螺螨酯半抗原、抗原和抗体及其制备方法与应用

1.本发明涉及螺螨酯检测试剂的技术领域。


背景技术：

2.螺螨酯又称螨威多、螨危、季酮螨酯，英文通用名为spirodiclofen，是一种高效新型的非内吸性杀螨剂，纯品为白色粉状，无特殊气味，主要剂型包括24％、240克/升的悬浮剂和15％水乳剂，其化学名称为3-(2,4-二氯苯基)-2-氧代-1-氧杂螺[4,5]-癸-3-烯-4-基-2,2-二甲基丁酸酯，结构式如下：
[0003][0004]
螺螨酯具有全新的作用机理，具有触杀作用，无内吸性，可主要抑制螨的脂肪合成，阻断螨的能量代谢，对害螨的卵、幼螨、若螨具有良好的杀伤效果，具有抑制雌螨产卵孵化率的作用，其杀螨谱广、适应性强。此外，螺螨酯对红蜘蛛、黄蜘蛛、茶黄螨、朱砂叶螨和二斑叶螨等均有良好防效，对梨木虱、榆蛎盾蚧以及叶蝉等害虫有兼治效果，可用于柑橘、梨果、核果、葡萄、草莓、啤酒花和坚果等作物；与其他速效性杀螨剂(哒螨灵、克螨特、阿维菌素等)混用，可提高药效，同时也可降低害螨产生抗性的风险。
[0005]
但另一方面，部分现有研究认为螺螨酯是一类可能对人类有致癌作用的农药，而国内外对螺螨酯的研究主要集中于其原药及制剂分析和田间药效上，对其在作物上的残留降解研究较少。
[0006]
目前，螺螨酯在农产品中的残留检测方法主要是气相色谱法、液相色谱法和气相色谱-质谱联用法等，尽管仪器法检测灵敏度高、准确可靠，但对样品前处理过程要求较高，检测时间较长，所需仪器庞大昂贵，不适合大批量样品测定。


技术实现要素：

[0007]
针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种新的螺螨酯半抗原、抗原和抗体及其制备和应方法，基于该抗原进行的检测方法通过抗体、抗原之间的特异性结合实现对目标物螺螨酯的定量检测，具有高灵敏度和选择性，同时简单快速、成本低廉。
[0008]
本发明首先提供了一种螺螨酯半抗原，其具有式a1所示的结构式：
[0009][0010]
其中，
[0011]
r选自-(ch2)
m-或-x-(ch2)
a-，x选自芳香环、芳香杂环中的任一种；
[0012]
n选自0-6的整数，m选自0-6的整数，a选自0-6的整数；
[0013]
本发明进一步提供了一种螺螨酯抗原，其具有式a2所示的结构式：
[0014][0015]
其中，
[0016]
r选自-(ch2)
m-或-x-(ch2)
a-，x选自芳香环、芳香杂环中的任一种；
[0017]
n选自0-6的整数，m选自0-6的整数，a选自0-6的整数；
[0018]
protein表示载体蛋白。
[0019]
根据本发明的一些具体实施方式，所述载体蛋白选自牛血清蛋白、卵清蛋白和血蓝蛋白中的一种或多种。
[0020]
进一步的，如本发明的一些具体实施例的示例，根据以上半抗原化合物和/或抗原可对应得到螺螨酯抗体。
[0021]
本发明进一步提供了所述的螺螨酯半抗原或抗原的一种制备方法，其包括：
[0022]
将式b所示的化合物(3-(2,4-二氯苯基)-4-羟基-1-氧杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮)与式c所示的含有酯基的化合物在有机溶剂内进行混合反应，获得含有羧基的式d所示化合物，即式a1所示的半抗原。
[0023]
进一步的，所述制备方法还包括：
[0024]
将式d所示的化合物与n-羟基琥珀酰亚胺在二环己基碳二亚胺或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐存在的条件下进行第一偶联反应，获得式e所示化合物；
[0025]
将式e所示的化合物与载体蛋白进行第二偶联反应，得到所述螺螨酯抗原；
[0026]
其中：
[0027][0028]
y-(ch2)n-r-coo-(ch2)b-ch3[0029]c[0030][0031][0032]
其中，r选自-(ch2)
m-或-x-(ch2)
