用于生产达托霉素的工程菌及其应用

1.本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及达托霉素产量得到提高的工程菌及其应用。


背景技术：

2.达托霉素(daptomycin)是由玫瑰孢链霉菌(streptomyces roseosporus)发酵产生的新一代环脂肽类抗生素。因达托霉素对耐万古霉素肠球菌(vre)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)和耐青霉素肺炎链球菌(prsp)等高致病革兰氏阳性耐药菌具有强力的杀伤效果，且不易和其它抗生素发生交叉耐药，因此具有重要的临床应用价值。
3.但目前达托霉素整体发酵水平较低、成本高。所以迫切需要提高达托霉素产量、降低生产成本的产业化方法。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术中存在的上述技术问题之一，本公开提供了一种用于生产达托霉素的菌株，及其制备方法和应用。
5.根据本公开的一个方面，提供了一种用于生产达托霉素的工程菌。根据一些实施方式，所述工程菌中的tetr家族转录调控因子的编码基因或影响其表达的基因中具有突变。根据一些实施方式，所述tetr家族转录调控因子的编码基因为ssig_rs25215基因。
6.根据一些实施方式，与野生型菌株相比，所述突变导致所述ssig_rs25215基因的表达降低或者失活。
7.根据一些实施方式，所述突变可以包括，在基因中缺失、插入或者置换了一个或多个碱基。
8.根据一些实施方式，所述突变为敲低突变。根据一些实施方式，所述突变为敲除突变。根据一些实施方式，所述突变可以指，通过部分或全部缺失、截短、移码或者插入突变来破坏基因。根据一些实施方式，所述突变可以通过大范围核酸酶(mgn)、锌指核酸酶(zfn)、类转录激活因子效应物核酸酶(talen)系统和/或cas/crisper系统来产生。根据一些实施方式，所述突变可以通过基因重组来产生。
9.根据一些实施方式，所述ssig_rs25215基因编码如seq id no.:1所示的氨基酸序列，或者与seq id no.:1所示的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列。根据一些实施方式，与seq id no.:1的氨基酸序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列，具有相同或相似的转录调控活性。
10.根据一些实施方式，所述工程菌中的ssig_rs25215基因或影响其表达的基因中具有突变。根据一些实施方式，所述工程菌中的ssig_rs25215基因的表达降低或者失活。根据一些实施方式，与野生型菌株相比，所述工程菌中的ssig_rs25215蛋白的表达降低了50％
以上，例如降低了50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或者100％。
11.根据一些实施方式，所述ssig_rs25215基因具有如seq id no.:2所示的核苷酸序列。
12.根据一些实施方式，所述工程菌属于链霉菌属(streptomyces sp.)。根据一些实施方式，所述工程菌为玫瑰孢链霉菌(streptomyces roseosporus)。
13.根据一些实施方式，所述工程菌中的ssig_rs25215基因缺失了从起始密码子起第109至598位的核苷酸。根据一些实施方式，所述工程菌中的ssig_rs25215基因缺失了seq id no.:2所示的核苷酸序列中的第109至598位的核苷酸。
14.根据另一方面，提供了一种制备本公开的工程菌的方法，所述方法包括采用基因工程的手段，失活或者降低链霉菌中的tetr家族转录调控因子编码基因的表达，得到所述工程菌。根据一些实施方式，所述tetr家族转录调控因子编码基因为ssig_rs25215基因。
15.根据一些实施方式，所述制备方法包括，通过部分或全部缺失、截短、移码或者插入突变，失活或者降低tetr家族转录调控因子编码基因的表达。根据一些实施方式，所述制备方法包括，通过大范围核酸酶、锌指核酸酶、类转录激活因子效应物核酸酶系统、cas/crisper系统和/或基因重组，失活或者降低tetr家族转录调控因子编码基因的表达。
16.根据具体的实施方式，所述方法包括通过基因重组，来失活或者降低tetr家族转录调控因子编码基因的表达。根据具体的实施方式，通过基因重组可以部分或全部缺失所述tetr家族转录调控因子编码基因。根据具体的实施方式，所述基因重组使用了含有链霉菌温度敏感型复制子的大肠杆菌-链霉菌穿梭载体，该载体在28℃～30℃可复制，在34℃不能复制。根据具体的实施方式，所述大肠杆菌-链霉菌穿梭载体选自pkc1139、pgm160、phz132或pcza185。
