之后得到的菌体细胞。
[0010]
本发明还涉及用全细胞催化不同类型的α-羟基酮底物转化生成对应的手性氨基醇的方法，所述方法为：
[0011]
将所述亚胺还原酶的基因工程菌经种子培养基培养，按一定的比例接入到发酵培养基中，培养一定时间后，加入诱导剂iptg培养一段时间，离心收集菌体。用ph 8.0的k2hpo
4-kh2po4缓冲液重悬菌体，向其中加入羟基酮底物10mmol/l，小分子胺40mmol/l，10％无水甲醇，葡萄糖40mmol/l，nadp

0.5mg/ml，gdh 3u/ml，用1mol/l naoh将反应体系调回到ph 8.0。25℃，200rpm下反应4-24h。反应之后，用1mol/l naoh或1mol/lna2co3将反应体系调碱，离心，萃取，除去有机溶剂之后成盐纯化产物。
[0012]
反应中所用的缓冲液是k2hpo
4-kh2po4缓冲液。
[0013]
本发明所述的ph值优选能够使亚胺还原酶表达活性、有利于还原胺化反应发生的范围，优选ph值为8.0-10.0。反应温度优选保持在亚胺还原酶可以表达其活性的温度范围内，优选25-30℃。
[0014]
本发明所述的底物浓度没有限制，通常底物浓度为5mmol/l-20mmol/l，考虑到底物转化率和产物得率，底物浓度最优选择10mmol/l。
[0015]
本发明所用的生物催化剂是全细胞，其用量为20-50g/l。
[0016]
本发明的有益效果：本发明选择了10种产亚胺还原酶基因工程菌，用于生物催化合成手性氨基醇化合物。所选的10种产亚胺还原酶基因工程菌底物谱比较广泛，对一系列α-羟基酮化合物普遍具有较好的催化活性。用产亚胺还原酶基因工程菌全细胞做催化剂，不同种类的α-羟基酮做底物，可以得到不同类型的光学纯手性氨基醇，而且底物转化率高，副产物少，制备方法简单方便、条件温和、立体选择性高。
附图说明
[0017]
图1 1-羟基-3-苯基-2-丙酮氢谱；
[0018]
图2 1-羟基-3-苯基-2-丙酮碳谱；
[0019]
图3 1-羟基-3-苯基-2-丙酮和环丙胺还原胺化反应r构型产物氢谱；
[0020]
图4 1-羟基-3-苯基-2-丙酮和环丙胺还原胺化反应r构型产物碳谱；
[0021]
图5 1-羟基-3-苯基-2-丙酮和环丙胺还原胺化反应s构型产物氢谱；
[0022]
图6 1-羟基-3-苯基-2-丙酮和环丙胺还原胺化反应s构型产物碳谱。
具体实施方式
[0023]
以下通过具体的实施例来进一步说明，其目的在于更好的理解发明内容，但是这些实施例不构成对本发明的限制。
[0024]
实施例1：亚胺还原酶基因工程菌的构建和诱导表达
[0025]
将亚胺还原酶基因由通用生物系统(安徽)有限公司合成，连接在pet28a载体上，然后转入大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，挑取单克隆即得到重组菌。挑选平板上单菌落接种到20ml含相应抗生素的lb培养基中，培养12h左右作为种子液，按照1％的接种量接种到700ml含相应抗生素的lb培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养至od
600
＝0.6-0.8左右，加入终浓度为0.1mmol/l的iptg于25℃进行诱导12h。以6000rpm离心培养液收集菌体。
[0026]
实施例2：α-羟基酮底物的合成
[0027]
200ml的无水乙醇做溶剂，加入500ml的烧瓶中，向其中加入2.8ml三乙胺(20mmol/l)，3.6g多聚甲醛(600mmol/l)，2.88g正丁醛(200mmol/l)或3.44g异戊醛(200mmol/l)或4.8g苯乙醛(200mmol/l)或5.36g苯丙醛(200mmol/l)或3.96g对溴苯乙醛(100mmol/l)或4.24g对溴苯丙醛(100mmol/l)，在2.88g噻唑盐(20mmol/l)催化作用下于60℃加热回流反应96h，反应过程中n2保护，得到α-羟基酮化合物1-羟基-2-戊酮或1-羟基-4-甲基-2-戊酮或1-羟基-3-苯基-2-丙酮或1-羟基-4-苯基-2-丁酮或1-羟基-3-(4-溴苯基)-2-丙酮或1-羟基-4-(4-溴苯基)-2-丁酮。将反应后体系中的溶剂除去，柱层析分离得到目标化合物，核磁鉴定目标化合物，最终得到α-羟基酮化合物的收率为20-55％。以1-羟基-3-苯基-2-丙酮为例，其核磁图谱如图1和图2。
[0028]
实施例3：亚胺还原酶基因工程菌全细胞催化1-羟基-3-苯基-2-丙酮和环丙胺发生还原胺化反应。
[0029]
分别称取0.05g的亚胺还原酶基因工程菌ir-27,ir-30,ir-36,ir-38,ir-40,ir-44,ir-51,ir-54,ir-56,ir-57，溶在900μl ph 8.0的k2hpo
4-kh2po4缓冲液中，向其中加入1.5mg 1-羟基-3-苯基-2-丙酮(10mmol/l)溶在100μl的无水甲醇中，加入10倍当量配制好的环丙胺(ph 8.0),0.5mg nadp

