一种Ngn3和Sox11的去甲基化用于胰岛β细胞再生的用途的制作方法

一种ngn3和sox11的去甲基化用于胰岛
β
细胞再生的用途
技术领域
1.本发明涉及糖尿病技术领域，具体而言，涉及一种ngn3和sox11的去甲基化用于胰岛β细胞再生的用途。


背景技术：

2.糖尿病是一组因胰岛素绝对或相对分泌不足和(或)胰岛素利用障碍引起的碳水化合物、蛋白质、脂肪代谢紊乱性疾病。糖尿病不可治愈且病情无法逆转，患者只能通过终生服药或注射相关药物以控制病情进展、预防严重威胁患者健康的并发症。糖尿病患者的主要患病类型为i型和ii型糖尿病，其中i型糖尿病患者占糖尿病总人数的5％，ii型糖尿病占糖尿病患病总人数的90％。i型糖尿病的发病原因主要为免疫系统(谷氨酸脱羧酶抗体、胰岛素抗体)攻击胰岛β细胞，使它们不再产生胰岛素；ii型糖尿病是一种随着胰岛β细胞功能的逐渐衰退而逐渐加重的进展性疾病，胰腺可以产生胰岛素，但身体不能有效地使用它。糖尿病患者的胰岛β细胞无法正常再生来逐步替代功能不足或被破坏的胰岛β细胞是糖尿病无法得到有效控制的主要原因，而dna甲基化是β细胞再生的关键障碍，dna甲基化使体内祖细胞处于休眠状态，从而使胰腺产生合成胰岛素的β细胞的能力降低。
3.因此，为了从根本上解决i型糖尿病和ii型糖尿病的问题，需要提供一种可以令胰岛β细胞再生的方法。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种ngn3和sox11的去甲基化用于胰岛β细胞再生的用途，此用途能够为以后医学上恢复胰岛β细胞产生胰岛素的功能带来技术启示，以便于后续将该激活过的胰岛细胞植入人体内，从而使该激活过的胰岛细胞激活人体内其他的胰岛细胞，从而促进患者体内的胰岛细胞分化为胰岛β细胞，以从根源上治疗糖尿病。
5.本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
6.本技术实施例提供一种ngn3和sox11的去甲基化用于胰岛β细胞再生的用途。根据目前现有的研究信息可以得知，ngn3基因主要与胰岛的形成、成熟胰岛细胞命运的维持起重要调控作用，但具体是如何作用的以及作用的原理还尚不明确，而目前已知在胰腺内分泌的发育过程中，pdx-1基因编码的pdx-1蛋白能够与ngn3基因上的启动子特异性结合，从而调控ngn3阳性细胞中ngn3基因的表达，而ngn3基因表达后能够编码ngn3蛋白，从而调控一系列的转录因子基因如nerurod1、insm1、islet-1等的表达，这些转录因子基因及其蛋白能够通过复杂的网络，调控胰腺内分泌发育和胰岛发育。而在这个过程中，观察到ngn3基因的dna片段被去甲基化，dna去甲基化作用是指在哺乳动物细胞中缺乏和减少细胞内的dna甲基转移酶含量会引起dna的去甲基化，它对于开启特异性基因的表达和重编程的起始具有重要作用，具体是指dna胞密啶的5位碳，因形成5-羟甲基胞嘧啶而失去甲基化，而ngn3基因在去甲基化后，能够进行再次转录，转录出的mrna推测能够被胰岛β细胞利用进而使胰岛β细胞获得重新合成胰岛素的功能。sox基因家族是近年来引起人们广泛关注的一个基因家
族，由其编码的蛋白是一类重要的转录调控因子，其共同特点是都包含一个约79个氨基酸的高度保守的hmg盒区，该结构域能够识别特异的dna位点，并在其他转录因子的相互作用下与dna结合，从而参与了性别决定、血细胞生成以及神经系统的发育等多种细胞发育过程，而sox11广泛表达于中枢神经系统和周围神经系统中，目前主要认为参与了神经系统的发育，而在胰岛β细胞的再生过程中，sox11基因表达量提高，且sox11基因也去甲基化，因此推断，sox11基因的去甲基化也与胰岛β细胞的再生有关。
7.相对于现有技术，本发明的实施例至少具有如下优点或有益效果：