17.根据又一方面，提供了tetr家族转录调控因子在提高达托霉素生产中的应用。根据一些实施方式，所述tetr家族转录调控因子为ssig_rs25215蛋白。所述ssig_rs25215蛋白具有如seq id no.:1所示的氨基酸序列，或者与seq id no.:1所示的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
18.根据一些实施方式，通过降低所述tetr家族转录调控因子的表达，或者使所述tetr家族转录调控因子失活，来提高达托霉素的生产。根据一些实施方式，通过降低ssig_rs25215蛋白的表达，或者使ssig_rs25215蛋白失活，来提高达托霉素的生产。
19.根据又一方面，提供了本公开的工程菌在制备达托霉素中的应用。
20.根据又一方面，提供了一种生产达托霉素的方法，所述方法包括发酵培养本公开的工程菌，获得含达托霉素的发酵产物。根据一些实施方式，所述方法进一步包括从所述含达托霉素的发酵产物中，分离得到达托霉素。
21.本公开通过控制ssig_rs25215基因的表达水平，提高了链霉菌的达托霉素的产量。因此，本公开通过失活或减弱tetr家族转录调控因子的编码基因，特别是ssig_rs25215基因的表达，可以显著提高达托霉素的产量，降低达托霉素的生产成本，可以在实践中用于达托霉素的发酵生产。
附图说明
22.图1示出了ssig_rs25215基因缺失载体pd25215的质粒图谱。
23.图2示出了ssig_rs25215基因缺失载体pd25215与玫瑰孢链霉菌染色体的同源双交换的示意图。
24.图3示出了ssig_rs25215基因缺失突变株d25215的pcr验证结果。图3a示出了使用引物对out-f/out-r进行pcr的扩增结果。图3b示出了使用引物对in-f/in-r进行pcr的扩增结果。
25.图4示出了ssig_rs25215基因缺失突变株d25215的测序验证结果。
26.图5示出了玫瑰孢链霉菌野生型菌株nrrl11379及其ssig_rs25215基因缺失突变株d25215的达托霉素摇瓶发酵结果。
具体实施方式
27.为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于构成对本发明的任何限制。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。这样的结构和技术在许多出版物中也进行了描述。
28.除非另有定义，否则本发明使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。
29.除非上下文另有明确说明，否则本文所用的表述“一种”和“一个”包括复数指代。例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞及本领域技术人员可知晓的等同物等等。
30.本文所用的术语“约”表示其后的数值的
±
20％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的
±
10％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的
±
5％的范围。
31.本文所使用的术语“链霉菌”是一类高g c含量的革兰氏阳性细菌，常见于土壤中，也存在于水体、淤泥、空气、食品、以及动植物的体表和体内。链霉菌在进化过程中形成了复杂的形态分化机制和生理代谢途径，能够产生种类繁多的抗生素。链霉素抗生素的生物合成基因簇转录起始依赖于全局/多效和/或途径特异性调控蛋白(也称作簇内调控蛋白，cluster-situated regulator)的调控。
32.本文所使用的术语“达托霉素”是指自玫瑰孢链霉菌(streptomyces roseosporus)发酵液中提取得到的一种全新结构的环脂肽类抗生素。达托霉素的分子结构包含一个由10个氨基酸组成的肽环，环外的3个线性氨基酸连有一个正癸酰基侧链。达托霉素在体内外均可快速杀死耐药革兰氏阳性致病菌，其是以ca
2
依赖的方式靶向于革兰氏阳性菌细胞膜，形成膜孔，导致金属离子内流，使细胞膜去极化，同时还阻碍细菌细胞壁肽聚糖的生物合成，使细菌最终裂解死亡。
33.本文所使用的术语“tetr家族转录调控因子(tfr)”是最常见的原核转录调控因子之一，通常以同源二聚体的形式结合在靶dna上。每一单体都含有n端的dna结合结构域(dbd)和c端的小分子配体结合结构域(lbd)。n端dbd结构域的氨基酸序列相对保守，而c端lbd结构域的氨基酸组成差异比较大，暗示其可能结合的小分子配体的结构多样性。据报
道，tfr可作为正调控因子起作用，但大部分已经报道的tfr具有转录阻遏作用。tfr通过n端的dbd结构域与受调控基因上游的启动子区域结合，阻碍rna聚合酶-启动子转录复合物变成有效的转录状态，从而影响下游受调控基因的转录起始。trf在一些放线菌，例如链霉菌、诺卡氏菌和分枝杆菌中尤为丰富。
34.对于核酸或者氨基酸序列，本文所用的术语“序列同一性”是指，在以最大同一性百分比对准序列并在必要时引入缺口以实现最大同源性百分比后，候选序列中与已知氨基酸序列或者核酸序列具有相同的氨基酸残基或者核苷酸的百分比。对于氨基酸序列，不应将n末端或c末端插入或缺失解释为影响同源性，并且少于约65、少于约60、少于约50、少于约40、少于约30、少于约20或少于约10个氨基酸残基的氨基酸序列内部缺失和/或插入不应被解释为影响所比较的氨基酸(蛋白质)序列的同源性。对于核酸序列，5