,3u gdh酶粉，7.2mg葡萄糖(40mmol/l)，混合均匀后，在200rpm，25℃条件下反应24h。反应之后，将反应体系用1mol/l na2co3调碱然后用乙酸乙酯萃取，溶剂挥干之后hplc检测。检测结果为：ir-27催化反应得到s构型产物，ee值为99％，ir-36,ir-38,ir-40,ir-44,ir-51,ir-54,ir-56,ir-57催化反应得到r构型产物，ee值为99％，99％，99％，99％，99％，99％，99％，99％。ir-27,ir-36,ir-38,ir-40,ir-44,ir-51,ir-54,ir-56,ir-57催化反应的底物转化率分别为70％，99％，99％，97％，98％，98％，51％，98％，98％。
[0030]
选择ir-27和ir-36的基因工程菌做100ml制备反应，称取2g亚胺还原酶基因工程菌，溶在90ml ph 8.0的k2hpo
4-kh2po4缓冲液中，向其中加入150mg 1-羟基-3-苯基-2-丙酮(10mmol/l)溶在10ml的无水甲醇中，加入4倍当量配制好的环丙胺(ph 8.0),50mg nadp

,3u/ml gdh酶粉，720mg葡萄糖(40mmol/l)，混合均匀后，在200rpm，25℃条件下反应4-24h。反应后向反应体系加1mol/l na2co3调节反应体系ph大于10，乙酸乙酯萃取，薄层层析色谱确认萃取干净，将溶剂旋干之后，用异丙醚或甲基叔丁基醚溶解收到的产物，向其中加入二氧六环氯化氢溶液，产物以盐酸盐形式析出。得到两种单一构型的氨基醇产物，其中s构型产物得率为68.6％，r构型产物得率为83.7％。r构型核磁图谱见图3，图4，s构型核磁图谱见图5，图6。其结构式如下：
[0031][0032]
实施例4：亚胺还原酶基因工程菌全细胞催化1-羟基-4-苯基-2-丁酮和环丙胺发生还原胺化反应。
[0033]
分别称取0.05g的亚胺还原酶基因工程菌ir-27,ir-30,ir-36,ir-38,ir-40,ir-44,ir-51,ir-54,ir-56,ir-57，溶在900μl ph 8.0的k2hpo
4-kh2po4缓冲液中，向其中加入1.64mg1-羟基-4-苯基-2-丁酮(10mmol/l)溶在100μl的无水甲醇中，加入10倍当量配制好的环丙胺(ph 8.0),0.5mg nadp