8.本技术实施例提供了一种ngn3和sox11的去甲基化用于胰岛β细胞再生的用途，在胰岛α细胞向胰岛β细胞的转换过程中，ngn3基因和sox11基因的表达量提高，且二者大幅去甲基化，因此推断二者的去甲基化与胰岛β细胞的再生有关，为后续通过直接对ngn3基因和sox11基因去甲基化而使胰岛β细胞再生的技术提供了思维方向和启示，从而使后续被激活的胰岛细胞在导入到患者体内后能够激活患者体内原本的胰岛细胞，使患者体内原本的胰岛细胞重新具备分化为胰岛β细胞的能力，进而从根源上治愈患者的i型糖尿病和ii型糖尿病，大大减少i型糖尿病和ii型糖尿病治愈的痛苦。
附图说明
9.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
10.图1为本发明实施例的大鼠模型的dna甲基化含量柱状图；
11.图2为本发明实施例中三个模型小鼠的ngn3基因和sox11基因在去甲基化后转录形成mrna的表达水平；
12.图3为本发明实施例中三个模型小鼠体内的双加氧酶的含量；
13.图4为本发明实施例中，胰岛α细胞向胰岛β细胞转换的示意图；
14.图5位本发明实施例中ngn3基因的表达显色结果图。
具体实施方式
15.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
16.需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本发明。
17.本技术实施例提供一种ngn3和sox11的去甲基化用于胰岛β细胞再生的用途。根据目前现有的研究信息可以得知，ngn3基因主要与胰岛的形成、成熟胰岛细胞命运的维持起重要调控作用，但具体是如何作用的以及作用的原理还尚不明确，而目前已知在胰腺内分泌的发育过程中，pdx-1基因编码的pdx-1蛋白能够与ngn3基因上的启动子特异性结合，从而调控ngn3阳性细胞中ngn3基因的表达，而ngn3基因表达后能够编码ngn3蛋白，从而调控
一系列的转录因子基因如nerurod1、insm1、islet-1等的表达，这些转录因子基因及其蛋白能够通过复杂的网络，调控胰腺内分泌发育和胰岛发育。而在这个过程中，观察到ngn3基因的dna片段被去甲基化，dna去甲基化作用是指在哺乳动物细胞中缺乏和减少细胞内的dna甲基转移酶含量会引起dna的去甲基化，它对于开启特异性基因的表达和重编程的起始具有重要作用，具体是指dna胞密啶的5位碳，因形成5-羟甲基胞嘧啶而失去甲基化，而ngn3基因在去甲基化后，能够进行再次转录，转录出的mrna推测能够被胰岛β细胞利用进而使胰岛β细胞获得重新合成胰岛素的功能。sox基因家族是近年来引起人们广泛关注的一个基因家族，由其编码的蛋白是一类重要的转录调控因子，其共同特点是都包含一个约79个氨基酸的高度保守的hmg盒区，该结构域能够识别特异的dna位点，并在其他转录因子的相互作用下与dna结合，从而参与了性别决定、血细胞生成以及神经系统的发育等多种细胞发育过程，而sox11广泛表达于中枢神经系统和周围神经系统中，目前主要认为参与了神经系统的发育，而在胰岛β细胞的再生过程中，sox11基因表达量提高，且sox11基因也去甲基化，因此推断，sox11基因的去甲基化也与胰岛β细胞的再生有关。
18.在本发明的一些实施例中，上述用途还包括arx和pax4用于胰岛β细胞再生的用途。目前已经有研究表明，arx基因和pax4基因在胰岛α细胞和胰岛β细胞中均存在，其中arx基因为人类同源盒基因之一，位于人类x染色体的断臂(xp22.13)上，arx基因主要由五个外显子组成，其特殊结构包括高度保守的辛肽、同源盒、c端结构域、四个“polya”片段，arx基因主要表达在生发基质、室区、皮质层、尾状核、壳核、黑质、扣带回和海马的神经元前体中，而arx基因编码的arx蛋白主要参与调控gaba能神经元的迁移，包括神经节尾部的切线迁移和新皮质室下区的放射状区域，而arx基因编码的arx蛋白是决定α-/pp-和β-/δ-细胞的关键转录因子，以确定胰岛α细胞的表达。目前已经有研究证明pax4基因可促进大鼠和人类胰岛β细胞的增殖，经过pax4基因敲除后的小鼠体内的成熟胰岛β细胞缺乏，出生后发生糖尿病，经过进一步实验研究得出pax4基因突变或变异可引起蛋白功能缺陷，进而导致胰岛β细胞功能障碍。