′
末端或3
′
末端的插入或缺失不应被解释为影响同源性，并且少于约200、少于约180、少于约150、少于约120、少于约100、少于约90、少于约80、少于约70、少于约60、少于约50、少于约40或少于约30个核苷酸的核酸序列内部缺失和/或插入不应被解释为影响所比较的核酸序列的同源性。可以使用被定制用于序列相似性搜索的blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx程序使用的算法通过blast分析来确定核苷酸或氨基酸序列水平的同源性或同一性。
35.下面提供实施例和附图以帮助理解本发明。但应理解，这些实施例和附图仅用于说明本发明，但不构成任何限制。本发明的实际保护范围在权利要求书中进行阐述。应理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以进行任何修改和改变。
36.实施例1：ssig_rs25215基因缺失载体的构建
37.(1)玫瑰孢链霉菌ssig_rs25215基因上、下臂的克隆
38.根据ssig_rs25215基因的序列，设计了上臂的上游(up-1)和下游(down-1)的pcr引物，和下臂的上游(up-2)和下游(down-2)的pcr引物，具体如下表1所示。
39.表1.
[0040][0041]
以玫瑰孢链霉菌野生型菌株nrrl11379的基因组dna为模板，分别以引物对up-1/down-1和up-2/down-2进行pcr扩增。pcr反应条件：95℃，5min；(95℃，50s；60℃，50s；72℃，40s)
×
29个循环；72℃，10min；25℃，1min。以引物对up-1/down-1扩增出657bp的上臂片段，引物对up-2/down-2扩增出656bp的下臂片段。
[0042]
回收上述ssig_rs25215基因的上、下臂片段。
[0043]
(2)ssig_rs25215缺失载体的构建
[0044]
通过gibson组装方法，将上面获得的上臂片段和下臂片段连接于载体pkc1139(bierman m等，gene，1992，116(1):43-49)上，得到ssig_rs25215缺失载体pd25215。图1示出了载体pd25215的示意图。经测序验证，ssig_rs25215基因的上臂和下臂片段已经正确插入在载体中，且序列正确。
[0045]
实施例2：重组质粒的转化
[0046]
采用电击法或热激法，使用载体pd25215转化没有限制修饰作用的大肠杆菌et12567的感受态细胞，从转化子中提取获得非甲基化的质粒dna。用非甲基化的质粒dna转化玫瑰孢链霉菌的原生质体，可以显著提高转化效率。采用没有插入ssig_rs25215上臂和下臂片段的原始载体pkc1139作为对照。
[0047]
选用野生型玫瑰孢链霉菌菌株nrrl11379作为出发菌株，制备原生质体。用从大肠杆菌et12567中提取的质粒pd25215和pkc1139分别转化原生质体，涂于已吹干的不加抗生素的rm14平板上，28℃培养24小时后，在平板上涂1ml含30mg安普霉素的水溶液，在28℃继续培养5～7天，长出的菌落即为转化子。
[0048]
各挑取三个转化子，接种于含10μg/ml安普霉素的da1平板上，28℃培养7～10天恢复产孢。转化子经pcr扩增及测序验证正确。
[0049]
实施例3：ssig_rs25215基因缺失突变株的获得
[0050]
分别收集上述经验证含有质粒pd25215和对照质粒pkc1139的孢子，以每培养皿约100个孢子的浓度涂布于含有安普霉素的da1平板上，28℃培养48～72小时。当菌落直径约2mm左右(将形成气生菌丝时)时，将平板转移至39℃高温培养7天，含有pd25215的一些菌落出现扇形生长，而含有pkc1139的菌落在转移至39℃后不再生长。
[0051]
这是由于对照质粒pkc1139为温敏型的大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒，当温度高于34℃时不能自我复制，使得转化子在含有安普霉素的da1培养基上无法生长；而质粒pd25215可通过ssig_rs25215基因的上臂或下臂片段进行同源单交换而整合到染色体上，从而表达安普霉素抗性基因，使得单交换菌株能在含有安普霉素的da1培养基上生长。
[0052]
ssig_rs25215缺失载体pd25215与玫瑰孢链霉菌染色体发生同源双交换(参见图2)，则使玫瑰孢链霉菌的ssig_rs25215基因发生缺失突变。将上述筛选出的单交换突变株在不添加抗生素的da1平板上传代2～4次后，筛选出安普霉素敏感的双交换突变株，命名为玫瑰孢链霉菌菌株d25215。
[0053]
利用pcr，验证了筛选出的菌株d25215为ssig_rs25215缺失突变株。pcr验证引物的设计位置示于图2中，序列如下表2所示。
[0054]
表2.