,3u gdh酶粉，7.2mg葡萄糖(40mmol/l)，混合均匀后，在200rpm，25℃条件下反应24h。反应之后，将反应体系用1mol/l na2co3调碱然后用乙酸乙酯萃取，溶剂挥干之后hplc检测。检测结果为：ir-27,ir-30催化反应得到s构型产物，ee值为99％，99％，ir-36,ir-38,ir-40,ir-44,ir-51,ir-54,ir-56,ir-57催化反应得到r构型产物，ee值为99％，99％，99％，99％，99％，99％，99％，99％。ir-27,ir-30,ir-36,ir-38,ir-40,ir-44,ir-51,ir-54,ir-56,ir-57催化反应的底物转化率分别为95％，99％，99％，99％，99％，99％，99％，99％，99％，99％。
[0034]
选择产ir-27和ir-36的基因工程菌做100ml制备反应，称取2g亚胺还原酶基因工程菌，溶在90ml ph 8.0的k2hpo
4-kh2po4缓冲液中，向其中加入164mg 1-羟基-4-苯基-2-丁酮(10mmol/l)溶在10ml的无水甲醇中，加入4倍当量配制好的环丙胺(ph 8.0),50mg nadp

,3u/ml gdh酶粉，720mg葡萄糖(40mmol/l)，混合均匀后，在200rpm，25℃条件下反应4-24h。反应后向反应体系加1mol/l na2co3调节反应体系ph大于10，乙酸乙酯萃取，薄层层析色谱确认萃取干净，将溶剂旋干之后，用异丙醚或甲基叔丁基醚溶解收到的产物，向其中加入二氧六环氯化氢溶液，产物以盐酸盐形式析出。得到两种单一构型的氨基醇产物，其中s构型产物得率为43.0％，r构型产物得率为71.3％。其结构式如下：
[0035][0036]
实施例5：亚胺还原酶基因工程菌全细胞催化1-羟基-3-((4-溴苯基))-2-丙酮和
环丙胺发生还原胺化反应。
[0037]
分别称取0.05g的亚胺还原酶基因工程菌ir-27,ir-30,ir-36,ir-38,ir-40,ir-44,ir-51,ir-54,ir-56,ir-57，溶在900μl ph 8.0的k2hpo
4-kh2po4缓冲中，向其中加入2.28mg 1-羟基-3-((4-溴苯基))-2-丙酮(10mmol/l)溶在100μl的无水甲醇中，加入10倍当量配制好的环丙胺(ph 8.0),0.5mg nadp

,3u gdh酶粉，7.2mg葡萄糖(40mmol/l)，混合均匀后，在200rpm，25℃条件下反应24h。反应之后，将反应体系用1mol/l na2co3调碱然后用乙酸乙酯萃取，溶剂挥干之后hplc检测。检测结果为：ir-30催化反应得到s构型产物，ee值为99％，ir-36,ir-38,ir-40,ir-44,ir-51,ir-54,ir-56,ir-57催化反应得到r构型产物，ee值为99％，99％，99％，99％，99％，96％，99％，99％。ir-30,ir-36,ir-38,ir-40,ir-44,ir-51,ir-54,ir-56,ir-57催化反应的底物转化率分别为70％，82％，99％，99％，97％，99％，99％，99％，99％。
[0038]
选择产ir-51的基因工程菌做50ml制备反应，称取1g亚胺还原酶基因工程菌，溶在45ml ph 8.0的k2hpo
4-kh2po4缓冲液中，向其中加入114mg 1-羟基-3-((4-溴苯基))-2-丙酮(10mmol/l)溶在5ml的无水甲醇中，加入4倍当量配制好的环丙胺(ph 8.0),25mg nadp