19.在本发明的一些实施例中，上述pax4基因在胰岛α细胞中异位表达。自然状态下细胞内大多数基因表达都有组织特异性和诱导表达性，人为操纵外源基因的导入和表达称之为异位表达，通过人为操控使pax4基因在胰岛α细胞中异位表达，进而促使胰岛α细胞转化为胰岛β细胞。
20.在本发明的一些实施例中，上述胰岛α细胞缺失arx基因。而根据arx基因和pax4基因的功效可以推断，二者之间可能存在拮抗作用，即arx基因诱导胰岛α细胞的分化，而pax4基因则诱导胰岛β细胞的分化，当pax4基因大量表达而arx基因缺失时，会导致胰岛α细胞向胰岛β细胞的转化，从而生成更多本体生成的胰岛β细胞，便于针对于i型糖尿病患者和ii型糖尿病患者中的胰岛细胞转化为胰岛β细胞，以促使i型糖尿病和ii型糖尿病自愈，进而从根本上治疗这两种疾病。
21.在本发明的一些实施例中，上述胰岛α细胞由于pax4基因的异位表达或缺失arx基因而转化为胰岛β细胞。通过实验得出，pax4基因大量表达且arx基因缺失的胰岛α细胞会转变为胰岛β细胞。
22.在本发明的一些实施例中，上述胰岛α细胞转化为胰岛β细胞时，ngn3基因于导管上皮的祖细胞内再表达。由于此时ngn3基因于祖细胞内重新表达，ngn3基因脱甲基化，进而
使祖细胞被“唤醒”，从而使其分化为新的具有产生胰岛素的胰岛β细胞的能力，以促进胰岛β细胞再生。
23.在本发明的一些实施例中，上述ngn3基因诱导祖细胞的emt激活，祖细胞的emt激活后祖细胞与导管上皮分层并迁移。emt即间充质转化，祖细胞的emt激活后，祖细胞与导管上皮分层，因此祖细胞发生迁移，移动到胰腺部位，并且具备分化为胰岛β细胞的能力，以便于其进行分化。
24.在本发明的一些实施例中，分层并迁移后的祖细胞聚拢并形成朗格汉斯细胞，朗格汉斯细胞具有成为胰岛β细胞的能力。朗格汉斯细胞(又称兰氏细胞)是在皮肤和黏膜的树状细胞(抗原呈递细胞)，其中含有称作伯贝克颗粒的胞器，在上皮中的任何一层都有朗格汉斯细胞。朗格汉斯细胞(lc)来源于骨髓和脾脏，以后迁移到皮肤内，主要分布于表皮中上部，在表皮棘细胞之间，亦可见于真皮、口腔黏膜、食管、淋巴结、胸腺及脾脏等处。它有树枝样的突起伸向邻近表皮的角质形成细胞之间，上可以到达颗粒层，下可以至表皮和真皮交界的部位，其能够分泌胰岛素，进而根治ii型糖尿病。
25.在本发明的一些实施例中，上述导管上皮还包括上皮细胞，上皮细胞通过emt获得了由sox11基因介导的转移和扩散能力。上皮细胞经过与祖细胞的分离后具备了由sox11基因介导的转移和扩散能力，为后续的转移扩散、形成朗格汉斯细胞打下了基础。
26.在本发明的一些实施例中，上述ngn3和sox11的去甲基化与ngn3和sox11转录出的mrna的表达水平一致。通过观察mrna的表达水平以确定去甲基化后的ngn3和sox11基因在其中的表达水平，以证明去甲基化后的ngn3基因和sox11基因能够成功转录。
27.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
28.实施例1
29.请参照图1和图4，图1所示为本发明实施例中三个模型小鼠的dna甲基化含量柱状图，图4为本发明实施例中，胰岛α细胞向胰岛β细胞转换的示意图。