a-，x选自芳香环、芳香杂环中的任一种，y选自cl、br和i中的任一种，n选自0-6的整数，m选自0-6的整数，a选自1-6的整数，b选自0-6的整数。
[0033]
优选的，其中所述载体蛋白选自牛血清蛋白、卵清蛋白和血蓝蛋白中的一种或多种。
[0034]
该制备方法中，所述螺螨酯抗原为式e所示的化合物与载体蛋白通过酰胺键连接形成的偶联物，其中，酰胺键由式d所示的化合物上的羧基通过活泼酯与载体蛋白上的氨基形成。
[0035]
根据本发明的一些优选实施方式，所述式c所示的化合物选自氯甲酸甲酯、氯甲酸乙酯、氯乙酸乙酯、氯乙酸丁酯、氯丙酸甲酯、氯丁酸甲酯、氯丁酸乙酯、氯丁酸丙酯、溴乙酸甲酯、溴乙酸乙酯、溴乙酸丁酯、溴丁酸甲酯、溴丁酸乙酯、溴丁酸丁酯、碘乙酸乙酯、碘丁酸甲酯、碘丁酸乙酯、对氯苯甲酸甲酯、对氯苯乙酸乙酯、邻氯苯乙酸乙酯、间氯苯乙酸乙酯、对溴苯乙酸甲酯、对溴苯乙酸乙酯、对溴苯丙酸乙酯、对溴甲基苯甲酸甲酯、对溴甲基苯甲酸乙酯、间溴甲基苯甲酸甲酯、间溴苯甲酸甲酯、间溴苯甲酸乙酯、对碘苯甲酸甲酯、对碘苯甲酸乙酯、对碘苯乙酸乙酯、邻碘苯甲酸甲酯中的一种或多种。
[0036]
根据本发明的一些优选实施方式，所述有机溶剂选自吡啶、n,n-二甲基甲酰胺、二甲亚砜和四氢呋喃中的一种或多种。
[0037]
根据本发明的一些优选实施方式，所述式c所示的化合物与所述式b所示的化合物的摩尔比为(0.1-1):01。
[0038]
根据本发明的一些优选实施方式，所述式d所示的化合物与所述n-羟基琥珀酰亚胺及所述二环己基碳二亚胺的摩尔比为1：(1～5)：(1～5)。
[0039]
根据本发明的一些优选实施方式，所述式d所示的化合物与所述n-羟基琥珀酰亚胺及所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的摩尔比为1：(1～5)：(1～5)。
[0040]
根据本发明的一些优选实施方式，所述混合反应的温度为0～100℃和/或其反应的时间为6～48小时。
[0041]
根据本发明的一些优选实施方式，所述第一偶联反应的温度为0～50℃和/或其反应的时间为4～24小时。
[0042]
根据本发明的一些优选实施方式，所述式e所示的化合物与所述载体蛋白的摩尔比为(5～30)：1。
[0043]
根据本发明的一些优选实施方式，所述第二偶联反应的温度为0～50℃和/或其反应时间为8～36小时。
[0044]
根据本发明的一些优选实施方式，所述第二偶联反应在ph值为5～9的条件下进行。
[0045]
根据本发明的一些优选实施方式，所述第二偶联反应在所述载体蛋白的溶液中进行，所述载体蛋白的溶液由所述载体蛋白加入缓冲溶液中得到，所述缓冲溶液选自碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液和4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中的一种或多种。
[0046]
更优选的，所述缓冲液的ph值为4～10。
[0047]
根据本发明的一些优选实施方式，所述制备方法还包括：将进行所述第二偶联反应后得到的混合体系进行透析。
[0048]
更优选的，透析中所用的透析液为ph值为4～10和/或浓度为0.01～0.2mol/l的磷酸盐缓冲溶液。
[0049]
本发明进一步提供了上述半抗原和/或上述抗原和/或上述抗体和/或根据上述制备方法制备得到的抗原和/或抗体在螺螨酯检测上的应用。
[0050]
根据本发明的一些具体实施方式，所述检测包括酶联免疫试剂盒检测、发光免疫试剂盒检测、免疫亲和色谱柱检测中的一种或多种。
[0051]
根据本发明的一些具体实施方式，所述检测针对的检测样品可包括水体、药品、食品、农产品或土壤中的一种或多种。
[0052]
本发明的制备方法可方便、快捷地获得螺螨酯抗原，其合成步骤简洁明了，合成成本低，合成效果好。
[0053]
本发明的螺螨酯抗原进行免疫得到的螺螨酯抗体的特异性好、最低检测限值低。
[0054]