,3u/ml gdh酶粉，360mg葡萄糖(40mmol/l)，混合均匀后，在200rpm，25℃条件下反应12h。反应后向反应体系加1mol/l na2co3调节反应体系ph大于10，乙酸乙酯萃取，薄层层析色谱确认萃取干净，将溶剂旋干之后，用异丙醚或甲基叔丁基醚溶解收到的产物，向其中加入二氧六环氯化氢溶液，产物以盐酸盐形式析出。得到r构型的氨基醇产物，产物得率为65.9％。其结构式如下：
[0039][0040][0041]
实施例6：亚胺还原酶基因工程菌全细胞催化1-羟基-4-(4-溴苯基)-2-丁酮和环丙胺发生还原胺化反应。
[0042]
分别称取0.05g的亚胺还原酶基因工程菌ir-27,ir-30,ir-36,ir-38,ir-40,ir-44,ir-51,ir-54,ir-56,ir-57，溶在900μl ph 8.0的k2hpo
4-kh2po4缓冲中，向其中加入2.42mg 1-羟基-4-(4-溴苯基)-2-丁酮(10mmol/l)溶在100μl的无水甲醇中，加入10倍当量配制好的环丙胺(ph 8.0),0.5mg nadp

,3u gdh酶粉，7.2mg葡萄糖(40mmol/l)，混合均匀后，在200rpm，25℃条件下反应24h。反应之后，将反应体系用1mol/l na2co3调碱然后用乙酸乙酯萃取，溶剂挥干之后hplc检测。检测结果为：ir-30催化反应得到s构型产物，ee值为99％，ir-36,ir-38,ir-40,ir-44,ir-51,ir-54,ir-56,ir-57催化反应得到r构型产物，ee值为99％，99％，99％，99％，99％，93％，99％，99％。ir-30,ir-36,ir-38,ir-40,ir-44,ir-51,ir-54,ir-56,ir-57催化反应的底物转化率分别为66％，20％，99％，99％，98％，99％，99％，99％，99％。
[0043]
选择产ir-30、ir-51的基因工程菌做50ml制备反应，称取1g亚胺还原酶基因工程菌，溶在45ml ph 8.0的k2hpo
4-kh2po4缓冲液中，向其中加入121mg 1-羟基-4-(4-溴苯基)-2-丁酮(10mmol/l)溶在5ml的无水甲醇中，加入4倍当量配制好的环丙胺(ph 8.0),25mg nadp

,3u/ml gdh酶粉，360mg葡萄糖(40mmol/l)，混合均匀后，在200rpm，25℃条件下反应
12h。反应后向反应体系加1mol/l na2co3调节反应体系ph大于10，乙酸乙酯萃取，薄层层析色谱确认萃取干净，将溶剂旋干之后，用异丙醚或甲基叔丁基醚溶解收到的产物，向其中加入二氧六环氯化氢溶液，产物以盐酸盐形式析出。得到两种单一构型的氨基醇产物，其中s构型产物得率为41.0％，r构型产物得率为80.0％。其结构式如下：
[0044][0045]
实施例7：亚胺还原酶基因工程菌全细胞催化1-羟基-2-丁酮和环丙胺发生还原胺化反应。
[0046]
分别称取0.05g的亚胺还原酶基因工程菌ir-27,ir-30,ir-36,ir-38,ir-40,ir-44,ir-51,ir-54,ir-56,ir-57，溶在1ml ph 8.0的k2hpo
4-kh2po4缓冲中，向其中加入0.88mg1-羟基-2-丁酮(10mmol/l)，加入10倍当量配制好的环丙胺(ph 8.0),0.5mg nadp