30.建立三个α细胞至β细胞转换的转基因小鼠模型，其中一个小鼠模型为arx ko模型(arx基因敲除模型)，另一个模型为pax4 oe模型(pax4基因激活模型)，最后一个模型为wt小鼠模型(野生小鼠模型)，其中arx ko模型和pax4 oe模型都通过直接谱系追踪实验建立起导管上皮细胞跨分化成胰岛β细胞和胰岛α细胞的个体。
31.其中对arx ko模型、pax4 oe模型和wt模型用等量的强力霉素治疗三个月，之后对每组模型中的小鼠体内的ngn3基因和sox11基因进行捕获和分析，所得结果如图1所示。根据图1结果所示，在arx ko模型组和pax4 oe模型组中，其dna的甲基化含量明显低于wt模型组，且在arx ko模型组中，ngn3基因和pax4基因的甲基化含量略高于pax4 oe模型组，因此可以得出，在arx ko模型组中，由于arx基因缺失，会导致胰岛细胞在分化时向胰岛α细胞分化的效率大大降低；而在pax4 oe模型组中，由于pax4基因的激活，会直接促使胰岛细胞向胰岛β细胞分化，从而从根本上更大程度的促进胰岛β细胞的增殖，从而理论上pax4 oe模型组的胰岛β细胞的分化效率要略高于arx ko模型组，而arx ko模型组的ngn3基因和sox11基因的dna甲基化含量与pax4 oe模型组的对比也符合该趋势，且其中**p《0.01，***p＜0.001，因此得出ngn3基因和sox11基因的去甲基化程度与胰岛β细胞的增殖直接相关。
32.实施例2
33.请参照图2，图2所示为本发明实施例中三个模型小鼠的ngn3基因和sox11基因在
去甲基化后转录形成mrna的表达水平。
34.去甲基化的ngn3基因和sox11基因由原本的dna片段转录为mrna，其中去甲基化的ngn3基因片段位于chr10染色体上，sox11基因位于chr12染色体上，观察这两条染色体的转录，并通过pcr检测转录所得到的mrna的含量，所得结果如图2所示，根据图2结果显示，wt模型组的小鼠的ngn3基因和sox11基因几乎未发生转录，mrna的表达含量较低，而arx ko模型组的小鼠中ngn3基因和sox11基因转录的mrna含量明显增加，pax4 oe模型组其mrna含量也明显增加，且增加幅度明显高于arx ko模型组，因此可以得出，mrna的表达水平与去甲基化的趋势基本相同，其中*p＜0.05，进一步推断出去甲基化的ngn3基因和sox11基因的mrna表达水平进一步反映了去甲基化的ngn3基因和sox11基因的去甲基化程度，从而更直观的突出了ngn3基因和sox11基因的去甲基化与胰岛β细胞的再生相关。
35.实施例3
36.请参照图3，图3所示为本发明实施例中三个模型小鼠体内的双加氧酶的含量。
37.通过ngn3基因和sox11基因到去甲基化的转化，从而对三组模型中小鼠体内的双加氧酶活性进行了测定。双加氧酶，即tet酶，其中tet酶主要包括tet1酶、tet2酶和tet3酶，tet1酶是一种具有cys-xaa-xaa-cys(cxxc)氨基酸序列结构域并能催化5mc的羟化酶。其n端拥有一个cxxc型锌指结构，靠近c端为一个催化中心，该催化中心包括3个亚铁离子和1个α-酮戊二酸结合位点，具有5mc羟化酶的活性，另外，其催化中心前还含有一段富含半胱氨酸的区域。其为cpg-dna结合蛋白，能够启动dna中的去甲基化程序，tet1酶能够与ngn3基因和sox11基因进行结合，对ngn3基因进行去甲基化。tet2酶主要有三个亚型，亚型i具有2002个氨基酸片段，亚型ii具有1194个氨基酸片段，亚型iii具有1162个氨基酸片段，其中亚型i为其主要形态，亚型i主要包括一个半胱氨酸富集区、一个双链β螺旋结构、三个亚铁离子结合位点和一个α-酮戊二酸结合位点，其主要功能催化区由半胱氨酸的富集区和双链β螺旋结构两部分组成，其能够催化甲基胞嘧啶形成羟甲基化的胞嘧啶，从而实现dna的去甲基化，而tet2酶主要与sox11基因和ngn3基因结合，从而实现dna的去甲基化。