[0055]
引物名称引物序列out-f5
′‑
gatgatcacctggacgag-3
′
(seq id no:7)out-r5
′‑
ggctccggcacgtatgtc-3
′
(seq id no:8)in-f5
′‑
ggacgcggccgggatctc-3
′
(seq id no:9)in-r5
′‑
ccgtgccaggtcctcctc-3
′
(seq id no:10)
[0056]
以玫瑰孢链霉菌野生型菌株nrrl11379以及突变株d25215的基因组dna为模板，分别以引物对out-f/out-r和in-f/in-r进行pcr扩增。pcr反应条件：95℃，5min；(95℃，50s；60℃，50s；72℃，40s)
×
29个循环；72℃，10min；25℃，1min。结果如图3所示。
[0057]
以nrrl11379的基因组dna为模板，利用引物对out-f/out-r可扩增出1889bp的片段，以突变株d25215的基因组dna为模板可扩增出1399bp的片段(图3a)；以nrrl11379的基因组dna为模板，利用引物对in-f/in-r可扩增出412bp的片段，以突变株d25215的基因组dna为模板无法扩增出相应大小的片段(图3b)。因此，图3a和3b的结果表明所获菌株d25215中的ssig_rs25215基因已通过同源重组发生缺失突变，为ssig_rs25215基因缺失突变株。
[0058]
进一步对ssig_rs25215缺失突变株d25215进行测序验证，测序结果示于图4中。从测序结果可以看到，与野生型菌株nrrl11379相比，突变株d25215中的ssig_rs25215基因从起始密码子起第109位核苷酸到终止密码子之间的490bp片段已经缺失。这一结果进一步证明了突变株d25215为ssig_rs25215基因缺失突变株。
[0059]
实施例4：达托霉素的发酵生产
[0060]
本实施例使用玫瑰孢链霉菌野生型菌株nrrl11379和ssig_rs25215缺失突变株d25215进行摇瓶发酵，并通过hplc分析发酵产物。
[0061]
种子培养基：糊精25g，胰酪胨大豆肉汤(tsb)培养基30g，加蒸馏水至1l，调ph至7.0。
[0062]
发酵培养基：糊精72g，酵母粉11g，葡萄糖11g，糖蜜7.2g，fe(nh4)2(so4)2·
6h2o 0.9g，加蒸馏水至1l，调ph至7.0。
[0063]
玫瑰孢链霉菌野生型菌株nrrl11379和ssig_rs25215缺失突变株d25215(挑选两个克隆)分别接种于种子培养基(装量为50ml/250ml三角瓶)中，28℃摇床培养60小时(转速250rpm)，按5％接种量接种于新的50ml种子培养基，28℃摇床培养36小时。按5％的接种量转接二级种子至发酵培养基，28℃摇床培养10天。从48小时开始，每隔12小时添加0.5ml 2％(w/v)的无菌癸酸溶液。10天后放瓶，发酵液经离心处理后，通过hplc法测定达托霉素的产量。
[0064]
简单来讲，取1.0ml发酵液，13000rpm，4℃离心15min，取上清至新的管中，再次离心，取上清液进样分析。hplc分析条件为：c
18
反相柱，柱长25cm，柱内径4.6mm，流动相为含0.1％三氟乙酸的水：含0.1％三氟乙酸的乙腈(55:45，v/v)，流速1.0ml/min，进样体积20μl，检测波长为218nm。分析结果如图5所示。
[0065]
从图5的结果可以看出，与野生型菌株nrrl11379相比，ssig_rs25215缺失突变株d25215的达托霉素产量均明显增加，提高了约31.1～33.7％。
[0066]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，做出的任何改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。