本发明的螺螨酯抗原和/或抗体在螺螨酯的快速免疫检测中灵敏度高、选择性强，具有广阔的应用前景。
附图说明
[0055]
图1为所述螺螨酯抗原的一种具体的合成路线示意图。
具体实施方式
[0056]
以下结合实施例和附图对本发明进行详细描述，但需要理解的是，所述实施例和附图仅用于对本发明进行示例性的描述，而并不能对本发明的保护范围构成任何限制。所有包含在本发明的发明宗旨范围内的合理的变换和组合均落入本发明的保护范围。
[0057]
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，其包括如：3-(2,4-二氯苯基)-4-羟基-1-氧杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮，4-溴丁酸乙酯，二环己基碳二亚胺(dcc)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edc)，n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂，牛血清白蛋白和卵清白蛋白，羊抗小鼠igg-hrp，单组分tmb显色液。
[0058]
实施例1螺螨酯-卵清白蛋白(螺螨酯-ova)抗原的制备
[0059]
通过如附图1所示的合成路线进行所述抗原的制备，具体包括：
[0060]
(1)式i所示化合物的合成
[0061]
在50ml三口瓶中加入0.5g 3-(2,4-二氯苯基)-4-羟基-1-氧杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮，加入40ml乙腈使其溶解，滴加入4-溴丁酸乙酯0.374g，加入无水碳酸钾0.44g，搅拌加热至100度，反应24小时，旋转蒸发干后，用乙酸乙酯(3
×
50ml)萃取，无水硫酸镁干燥。旋转脱溶，柱层析得到式i所示化合物，该化合物的1h-nmr、
13
c-nmr和质谱表征数据如下：
[0062]1h nmr(400mhz,dmso)δ7.72(s,1h),7.48(s,2h),4.03(q,2h),3.83(m,2h),2.29(t,2h),1.82(m,2h),1.76(m,10h),1.15(t,3h).
[0063]
13
c nmr(101mhz,dmso)δ178.35,172.50,170.39,135.86,134.76,134.61,129.10,129.08,127.75,98.37,83.06,71.89,60.39,33.52,32.81,30.08,24.32,21.95,21.93,14.51.
[0064]
esi-ms:m/z calcd for c
20h20
n3o4(m na

)449.09,found 449.00.
[0065]
其结构式如下：
[0066][0067]
(2)式ⅱ所示化合物的合成
[0068]
在50ml三口瓶中加入0.5g式i化合物，0.3g氢氧化锂，用20ml甲醇和5ml水溶解，室温下搅拌反应8h。反应完毕后，旋转蒸发去除甲醇，然后加入20ml水，用浓盐酸调节ph值为3，过滤后烘干得到式ⅱ所示化合物，该化合物的1h-nmr、
13
c-nmr和质谱表征数据如下：
[0069]1h nmr(400mhz,dmso)δ12.01(s,1h),7.71(s,1h),7.18(s,2h),3.81(m,2h),2.21(t,2h),1.87(m,2h),1.75(m,10h).
[0070]
13
c nmr(101mhz,dmso)δ178.40,174.03,170.41,135.87,134.75,134.58,129.11,129.09,127.73,98.29,83.08,72.00,33.54,32.83,30.15,24.59,24.30,21.96.
[0071]
esi-ms:m/z calcd for c
20h20
n3o4(m na

)421.06,found 421.00.