,3u gdh酶粉，7.2mg葡萄糖(40mmol/l)，混合均匀后，在200rpm，25℃条件下反应24h。反应之后，将反应体系用1mol/l na2co3调碱，加入等量的氯甲酸苄酯，25℃衍生1h，然后用乙酸乙酯萃取，溶剂挥干之后hplc检测。检测结果为：ir-27,ir-36,ir-38,ir-40,ir-44,ir-51,ir-54,ir-56,ir-57催化反应的底物转化率分别为88％，99％，99％，99％，95.4％，95.3％，99％，99％，99％,ir-27,ir-36,ir-38,ir-40,ir-44,ir-51,ir-54,ir-56,ir-57催化反应生成产物的ee值分别为23s,99r,99r,57r,48r,99r,99r,99r,99r。
[0047]
选择产ir-36的基因工程菌做100ml制备反应，称取2g亚胺还原酶基因工程菌，溶在100ml ph 8.0的k2hpo
4-kh2po4缓冲液中，向其中加入88mg 1-羟基-2-丁酮(10mmol/l)，加入4倍当量配制好的环丙胺(ph 8.0),50mg nadp

,3u/ml gdh酶粉，720mg葡萄糖(40mmol/l)，混合均匀后，在200rpm，25℃条件下反应12h。反应后向反应体系加1mol/l na2co3调节反应体系ph大于10，乙酸乙酯萃取，薄层层析色谱确认萃取干净，将溶剂旋干之后，用异丙醚或甲基叔丁基醚溶解收到的产物，向其中加入二氧六环氯化氢溶液，产物以盐酸盐形式析出。得到r构型的氨基醇产物，产物得率为54.1％。其结构式如下：
[0048][0049]
实施例8：亚胺还原酶基因工程菌全细胞催化1-羟基-2-戊酮和环丙胺发生还原胺化反应。
[0050]
分别称取0.05g的亚胺还原酶基因工程菌ir-27,ir-30,ir-36,ir-38,ir-40,ir-44,ir-51,ir-54,ir-56,ir-57，溶在1ml ph 8.0的k2hpo
4-kh2po4缓冲中，向其中加入1.02mg1-羟基-2-戊酮(10mmol/l)，加入10倍当量配制好的环丙胺(ph 8.0),0.5mg nadp

,3u gdh酶粉，7.2mg葡萄糖(40mmol/l)，混合均匀后，在200rpm，25℃条件下反应24h。反应之后，将反应体系用1mol/l na2co3调碱，加入等量的氯甲酸苄酯，25℃衍生1h，然后用乙酸乙酯萃取，溶剂挥干之后hplc检测。检测结果为：ir-27,ir-36,ir-38,ir-40,ir-44,ir-51,
ir-54,ir-56,ir-57催化反应的底物转化率分别为97％，99％，99％，99％，99％，99％，99％，99％，99％,ir-27,ir-36,ir-38,ir-40,ir-44,ir-51,ir-54,ir-56,ir-57催化反应生成产物的ee值分别为33s,99r,99r,99r,58r,99r,99r,99r,99r[0051]
实施例9：亚胺还原酶基因工程菌全细胞催化1-羟基-4-甲基-2-戊酮和环丙胺发生还原胺化反应。
[0052]
分别称取0.05g的亚胺还原酶基因工程菌ir-27,ir-30,ir-36,ir-38,ir-40,ir-44,ir-51,ir-54,ir-56,ir-57，溶在1ml ph 8.0的k2hpo
4-kh2po4缓冲中，向其中加入1.16mg1-羟基-4-甲基-2-戊酮(10mmol/l)，加入10倍当量配制好的环丙胺(ph 8.0),0.5mg nadp