tet3酶也主要存在三种亚型，分别为tet3(fl)、tet3(o)和tet3(s)，其中tet3(fl)结构最复杂，由一个保守的c端催化域和一个n端调节域组成，c端的催化域由富含半胱氨酸(cys-rich)、双链β螺旋依赖的双加氧酶区(dsbh)及间隔区组成，称为cd催化结构域，cd结构域可以与dna上5mc结合并氧化成为5hmc；n端的调节域则由cxxc型锌指结构域组成，可以介导tet3(fl)优先识别和结合dna中富含cpg的区域。tet3(o)是由位于tet3(fl)起始密码子上游约5kb的另一种启动子转录表达的，n端缺失cxxc结构域，但替代的是含有11个氨基酸的小肽[16]，这个小肽的作用机制尚不明确。tet3(s)和tet3(fl)是由同一个启动子转录翻译形成，但其n端的cxxc结构域序列被作为内含子选择性剪切而被去除；tet3(s)的其他部分与tet3(fl)相同，与tet(o)相比少了11个氨基酸的小肽。研究发现tet3(s)和tet3(o)的氧化活性比tet3(fl)高，原因是cxxc结构域的优先识别能力使tet3(fl)在基因序列上的转移被限制，从而降低tet3(fl)对整体基因组的氧化活性。tet3(s)和tet3(o)没有cxxc结构域，因此没有对特定基因组序列的识别能力。tet3(fl)和tet3(s)在胚胎干细胞向神经元分化过程中表达水平显着上调，而tet3(o)仅特异性表达于卵母细胞，提示tet3的3种亚型也具有组织和阶段特异性，分布在不同组织细胞内可能发挥不同的调控作用，进一步推论得知本发明中出现的tet3酶的主要亚型为tet(fl)。因此ngn3基因和sox11基因在去甲基化的过程中，理论上
tet1酶、te2酶和tet3酶的活性会增加，而根据图3结果所示，arx ko模型组和pax4 oe模型组中的tet1酶、tet2酶和tet3酶的活性明显相比wt模型组的小鼠大幅度增加，从而符合去dna去甲基化的先决条件，从而可以推论该tet1酶、tet2酶和tet3酶的活性大幅度增加与ngn3基因和sox11基因的表达有关，通过ngn3基因和sox11基因的再表达能够转录形成tet1酶、tet2酶和tet3酶，从而再由这三种酶对ngn3基因和sox11基因进行去甲基化，最终实现胰岛β细胞的再生目的。
[0038]
实施例4
[0039]
取上述pax4 oe模型、arx ok模型和wt模型的小鼠的胰岛组织在4％的多聚甲醛中固定30min，固定温度为4℃，并嵌入石蜡和8mm的切片中。石蜡段用二甲苯分离三次，减少乙醇稀释(2
×
95％，80％稀释5min，80％稀释5min，60％稀释5min，30％稀释5min)，最后用ddh2o每次冲洗5min共冲洗两次。然后在pbs中洗涤三次，每次5min，并在pbs中的10％fcs中孵育1小时。然后，在潮湿的腔室中，用10％的fcs在4℃的温度下过夜，所得显色结果采用蔡司轴像成像仪处理，所得显色结果如图5所示，根据图5结果所示，ngn3基因在图中大幅度显色，因此可以得出ngn3基因在小鼠的胰岛组织中大幅度表达，符合本发明的推论。
[0040]
综上所述：
[0041]
本技术实施例提供了一种ngn3和sox11的去甲基化用于胰岛β细胞再生的用途，在胰岛α细胞向胰岛β细胞的转换过程中，ngn3基因和sox11基因的表达量提高，且二者大幅去甲基化，因此推断二者的去甲基化与胰岛β细胞的再生有关，为后续通过直接对ngn3基因和sox11基因去甲基化而使胰岛β细胞再生的技术提供了思维方向和启示，从而使后续被激活的胰岛细胞在导入到患者体内后能够激活患者体内原本的胰岛细胞，使患者体内原本的胰岛细胞重新具备分化为胰岛β细胞的能力，进而从根源上治愈患者的i型糖尿病和ii型糖尿病，大大减少i型和ii型糖尿病治愈的痛苦。以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。