[0072]
其结构式如下：
[0073][0074]
(3)偶联反应
[0075]
称取步骤(2)得到的式ⅱ所示螺螨酯半抗原0.03mmol,nhs 0.045mmo,和dcc 0.033mmol用1ml无水dmf溶解，在室温25℃搅拌反应6小时后，将反应液在8000转下离心5分
钟，取上清液，得到式ⅲ所示化合物：
[0076][0077]
(4)将步骤(3)所得式ⅲ所示化合物缓慢滴加入载体蛋白ova溶液中，该载体蛋白溶液是由20mg ova溶于5ml ph值为7.4的磷酸盐(pbs)缓冲液混匀而得，且式ⅲ化合物与载体蛋白的投料摩尔比为20:1，在4℃搅拌过夜。
[0078]
(5)透析：将步骤(4)所得反应液用ph值为7.4、浓度为0.01mol/l的pbs溶液透析三天，将透析完全的反应产物溶液(螺螨酯-ova)稀释为1mg/ml的溶液，放于-40℃冻存待用。
[0079]
以上过程中，pbs溶液按照如下方法制备得到：将nacl、kh2po4和na2hpo4·
12h2o以质量比8.0：0.2：2.96的比例溶于水中，用水定容到1l。
[0080]
以上过程中，透析可去除未反应的螺螨酯半抗原和其它小分子，得到式
ⅳ‑
1所示螺螨酯与ova的偶联物，也即式a2所示螺螨酯抗原：
[0081][0082]
实施例2螺螨酯-卵清白蛋白(螺螨酯-ova)抗原的制备
[0083]
称取实施例1中步骤(1)得到的式ⅱ所示螺螨酯半抗原0.036mmol,nhs 0.047mmol,和edc 0.030mmol用1ml水溶解，在室温25℃搅拌反应6小时后，得到式ⅲ所示化合物，其后按与实施例1相同的步骤(4)～(5)，可得到如式
ⅳ‑
1所示螺螨酯与ova的偶联物，即式a2所示螺螨酯抗原。
[0084]
实施例3螺螨酯-血蓝蛋白(螺螨酯-klh)抗原的制备
[0085]
(1)按实施例1或2的过程合成式ⅱ所示螺螨酯半抗原及式ⅲ所示化合物。
[0086]
(2)将式ⅲ所示化合物缓慢滴加到载体蛋白溶液中，该载体蛋白溶液是由16.8mg klh溶于5ml ph值为7.4的磷酸盐缓冲液(pbs)缓冲液中混匀得到，其中，式ⅲ化合物与载体蛋白的投料摩尔比为800:1，在4℃搅拌过夜。
[0087]
(3)将步骤(2)所得反应液用ph值为7.4、浓度为0.01mol/l的pbs溶液透析三天，将透析完全的反应产物溶液(螺螨酯-klh)稀释为1mg/ml的溶液，置于-40℃冻存待用。
[0088]
以上过程中，pbs溶液按照如下方法制备得到：将nacl、kh2po4和na2hpo4·
12h2o以
质量比8.0：0.2：2.96的比例溶于水中，用水定容到1l。
[0089]
所得产物为式
ⅳ‑
2所示螺螨酯与klh的偶联物，即式a2所示螺螨酯抗原：
[0090][0091]
实施例4利用螺螨酯-血蓝蛋白(螺螨酯-klh)抗原制备抗体
[0092]
(1)取8-10周龄的bal b/c小白鼠作为实验动物。
[0093]
(2)基础免疫：由实施例3中得到稀释好的浓度为1mg/ml的螺螨酯-klh抗原溶液，经无菌过滤器过滤后加入等体积弗氏完全佐剂，用磁力搅拌器充分搅拌乳化，直到滴入水中不扩散；用乳化好的完全抗原采用腹腔及背部皮下多点注射bal b/c小鼠，注射剂量为0.1mg乳化抗原/只。
[0094]
(3)加强免疫：基础免疫2周后，取1ml上述稀释好的螺螨酯-bsa抗原溶液，然后加入1ml弗氏不完全佐剂，用磁力搅拌器充分搅拌乳化，直到滴入水中不扩散；将乳化好的抗原采用腹腔及背部皮下多点注射bal b/c小鼠，每只小鼠的注射剂量为0.1mg乳化稀释抗原(8周龄的bal b/c小鼠体重约23-25g)。
[0095]
加强免疫每隔15天免疫一次，从第三次加强免疫开始，每次免疫后第3-5天，从小鼠眼眶采血，测定抗体效价，包被原为1mg/ml螺螨酯-ova稀释500倍用，待效价大于1:8000后(效价定义为零孔显色值为1时，血清的稀释倍数)，眼球摘除采血，血液室温静置1小时后，再于4℃冰箱中静置2小时，然后于离心机中8000r/min离心5分钟后，分离出抗血清，即得到螺螨酯-klh抗体，用于下述各检测。