,3u gdh酶粉，7.2mg葡萄糖(40mmol/l)，混合均匀后，在200rpm，25℃条件下反应24h。反应之后，将反应体系用1mol/l na2co3调碱，加入等量的氯甲酸苄酯，25℃衍生1h，然后用乙酸乙酯萃取，溶剂挥干之后hplc检测。检测结果为：ir-27,ir-36,ir-38,ir-40,ir-44,ir-51,ir-54,ir-56,ir-57催化反应的底物转化率分别为17％，80.2％，59.2％，85.1％，69.4％，80.2％，81.9％，84.8％，87.4％,ir-27,ir-36,ir-38,ir-40,ir-44,ir-51,ir-54,ir-56,ir-57催化反应生成产物的ee值分别为99s,99r,99r,99r,7r,99r,99r,99r,99r。
[0053]
实施例10：亚胺还原酶基因工程菌全细胞催化1-羟基-3-苯基-2-丙酮和炔丙胺发生还原胺化反应。
[0054]
分别称取0.05g的亚胺还原酶基因工程菌ir-27,ir-30,ir-36,ir-38,ir-40,ir-44,ir-51,ir-54,ir-56,ir-57，溶在900μl ph 8.0的k2hpo
4-kh2po4缓冲中，向其中加入1.5mg 1-羟基-3-苯基-2-丙酮(10mmol/l)溶在100μl的无水甲醇中，加入10倍当量配制好的炔丙胺(ph 8.0),0.5mg nadp

,3u gdh酶粉，7.2mg葡萄糖(40mmol/l)，混合均匀后，在200rpm，25℃条件下反应24h。反应之后，将反应体系用1mol/l na2co3调碱然后用乙酸乙酯萃取，溶剂挥干之后hplc检测。检测结果为：ir-27,ir-30催化反应得到s构型产物，ee值为99％，ir-36,ir-38,ir-40,ir-44,ir-51,ir-54,ir-56,ir-57催化反应得到r构型产物，ee值为99％，99％，99％，99％，99％，99％，99％，99％。ir-27,ir-30,ir-36,ir-38,ir-40,ir-44,ir-51,ir-54,ir-56,ir-57催化反应的底物转化率分别为99％，85％，99％，99％，99％，99％，87％，58％，99％,99％。
[0055]
选择产ir-36的基因工程菌做100ml制备反应，称取2g亚胺还原酶基因工程菌，溶在90ml ph 8.0的k2hpo
4-kh2po4缓冲液中，向其中加入150mg 1-羟基-3-苯基-2-丙酮(10mmol/l)溶在10ml的无水甲醇中，加入4倍当量配制好的炔丙胺(ph 8.0),50mg nadp

,3u/ml gdh酶粉，720mg葡萄糖(40mmol/l)，混合均匀后，在200rpm，25℃条件下反应12h。反应后向反应体系加1mol/l na2co3调节反应体系ph大于10，乙酸乙酯萃取，薄层层析色谱确认萃取干净，将溶剂旋干之后，用异丙醚或甲基叔丁基醚溶解收到的产物，向其中加入二氧六环氯化氢溶液，产物以盐酸盐形式析出。得到r构型的氨基醇产物，产物得率为54.6％。其结构式如下：
[0056]
[0057]
实施例11：亚胺还原酶基因工程菌全细胞催化1-羟基-4-苯基-2-丁酮和炔丙胺发生还原胺化反应。
[0058]
分别称取0.05g的亚胺还原酶基因工程菌ir-27,ir-30,ir-36,ir-38,ir-40,ir-44,ir-51,ir-54,ir-56,ir-57，溶在900μl ph 8.0的k2hpo
4-kh2po4缓冲中，向其中加入1.64mg 1-羟基-4-苯基-2-丁酮(10mmol/l)溶在100μl的无水甲醇中，加入10倍当量配制好的炔丙胺(ph 8.0),0.5mg nadp

,3u gdh酶粉，7.2mg葡萄糖(40mmol/l)，混合均匀后，在200rpm，25℃条件下反应24h。反应之后，将反应体系用1mol/l na2co3调碱然后用乙酸乙酯萃取，溶剂挥干之后hplc检测。检测结果为：ir-27催化反应得到s构型产物，ee值为99％，ir-36,ir-38,ir-40,ir-44,ir-51,ir-54,ir-56,ir-57催化反应得到r构型产物，ee值为99％，99％，99％，99％，99％，99％，99％，99％。ir-27,ir-36,ir-38,ir-40,ir-44,ir-51,ir-54,ir-56,ir-57催化反应的底物转化率分别为83％，99％，99％，99％，88％，99％，47％，99％，30％。
[0059]
选择产ir-27和ir-36的基因工程菌分别做100ml制备反应，称取2g亚胺还原酶基因工程菌，溶在90ml ph 8.0的k2hpo
4-kh2po4缓冲液中，向其中加入164mg 1-羟基-4-苯基-2-丁酮(10mmol/l)溶在10ml的无水甲醇中，加入4倍当量配制好的炔丙胺(ph 8.0),50mg nadp

,3u/ml gdh酶粉，720mg葡萄糖(40mmol/l)，混合均匀后，在200rpm，25℃条件下反应12h。反应后向反应体系加1mol/l na2co3调节反应体系ph大于10，乙酸乙酯萃取，薄层层析色谱确认萃取干净，将溶剂旋干之后，用异丙醚或甲基叔丁基醚溶解收到的产物，向其中加入二氧六环氯化氢溶液，产物以盐酸盐形式析出。得到两种单一构型的的氨基醇产物，r构型产物得率为77.2％，s构型产物得率为54％。其结构式如下：
[0060][0061]
实施例12：亚胺还原酶基因工程菌全细胞催化1-羟基-3-苯基-2-丙酮和烯丙基胺盐酸盐发生还原胺化反应。
[0062]
选择产ir-36的基因工程菌做100ml制备反应，称取2g亚胺还原酶基因工程菌，溶在90ml ph 8.0的k2hpo
4-kh2po4缓冲液中，向其中加入150mg 1-羟基-3-苯基-2-丙酮(10mmol/l)溶在10ml的无水甲醇中，加入374mg烯丙基胺盐酸盐(40mmol/l),50mg nadp

,3u/ml gdh酶粉，720mg葡萄糖(40mmol/l)，混合均匀后，在200rpm，25℃条件下反应12h。反应后向反应体系加1mol/l na2co3调节反应体系ph大于10，乙酸乙酯萃取，薄层层析色谱确认萃取干净，将溶剂旋干之后，用异丙醚或甲基叔丁基醚溶解收到的产物，向其中加入二氧六环氯化氢溶液，产物以盐酸盐形式析出。得到r构型的氨基醇产物，产物ee值为99％，底物转化率为95％，产物得率为70.4％。其结构式如下：
[0063][0064]
实施例13：亚胺还原酶基因工程菌全细胞催化1-羟基-4-苯基-2-丁酮和烯丙基胺盐酸盐发生还原胺化反应。
[0065]
选择产ir-30,ir-36的基因工程菌分别做100ml制备反应，称取2g亚胺还原酶基因工程菌，溶在90ml ph 8.0的k2hpo
4-kh2po4缓冲液中，向其中加入164mg 1-羟基-3-苯基-2-丙酮(10mmol/l)溶在10ml的无水甲醇中，加入374mg烯丙基胺盐酸盐(40mmol/l),50mg nadp

,3u/ml gdh酶粉，720mg葡萄糖(40mmol/l)，混合均匀后，在200rpm，25℃条件下反应12h。反应后向反应体系加1mol/l na2co3调节反应体系ph大于10，乙酸乙酯萃取，薄层层析色谱确认萃取干净，将溶剂旋干之后，用异丙醚或甲基叔丁基醚溶解收到的产物，向其中加入二氧六环氯化氢溶液，产物以盐酸盐形式析出。ir-36催化得到r构型的氨基醇产物，产物ee值为99％，底物转化率为99％，产物得率为73.4％，ir-30催化得到s构型的氨基醇产物，产物ee值为99％，底物转化率为97％，产物得率为64.0％。其结构式如下：
[0066]