[0096]
实施例5抗体效果检测
[0097]
对实施例4所得抗原进行抗体抑制检测，所用缓冲液如下：
[0098]
包被缓冲液：0.05m、ph 9.6的碳酸盐缓冲液。
[0099]
磷酸盐缓冲液pbs(ph＝7.4)：称量4.0g nacl、0.1g kh2po4、1.48g na2hpo4·
12h2o用蒸馏水定容到500ml，浓度为0.01m、ph为7.4磷酸盐缓冲液。
[0100]
样品稀释液pbstg：由0.5ml吐温20、0.5g明胶和500ml浓度为0.1m、ph为7.4的pbs缓冲液混合得到。
[0101]
终止缓冲液：2.0m的硫酸水溶液。
[0102]
洗涤液：由nacl、kh2po4、na2hpo4·
12h2o、tween-20和水组成；nacl在洗涤液中的浓度为8.0g/l，kh2po4在洗涤液中的浓度为0.2g/l，na2hpo4·
12h2o在洗涤液中的浓度为2.96g/l，tween-20在洗涤液中体积百分含量为1:1000。
[0103]
检测过程包括：
[0104]
(1)螺螨酯-ova包被抗原溶液的配制
[0105]
将实施例1制备得到的稀释后的1mg/ml的螺螨酯-ova抗原完全解冻后，用包被缓冲液按1:500、1:1000、1:2000、1:4000进行梯度稀释，得到不同浓度的螺螨酯-ova的包被抗
原溶液。
[0106]
(2)螺螨酯标准品溶液的配制
[0107]
称取10mg螺螨酯标样，充分溶解于10ml无水甲醇中，即得到1.0mg/ml螺螨酯标准品溶液；用样品稀释液将所得1.0mg/ml螺螨酯标准品溶液配成浓度为1000ng/ml的螺螨酯标准品溶液。
[0108]
(3)螺螨酯-klh抗血清稀释液的配制
[0109]
将实施例4制得的螺螨酯-klh抗体用样品稀释液按1:500、1:1000、1:2000、1:4000进行梯度稀释，得到螺螨酯-klh抗血清稀释液。
[0110]
(4)抗原、抗体的棋盘格实验
[0111]
包被：在96孔酶标板中每孔加入100μl螺螨酯-ova包被抗原溶液，37℃包被3小时，用洗涤液洗涤4次。
[0112]
封闭：秤取5g脱脂奶粉，充分溶解于100ml样品稀释液中，即得到5％的封闭液，在96孔酶标板中每孔加入200μl封闭液，在37℃湿盒中封闭1h，弃封闭液，洗涤3次。
[0113]
竞争：零孔每孔加50μl样品稀释液，抑制孔每孔加入50μl螺螨酯标准品溶液。将螺螨酯-klh抗血清稀释液从1
×
103倍到8
×
103倍加入酶标板中(50μl/孔)，置湿盒中37℃条件下30min，洗板4次。
[0114]
加酶标二抗：将0.1mg/ml的羊抗鼠酶标二抗(igg-hrp，jackson公司，产品目录号为79556)稀释1000倍，稀释液是0.01m，ph为7.4的pbstg，每孔加100μl，置湿盒中37℃条件下30min，洗板4次。
[0115]
显色：将单组分tmb显色液加入酶标板中，每孔100μl，避光显色15min。
[0116]
终止：每孔加入50μl终止缓冲液，用酶标仪450nm处测定各孔的od值。
[0117]
结果如表1所示，其中，效价的定义为零孔od值为1时的血清稀释倍数：
[0118]
表1、抗螺螨酯小鼠的血清效价检测(单组分tmb显色液室温显色15min，1000ng标样抑制)
[0119][0120]
注：i表示酶标板中的抑制孔，c表示酶标板中的对照孔。
[0121]
结果说明上所得螺螨酯-klh可以作为免疫原制备出检测螺螨酯的抗体。
[0122]
本领域的普通技术人员将会意识到，这里所述的实施例是为了帮助读者理解本发明的实施方法，应被理解为本发明的保护范围并不局限于这样的特别陈述和实施例。本领域的普通技术人员可以根据本发明公开的这些技术启示做出各种不脱离本发明实质的其它各种具体变形和组合，这些变形和组合仍然在本发明的保护范围内。